一種提高人睪丸精子檢出的溶液的製作方法

2023-06-06 22:45:11 2

本發明涉及一種精子檢出液，具體涉及一種提高人睪丸精子檢出的溶液。

背景技術：

在治療男性不育的過程中，由於精液中無精子或排出體外的精子質量不佳，通常會採用穿刺或切開睪丸獲取精子，通過單精子卵胞漿內注射技術達到體外受精輔助生育的目的。正常生理狀態下睪丸精子不具有自然運動能力，自睪丸中取出的不運動精子混雜於大量各種生精上皮細胞中,對於操作而言辨認難度較大，且不動精子無法直觀地通過顯微鏡下觀察來辨認其是否具有生命力。

技術實現要素：

針對上述現狀，本發明提供一種提高人睪丸精子檢出的溶液，該溶液能有效解決睪丸精子不運動而難以辨別其是否具有生命力的問題。

為了達到上述目的，本發明所採用的技術方案是提供一種提高人睪丸精子檢出的溶液，該溶液包括以下組分且其最終濃度為：氯化鈉90～110mmol/l、氯化鉀3.0～3.5mmol/l、硫酸鎂0.3～0.8mmol/l、氯化鈣1～5mmol/l、磷酸二氫鈉0.01～0.1mmol/l、乳酸鈉5～10mmol/l、碳酸氫鈉30～35mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸5～10mmol/l、丙酮酸鈉0.1～0.5mmol/l、己酮可可鹼5～10mmol/l、咖啡因1～5mmol/l，其餘為超純水。

進一步，該提高人睪丸精子檢出的溶液包括以下組分且其最終濃度為：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀3.2mmol/l、硫酸鎂0.5mmol/l、氯化鈣2.0mmol/l、磷酸二氫鈉0.053mmol/l、乳酸鈉10mmol/l、碳酸氫鈉30.9mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸10mmol/l、丙酮酸鈉0.25mmol/l、己酮可可鹼7.5mmol/l、咖啡因2.5mmol/l，其餘為超純水。

本發明的有益效果是：該溶液中的無機鹽組分全面模擬了細胞外液的生理環境，為精子提供了良好的生存環境；溶液中添加丙酮酸鈉，能夠有效抑制caspase-3而改善細胞凋亡，並增加穀胱甘肽/氧化型穀胱甘肽比率，提升細胞的抗氧化能力；溶液中的咖啡因不僅可以影響細胞中線粒體的能量代謝，而且還能夠刺激精子獲能及自發的頂體反應，從而提升精子的運動能力；溶液中添加的己酮可可鹼能夠有效激活並增加睪丸精子的活動能力，同時己酮可可鹼還可以抑制環腺苷酸的分解，而細胞內camp在激活精子運動中扮演著中心角色。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，溶液還包括1％wt的酚紅。

採用上述進一步技術方案的有益效果是：酚紅是一種很好的ph指示劑，ph不同時，酚紅顏色變化明顯。本發明溶液正常ph在7.4左右，此時酚紅呈粉紅色到橙紅色，當溶液顏色與此不符時，證明溶液已經變質酸化，不能繼續用於實驗，避免了溶液變質而帶來的風險。

進一步，溶液的ph值為7.2～7.4。

採用上述進一步技術方案的有益效果是：配置溶液的ph值與人體細胞液的ph值處於同一範圍，為離體的精子提供類似與人體的生存環境，更加有利於精子的運動。

具體實施方式

下面對本發明的具體實施方式做詳細的說明。

本發明的實施例中，提供了一種提高人睪丸精子檢出的溶液。本發明的目的是在體外培養採用穿刺或切開睪丸獲取的精子，因此所配置的溶液應當與人體細胞液的成分基本類似。為達到上述目的，先進行基礎溶液的配製，所述基礎溶液包括以下組分，而且每種組分在使用時的最終濃度如下：

氯化鈉90～110mmol/l、氯化鉀3.0～3.5mmol/l、硫酸鎂0.3～0.8mmol/l、氯化鈣1～5mmol/l、磷酸二氫鈉0.01～0.1mmol/l、乳酸鈉5～10mmol/l、碳酸氫鈉30～35mmol/l。

基礎溶液的配製是將稱取好的組分依次溶於超純水中，在溶解過程中不斷攪拌，使各個組分充分混合，需要特別注意的是，碳酸氫鈉最後溶解，以免在溶解攪拌過程中發生分解；上述組分溶解完成後，檢測溶液的ph值，如果溶液的ph不在7.2～7.4範圍內，則用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調節ph，直至ph滿足要求為止，此時溶液的生理環境與細胞液的生理環境基本類似；要長時間控制恆定的ph範圍，還需要向基礎溶液中添加緩衝劑，在本發明中，緩衝劑包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，它是一種氫離子緩衝劑，對細胞無毒副作用，與磷酸二氫鈉和乳酸鈉一同調節溶液ph值，能夠在較長時間內保持基礎溶液的ph值穩定，本緩衝劑的終濃度在5～10mmol/l的範圍內。

配置好的基礎溶液能夠為從睪丸中取出的精子提供良好的生存環境，但還不能解決精子不運動的問題，為了提高精子的活動能力，還需要在溶液中添加其他的組分。丙酮酸鈉能夠通過抑制caspase-3而改善細胞的凋亡，除此之外，丙酮酸鈉還可以增加細胞內穀胱甘肽/氧化型穀胱甘肽比率，具有改善細胞氧化還原狀態的作用，使細胞的抗氧化能力大大提高；添加的丙酮酸鈉的最終摩爾濃度為0.1～0.5mmol/l。除了添加丙酮酸鈉外，還向基礎溶液中添加了咖啡因，咖啡因是一種黃嘌呤生物鹼化合物，它可以作用於線粒體能量代謝導致精子運動能力的增加，同時還能刺激精子獲能及自發的頂體反應；添加的咖啡因的最終摩爾濃度為1～5mmol/l。細胞中的環磷酸腺苷(camp)在精子運動中扮演中心角色，細胞中環磷酸腺苷的濃度直接決定了精子運動能力的強弱；向溶液中添加己酮可可鹼，己酮可可鹼是一種非特異性磷酸二酯酶(pde)的抑制劑，它擁有抑制磷酸二酯酶活性的功效，能有效降低第二信使(camp或cgmp)的水解，提升細胞內camp或cgmp的濃度，從而改善精子的運動能力；添加的己酮可可鹼的最終摩爾濃度為5～10mmol/l。

最終成品溶液是採用以下方法製得的：

a.向基礎溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可鹼，在添加過程中緩慢攪拌，使上述幾種組分充分溶解到基礎溶液中。

b.溶解完成後，在超淨工作檯下採用孔徑為2.2μm的除菌過濾器對溶液進行過濾除菌，然後分裝4℃儲存。

為了隨時監控溶液的質量，避免溶液變質而帶來危險，向成品溶液中添加指示劑。由於成品溶液的ph偏鹼性，因此可以用ph指示劑。在現有的ph指示劑中，酚紅由於其性質穩定、變色靈敏而受到廣泛應用。當ph在7.2～7.4的範圍時，酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，ph小於6.8時為黃色，ph大於8.4時為紅色，顏色變化比較明顯；本發明溶液的ph在7.2～7.4的範圍內，溶液應當呈粉紅色到橙紅色，如果溶液的顏色明顯發生變化，則證明溶液的ph發生變化，溶液已經變質，不再適合繼續用於實驗，需要另行配置溶液。

下面的實施例只是用於詳細說明本發明，並不以任何方式限制發明的範圍。

臨床上罹患無精子症而需進行睪丸活檢的睪丸組織，即採用外科手段如穿刺或切開睪丸獲取睪丸組織，完成相關鏡檢觀察後分離細胞懸液用於以下實施例之測試。

(1)實施例一

首先配製基礎溶液，基礎溶液的組分及它們的最終濃度如下：氯化鈉90mmol/l、氯化鉀3mmol/l、硫酸鎂0.3mmol/l、氯化鈣1mmol/l、磷酸二氫鈉0.01mmol/l、乳酸鈉5mmol/l、碳酸氫鈉30mmol/l。上述組分溶解完成後，用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調節溶液ph至7.2，再向溶液中添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝劑，緩衝劑的最終濃度為5mmol/l。然後向溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可鹼，它們的最終濃度分別為丙酮酸鈉0.1mmol/l、咖啡因1mmol/l、己酮可可鹼5mmol/l。溶解完成後，向溶液中添加1％wt的酚紅，在超淨工作檯下採用孔徑為2.2μm的除菌過濾器對溶液進行過濾除菌，然後分裝4℃儲存。

將取得的精子置於配製好的溶液中，在37℃下孵育5分鐘，顯微鏡下觀察辨識並挑選活動的精子。

本實施方式精子的檢出結果如下：

(2)實施例二

首先配製基礎溶液，基礎溶液的組分及它們的最終濃度如下：氯化鈉110mmol/l、氯化鉀3.5mmol/l、硫酸鎂0.8mmol/l、氯化鈣5mmol/l、磷酸二氫鈉0.1mmol/l、乳酸鈉10mmol/l、碳酸氫鈉35mmol/l。上述組分溶解完成後，用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調節溶液ph至7.2，再向溶液中添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝劑，緩衝劑的最終濃度為10mmol/l。然後向溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可鹼，它們的最終濃度分別為丙酮酸鈉0.5mmol/l、咖啡因5mmol/l、己酮可可鹼10mmol/l。溶解完成後，向溶液中添加1％wt的酚紅，在超淨工作檯下採用孔徑為2.2μm的除菌過濾器對溶液進行過濾除菌，然後分裝4℃儲存。

將取得的精子置於配製好的溶液中，在37℃下孵育5分鐘，顯微鏡下觀察辨識並挑選活動的精子。

本實施方式精子的檢出結果如下：

(3)實施例三

首先配製基礎溶液，基礎溶液的組分及它們的最終濃度如下：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀3.2mmol/l、硫酸鎂0.5mmol/l、氯化鈣2.0mmol/l、磷酸二氫鈉0.053mmol/l、乳酸鈉10mmol/l、碳酸氫鈉30.9mmol/l。上述組分溶解完成後，用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調節溶液ph至7.2，再向溶液中添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝劑，緩衝劑的最終濃度為8mmol/l。然後向溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可鹼，它們的最終濃度分別為丙酮酸鈉0.25mmol/l、咖啡因2.5mmol/l、己酮可可鹼7.5mmol/l。溶解完成後，向溶液中添加1％wt的酚紅，在超淨工作檯下採用孔徑為2.2μm的除菌過濾器對溶液進行過濾除菌，然後分裝4℃儲存。

將取得的精子置於配製好的溶液中，在37℃下孵育5分鐘，顯微鏡下觀察辨識並挑選活動的精子。

本實施方式精子的檢出結果如下：

(4)實施例四