一種用於細胞遷移研究的微納流控器件的製作方法

2023-06-07 00:49:36 1

一種用於細胞遷移研究的微納流控器件的製作方法
【專利摘要】一種用於細胞遷移研究的微納流控器件，主要包括：最底一層為玻璃基底，中間一層為底部有微流體通道的PDMS層，最上層為兩個玻璃圓柱體蓄液池。PDMS成型的微流體室被兩條水凝膠成型的納米多孔隔離柵分成三個獨立的區域——兩側邊的流體通道和中央細胞培養區。在兩側通道的入口處加入不同濃度的溶液，通過擴散可在中央細胞培養區形成一穩定的濃度梯度。器件還設計了兩條彎曲細長的通道和一個平衡區來平衡兩個側流體通道的壓力，以確保細胞培養區的濃度梯度的可重複性和穩定性。該器件結構簡單且可很容易地實現重新配置，通過調整水凝膠隔離柵的厚度，可以實現濃度梯度和其他一些影響細胞遷移的參數的控制以適應不同研究的需要。
【專利說明】一種用於細胞遷移研究的微納流控器件

【技術領域】
[0001]本發明屬於微流體領域，涉及一種用於細胞遷移研究的微納流控器件和形成所述流體器件的製造方法。

【背景技術】
[0002]細胞遷移是目前細胞生物學研究的一個重要課題，科學家們試圖通過對細胞遷移的研究，在阻止癌症轉移、異體植皮等醫學應用方面取得更大的成果。同時也因為細胞遷移獨有的運動特性，已成為當前生物學研究的熱門方向。有較多的試驗對細胞的遷移進行了研究，早期的研究器件可以分為Boyden小室，Zigmond室，唐恩室，和微量計等幾種結構。
[0003]但是，在這些器件中，細胞除了處於濃度梯度中，還暴露在因流動產生的剪應力中，這些剪切力會直接影響細胞的遷移。此外，由細胞分泌的大多數信號因素(自分泌/旁分泌)也會被衝走，這會對研究細胞遷移產生十分不利的影響。基於擴散的濃度梯度形成器件，他們的工作原理是利用隔離柵或者膜通過擴散形成並保持濃度梯度。因此它們能夠克服一些基於流動的梯度形成器件的局限，但它們也有自己的局限性:如他們僅能對非貼壁細胞(例如，胚胎，昆蟲細胞)或二維(2D)貼壁細胞培養而不能支持細胞外基質。在體內組織的功能中，細胞外基質的影響是至關重要的。針對這一問題，一些研究小組將三維(3D)材料整合到微流體器件中作為細胞基質的支撐結構，但這些設備往往是:1)由於其複雜的設計很難製造；2)無法提供可控的化學濃度梯度；或3)無法較長時間的保持濃度梯度。


【發明內容】

[0004]本發明的技術解決的問題是:為了克服上述限制，設計加工了一微流體器件，該器件將PEGDA凝膠嵌入作為半透隔離柵輔助濃度梯度的形成，可應用於細胞遷移的研究。該器件可提供可重複的，可控的，穩定的且可以較長時間穩定的濃度梯度。
[0005]本發明的解決方案:該微流體器件由三部分組成:最底一層為玻璃基底，中間一層為底部有微流體通道的PDMS層，最上層為兩個玻璃圓柱體，用來作為培養液的蓄液池。器件的主要結構為一 PDMS室，該室被兩條凝膠隔離柵間隔開來形成三個獨立的通道——兩邊的流體通道和中央細胞培養通道。當在兩側通道的入口處加入不同濃度的溶液時，溶液在重力驅動下會流進側通道。同過擴散的作用，在中央細胞培養區域形成一濃度梯度，可在該區域裝載和培養細胞。為了確保濃度梯度的可重複性和穩定性，設計了兩條彎曲的細長的通道和一個平衡區來平衡兩個側流動通道的壓力。通過調整水凝膠隔離柵的厚度，可以實現濃度梯度和其他一些影響細胞遷移的至關重要的參數的控制。
[0006]本發明原理:該器件的設計是基於PEGDA凝膠既是生物相容的，同時在複雜的環境中又不會被汙染。在該器件中PEGDA凝膠被用作為高流阻的多孔膜，它既可以幫助濃度梯度的快速形成，同時又可以限制因兩入口通道之間的壓力不平衡造成的流體的橫向流動。對於小分子，膜的阻力不影響其擴散輸運。在兩入口液池中加入不同濃度的溶液，在重力的驅動下，濃度不同的兩股流體會流入側通道。在擴散的作用下，在中央細胞培養區會形成一個濃度梯度。為了維持細胞培養區域的濃度梯度的穩定，則需要維持兩側通道Si和S2的壓力平衡。從理論上說，可以通過在兩入口的流體池中加入相同體積的溶液來解決，但實際上，這種方法在在微流體系統中是有問題的，液面的水平高度很難精確控制。表面張力的影響，也可能導致流體的流動。因此，在系統中加入了兩條細長的彎曲的側通道和一平衡區。我們知道兩側通道在接觸區的通流量是與兩流路間的壓力差成正比與流路的阻力成反比的(Q= ΛΡ/R)。彎曲的細長側通道，有助於增加系統的流體阻力(即隨著R的增加，則Q減小)從而控制因兩側通道壓力不平衡引起的流體的橫向流動。兩彎曲的側通道在接入細胞培養區前，先經由兩條細的橫向通道連接到同一個流體緩衝區。該細的橫向通道，可以允許流體的流通，在兩側通道壓力達到平衡時可以減少兩側通道間的擴散。當兩流體流經細長側通道區在平衡區相遇後，基本上以相同的壓力流經細胞培養區。在器件的製造過程中，因為表面效應，水凝膠與PDMS的壁面間總有空隙存在，不能夠貼合的非常好。為了解決這個問題，在結構設計的時候，在水凝膠與PDMS側壁接觸區設計了凹槽結構，這樣可以徹底解決端縫隙存在的問題。
[0007]本發明的優點:該微流體器件中流體的驅動採用重力來驅動，這樣可以實現器件操作簡單，且結構足夠緊湊可以放在培養皿中，這對細胞的研究是十分方便的。此外，該器件的結構設計可以很容易地實現重新配置，以適應不同的應用研究的需要。如濃度梯度可以通過改變中央細胞培養區寬度或隔離柵的厚度很容易地就可以實現:減少中央培養通道寬度或隔離柵的厚度，可以快速建立一陡峭的濃度梯度。利用此設備的靈活性，可以很簡單的實現不同的細胞遷移的檢測研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為微流體裝置示意圖。
[0009]圖2為水凝膠隔離柵製造過程的示意圖。
[0010]具體實施方法
[0011]為了在玻璃基底表面上形成水凝膠的微觀結構，對表面進行了處理來提高水凝膠的附著力。簡單來說就是表面用有機矽烷(organosilane)進行出理來產生拴系甲基丙烯酸甲酯組(tethered methacrylate groups)以在聚合過程中通過共價鍵與水凝膠鍵合。基底首先浸泡在濃度為30% w/v的雙氧水和濃硫酸，按照1: 4的比例混合的「piranha」溶液中來進行表面的清潔和羥基化(hydroxylate)基底表面。經過羥基化的表面，再浸泡在濃度為 ImM 的 3- (trichlorosilyl) propyl methacrylate (TPM, Sigma-Aldrich, St.Louis,MO)在庚燒(heptane) / 碳四氯化碳(carbon tetrachloride)比例為 80% /20% (V/V)的混合溶液中5分鐘，這樣可以在基底表面形成一緻密的S1-O-Si鍵的網絡表面結構和懸吊甲基丙烯酸甲酯(pendant methacrylate)。
[0012]微流體室是利用MEMS工藝製作而成。主要包括SU-8模具工藝和PDMS成型工藝。簡單來說就是獲取SU-8模具後，通過在模具上成型PDMS (固化體和預聚體的重量比為1: 10, Ellsworth Adhesives, Germantown, WI)獲得。脫氣後的 PDMS 層在 65°C 的條件下在模具上繼續固化2小時。固化後的PDMS層從它的模具上取下，並用不鏽鋼管打孔來作為流體池或者用來進行流體互聯。PDMS層通過空氣等離子體(Plasma cleaner Model PDC-32G,Harrick Plasma, Ithaca,NY)處理後與處理過的玻璃蓋玻片(VWR Vista Vis1n, Suwanee,GA)鍵合固定在一起,形成微流體室。最後把玻璃圓柱體(Fisher Scientific, Pittsburg,PA)粘固在進液口處形成蓄液池從而完成微流體器件的製作。
[0013]水凝膠隔離柵的製備根據可溶性因子的需要，水凝膠隔離柵的加工厚度可以在30-500 μ m之間變化。水凝膠隔離柵的最小厚度受水凝膠強度的限制而最大厚度受水凝膠中有效擴散度的限制。Michael等研究表明，細胞在水凝膠中在距離營養物質輸送通道為O到600 μ m的範圍內，能在72小時內保持較強的的生存力。水凝膠的製作過程簡單來說就是，首先對PDMS室的表面用光引發劑苯乙酮(photoinitiator acetophenone (2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone in n-vinylpyrrolidone, 300mg/mL, Sigma)進行處理，以提高表面自由基誘導的PEGDA預聚合物溶液在界面的聚合。過多的光引發劑先用純度為100%乙醇充分衝洗後再用和去離子水充分衝洗，最後用氮氣吹乾。然後將聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-diacrylate) (PEG_DA,MW 575, Sigma-Aldrich, PoIysciences, Warrington,PA)和濃度為 0.25% (ff/ff) Darocur 1173 (l-phenyl-2-hydroxy-2-methyl-l-propanone,Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY)混合形成凝膠預聚合物溶液注入到微流體室中，在注入的過程中，為了避免氣泡的產生，注入速度要十分緩慢。注入後，在曝光前為了避免預聚合溶液溢出，進出液口的流體池都用透明膠帶密封。然後用掩模將流體室從底部蓋住，用較長波長的UV燈(365nm，20mW/cm2)照射20秒鐘進行聚合，如附圖2 (f)所示。僅曝光區發生了自由基誘導凝膠化，形成不溶於PEG溶劑的結構。沒有凝膠化的預聚物溶液利用去離子水衝洗掉。在衝洗的過程中要控制衝洗液的速度，避免對水凝膠結構的破壞。器件製作的工藝流程如附圖2所示。
【權利要求】
1.一種用於細胞遷移研究的微納流控器件，其特徵在於:所述該微納流控器件由三部分組成:最底一層為玻璃基底(I)，中間一層為底部有微流體通道的PDMS層(2)，最上層為兩個玻璃圓柱體(3)，用來作為培養液的蓄液池；其中PDMS室(4)被兩條凝膠隔離柵(5)間隔開來形成三個獨立的通道——兩邊的流體通道(6)和中央細胞培養通道(7);當在兩側通道的入口處(3)加入不同濃度的溶液時，溶液在重力驅動下會流進側通道；同過擴散的作用，在中央細胞培養區域(7)形成一濃度梯度；為了確保濃度梯度的可重複性和穩定性，設計了兩條彎曲的細長的通道(8)和一個平衡區(9)來平衡兩個側流動通道的壓力；通過調整水凝膠隔離柵(5)的厚度，可以實現濃度梯度和其他一些影響細胞遷移的至關重要的參數的控制。
2.根據權利要求1所述的微納流控器件，其特徵在於:蓄液池(3)和PDMS室(4)通過彎曲細長通道⑶和平衡區(9)連通。
3.根據權利要求1所述的微納流控器件，其特徵在於:PDMS室(4)被兩條寬度可調的水凝膠隔離柵(5)隔離成三個區域。
【文檔編號】C12M3/00GK204079986SQ201420292360
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】葛豔豔, 安秋, 康敏, 楊和梅, 秦磊 申請人:南京農業大學