一種貴金屬納米顆粒‑金屬有機框架螢光探針分子及其製備方法和應用與流程
2023-06-06 22:23:21
本發明涉及一種貴金屬納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子及其製備方法和應用，屬於生物分析檢測技術領域。
背景技術：
生物巰基分子例如半胱氨酸、胱氨酸和穀胱甘肽在人類的生理過程中發揮著重要的作用。其中，穀胱甘肽是細胞內含量最豐富(0.5～10mmol/l)的巰基化合物,它是由穀氨酸、甘氨酸以及半胱氨酸組成的三肽,能夠維持細胞內的氧化還原平衡，對過氧化氫、汞和鉛等重金屬有解毒作用。細胞內的半胱氨酸濃度為50～200μmol/l,濃度遠低於穀胱甘肽。研究表明，多種疾病都與細胞內穀胱甘肽含量的異常相關，如癌症、心血管疾病和愛滋病等。因此，定量檢測細胞內穀胱甘肽對疾病的診斷及治療具有重要的意義。目前，檢測gsh的方法主要有液相色譜法、毛細管電泳、表面增強拉曼光譜、電化學方法、螢光法和比色法等，其中液相色譜、毛細管電泳和表面增強拉曼光譜等方法需使用昂貴的儀器。與其它方法相比，螢光分析法具有操作簡便、靈敏度高及能夠可視化觀察等優點，能將微觀上分子識別過程轉化為宏觀上螢光信號的變化，從而實現對靶標的檢測。
金屬有機框架是近十年來迅猛發展的一種配位聚合物，其通常具有三維的孔結構，即以金屬離子為中心原子，一種或者多種有機配體為支撐構成空間三維的延伸，這使得它成為沸石分子篩、大孔樹脂以及碳材料之外的又一類新型的重要多孔材料，在催化、儲能和分離中都有廣泛應用。金屬中心離子在骨架中既可以作為結點提供骨架的中樞，同時還能夠拓展網絡結構在中樞中形成無限的分支，從而提供金屬有機框架獨特的物理化學性質(如多孔性和手性等)。這類材料的比表面積遠大於相似孔道的沸石材料，而且能夠在移除孔道中的殘存的溶劑小分子後仍然保持骨架結構的不被破壞。因此，金屬有機框架具有許多特殊性能亟需開發。
技術實現要素：
發明目的：針對現有穀胱甘肽檢測方法的不足和存在的問題，本發明發現和提出一種具有良好的選擇性的螢光探針，對穀胱甘肽進行快速簡便的定量檢測；並且提供該螢光探針在檢測穀胱甘肽中的應用。
技術方案：本發明公開了一種選擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子，所述螢光探針分子是以金屬有機框架為基體，負載貴金屬納米顆粒所形成，其能夠選擇性識別穀胱甘肽。
優選，所述金屬有機框架為nh2-mil-53或nh2-uio-66。
優選，所述貴金屬納米顆粒為金納米顆粒、銀納米顆粒或者鉑納米顆粒。
優選，所述貴金屬納米顆粒的尺寸為3至15納米。
優選，所述螢光探針分子螢光激發波長在343nm或者488nm，發射波長在435或者517nm，且不會根據激發波長的變化而改變。
本發明還提供了所述的螢光探針分子的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟：
首先，利用基體化合物和2-氨基對苯二甲酸，高壓反應製備金屬有機框架，然後將其分散於甲醇中，加入貴金屬化合物溶液，最後再加入硼氫化鈉水溶液反應後，即得所述螢光探針分子。
所述基體化合物為四氯化鋯、四氯化鈦或氯化鋁；所述貴金屬化合物為氯金酸、硝酸銀或者氯鉑酸。
本發明最後還提供了所述的螢光探針分子在選擇性識別穀胱甘肽和/或檢測穀胱甘肽濃度中的應用。
本發明通過調節金屬有機框架的種類以及負載的貴金屬納米顆粒的尺寸可以精確地調節螢光探針對穀胱甘肽的檢測線性範圍，從而為細胞內的穀胱甘肽檢測奠定良好的基礎。進一步我們也發現，該貴金屬納米顆粒-金屬有機框架螢光探針具有良好的生物相容性、選擇性以及較低的檢測限。
本發明貴金屬納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子具有以下優勢：
第一、本發明擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子分散性好，螢光穩定，能夠良好地選擇性識別穀胱甘肽。
第二、本發明選擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子，通過調節金屬中心(如鋁、鋯)以及配體的種類可以得到不同的激發、發射波長。
第三、本發明選擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子，對穀胱甘肽具有很好的選擇性，半胱氨酸、精氨酸、穀氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等胺基酸對檢測幹擾很小。
第四、本發明選擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子，對穀胱甘肽的檢測可以達到納摩爾每升級。
第五、本發明選擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子，生物相容性好、細胞毒性低，可用於細胞內穀胱甘肽濃度變化的檢測。
第六、本發明選擇性檢測穀胱甘肽的貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子，通過調節金顆粒的種類和金屬有機框架的粒徑，可以有效地調節其檢測的線性範圍，為細胞內穀胱甘肽的定量檢測奠定基礎。
本發明中的金屬-金屬有機框架螢光探針分子的具體特徵如下：
該貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子對穀胱甘肽具有選擇性，只有穀胱甘肽可以明顯增強貴金屬-金屬有機框架螢光探針分子的螢光強度；檢測的線性範圍可以通過改變貴金屬納米顆粒的尺寸和金屬有機框架的種類得到精準的調節。通過連接螢光團，該貴金屬-金屬有機框架探針分子具有不同的激發和發射波長，具有光穩定性。其他胺基酸如半胱氨酸、精氨酸、穀氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等胺基酸對檢測幹擾很小；螢光探針分子對穀胱甘肽的檢測可以達到納摩爾級。
技術效果：相對於現有技術，本發明螢光探針分子與穀胱甘肽的結合絡合能力高，絡合後螢光明顯增強。細胞毒性實驗結果表明該探針對細胞幾乎沒有毒性，生物相容性和細胞滲透性好，並且方法應用簡便易行、快速，直觀，毒性低、靈敏度高、方法簡單，為穀胱甘肽的檢測提供了高效可行的方法。
附圖說明：
圖1是本發明的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子x射線衍射，掃描電子顯微鏡，傅立葉變換紅外以及螢光光譜圖。
圖2是本發明的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子在連接了異硫氰酸螢光素之後的紫外可見漫反射，傅立葉變換紅外以及螢光光譜圖。
圖3是本發明的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子的螢光強度和穀胱甘肽濃度的關係。橫坐標為穀胱甘肽的濃度，縱坐標為螢光強度。a，b，c中所負載的貴金屬納米顆粒的大小分別為15，6，3nm。從上到下的線條分別對應6％(正方形)，3％(圓形)，2％(上三角)，1％(倒三角)金負載量的探針在使用濃度為50μg/ml，150μg/ml，250μg/ml下的螢光相應。
圖4是本發明的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子與各種胺基酸作用後的螢光強度。光譜結果明顯表明，只有穀胱甘肽明顯增強貴金屬-金屬有機框架探針分子的螢光，其他胺基酸如半胱氨酸、精氨酸、穀氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等胺基酸對檢測幹擾很小。
圖5是本發明的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子對細胞的毒性。橫坐標是加入的貴金屬-金屬有機框架探針分子的濃度，縱坐標是細胞存活率。
圖6是本發明的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子用於細胞內穀胱甘肽檢測。圖6a是明場下的hela細胞；圖6b是在加入螢光探針分子後的細胞內螢光成像圖，細胞呈現出很強的螢光。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。而本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體試驗結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發明。
實施例1
金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子的製備：
將56.25毫克四氯化鋯和161.25毫克2-氨基對苯二甲酸溶解於15毫升n，n-二甲基甲醯胺中，再加入1.125毫升冰醋酸，置於25毫升的高壓反應釜120度下反應8小時。所得產物用20毫升的n，n-二甲基甲醯胺洗滌3次，然後用20毫升的甲醇浸泡24小時，乾燥後得到黃色粉末。將0.4毫克上述粉末超聲分散於1.87毫升甲醇中，加入15微升濃度為200毫摩爾每升的氯金酸溶液，6小時後，向懸浮液中加入30微升濃度為100毫摩爾每升的硼氫化鈉水溶液。反應半小時後，離心，棄去上清液，並用甲醇洗滌三次。
所得螢光探針分子是以nh2-uio-66為金屬有機框架，負載金納米顆粒所形成。
實施例2
金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子的結構、形貌和螢光特性。將樣品的粉末置於x射線粉末衍射儀的樣品臺上保持表面平滑，對其在5度到60度進行掃描。將樣品超聲後滴加於平整潔淨的矽片表面，在掃描電鏡下觀察其形貌。將貴金屬-金屬有機框架粉末與溴化鉀粉末混合後充分研磨，在25mpa壓力下壓成片狀以測試其紅外光譜。將金納米顆粒-金屬有機框架粉末超聲30分鐘以分散在超純水或者磷酸緩衝溶液(ph7.4,7mm)配製成濃度為10mg/ml的母液。取一定量的母液用相應的溶劑如超純水或者磷酸緩衝溶液稀釋到實驗所用的濃度50μg/ml。稀釋後的懸浮液加到乾淨的4ml石英比色皿中，設置激發波長為343nm。實驗結果如圖1所示，從圖中可以看到金屬有機框架呈現uio-66的衍射峰，顆粒的大小在90nm左右。激發波長在343nm，發射波長在435nm。
實施例3
異硫氰酸酯螢光素連接的金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子的結構以及光學性能。將異硫氰酸酯螢光素連接的金納米顆粒-金屬有機框架粉末與溴化鉀粉末混合後充分研磨，在25mpa壓力下壓成片狀以測試其紅外光譜。將異硫氰酸酯螢光素連接的貴金屬-金屬有機框架粉末壓入硫酸鋇基底以測試其紫外可見漫反射光譜。將異硫氰酸酯螢光素連接的金納米顆粒-金屬有機框架超聲30分鐘以分散在超純水或者磷酸緩衝溶液(ph7.4,7mm)配製成濃度為10mg/ml的母液。取一定量的母液用相應的溶劑如超純水或者磷酸緩衝溶液稀釋到實驗所用的濃度50μg/ml。稀釋後的懸浮液加到乾淨的4ml石英比色皿中，設置激發波長為343nm和488nm。實驗結果如圖2所示，從圖中可以看出異硫氰酸螢光素成功地連接到金屬有機框架上，並且保持488nm的激發波長和517nm的發射波長。
實施例4
金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子對穀胱甘肽的螢光響應。
使用金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子評價對穀胱甘肽的螢光響應。取一定量的上述已經配置好的母液用磷酸緩衝溶液稀釋到本實驗所用的濃度50，150或者250μg/ml。加到乾淨的4ml石英比色皿中，用相應的激發波長測量。用微量注射器將200mm的穀胱甘肽溶液滴加到懸浮液中混合均勻，檢測不同穀胱甘肽濃度下的螢光光譜。分別對不同金負載量(6％，3％，2％，1％)和不同探針用量下的螢光響應做了測試，實驗結果如圖3所示，從圖中可以看出隨著穀胱甘肽濃度的增加，螢光強度也不斷增強，不同的探針具有不同的線性範圍。
實施例5
使用金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子評價對穀胱甘肽的選擇性。
取一定量的上述已經配置好的母液用相應的溶劑如超純水或者磷酸緩衝溶液稀釋到本實驗所用的濃度50μg/ml。把濃度50μg/ml的金納米顆粒-金屬有機框架探針分子懸浮液加到乾淨的4ml石英比色皿中，用343或者488nm激發波長測量。首先，檢測金納米顆粒-金屬有機框架探針分子本身的螢光光譜，隨後，用微量注射器分別加入濃度10mm的幹擾胺基酸如半胱氨酸、精氨酸、穀氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，混合均勻，檢測各種幹擾胺基酸存在的條件下的螢光光譜。相同的方法測量加入穀胱甘肽後的螢光光譜。實驗結果如圖4所示。所有光譜的發射峰位置在435或者517nm，對於縱坐標的螢光強度，加入幹擾胺基酸時的螢光強度與金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針本身的螢光強度相比沒有明顯增強。加入穀胱甘肽後，螢光強度明顯增強。從圖中可以看出，本發明的金納米顆粒-金屬有機框架探針分子對穀胱甘肽具有明顯的選擇性識別能力。
實施例6
細胞毒性實驗
胰蛋白酶消化處於對數生長期的l02，hela，u87，hepg2細胞，製成濃度為1×105/ml單細胞懸液，接種於96孔板中，培養24h後，用不同濃度的金納米顆粒-金屬有機框架探針分子(10，20，30，40，50，100，200μg/ml)進行處理；然後繼續於37℃、含有5％二氧化碳，95％溼度的培養箱中培養至24h，每個實驗點設五個復孔。mtt比色法檢測細胞生存率：培養時間終止後每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl繼續培養4h；然後吸去上清液，每孔加入二甲基亞碸(dmso)150μl，終止反應，將96孔板移入平板震蕩器，水平震蕩10min，使mtt還原產物完全溶解，然後用酶聯免疫檢測儀於492nm波長處測定每孔吸光度(od值)，並以空白對照孔的od值調零。結果以每組5復孔的均數±標準誤差表示，實驗至少重複3次。細胞存活率用下式表示：
細胞生存率(％)＝[od實驗值-od空白值]492nm/[od對照值-od空白值]×100％
實驗結果如圖5所示，結果表明當卟啉濃度達到200μm時，細胞的存活率仍在90％以上，說明該金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子生物相容性好，對細胞的毒性非常低。
實施例7
金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子對細胞內穀胱甘肽的檢測。
hela人宮頸癌細胞株置於含有10％胎牛血清的dmem(鏈黴素100μg/ml青黴素100iu/ml)培養基中，於37℃、含有5％co2，95％溼度的培養箱中培養。成像前，把細胞放到培養皿中培養，待細胞貼壁後加入一定濃度的金納米顆粒-金屬有機框架探針分子，終濃度為50μg/ml。培養0.5h後，用無菌磷酸緩衝溶液輕輕衝洗，進行螢光共聚焦顯微鏡成像。
實驗結果如圖6所示，結果表明，經過金納米顆粒-金屬有機框架螢光探針分子標記過的hela細胞，可以看到細胞質內有明顯螢光增強(圖6b)。說明金納米顆粒-金屬有機框架探針分子可以通過共聚焦螢光強度對細胞中的穀胱甘肽濃度變化進行檢測。
由以上具體實例結果表明：該金納米顆粒-金屬有機框架探針分子本身具有良好生物相容性和化學光穩定性，可以對穀胱甘肽進行選擇性識別和細胞內穀胱甘肽濃度變化檢測。這種利用螢光進行檢測的方法簡便易行、快速，直觀，毒性低、靈敏度高、方法簡單，為穀胱甘肽的檢測提供了高效可行的方法。
實施例8
利用基體化合物四氯化鈦和2-氨基對苯二甲酸，高壓反應製備金屬有機框架，然後將其分散於甲醇中，加入貴金屬化合物氯金酸溶液，最後再加入硼氫化鈉水溶液反應後，其他條件與實施例1相同，最後所得螢光探針分子是以uio-66為金屬有機框架，負載金納米顆粒所形成。
經過實施例2-7相同的方法進行檢測，結果與金納米顆粒-金屬有機框架探針分子的性能基本相同。
實施例9
利用基體化合物四氯化鋯和2-氨基對苯二甲酸，高壓反應製備金屬有機框架，然後將其分散於甲醇中，加入貴金屬化合物硝酸銀溶液，最後再加入硼氫化鈉水溶液反應後，其他條件與實施例1相同，最後所得螢光探針分子是以nh2-uio-66為金屬有機框架，負載銀納米顆粒所形成。
經過實施例2-7相同的方法進行檢測，結果與金納米顆粒-金屬有機框架探針分子的性能基本相同。
實施例9
利用基體化合物四氯化鋯和2-氨基對苯二甲酸，高壓反應製備金屬有機框架，然後將其分散於甲醇中，加入貴金屬化合物氯鉑酸溶液，最後再加入硼氫化鈉水溶液反應後，其他條件與實施例1相同，最後所得螢光探針分子是以nh2-uio-66為金屬有機框架，負載鉑納米顆粒所形成。
經過實施例2-7相同的方法進行檢測，結果與金納米顆粒-金屬有機框架探針分子的性能基本相同。