針對瘧原蟲乳酸脫氫酶和富含組氨酸蛋白ii的核酸適體及其用於瘧疾診斷的用途

2023-06-04 06:20:21 1

針對瘧原蟲乳酸脫氫酶和富含組氨酸蛋白ii的核酸適體及其用於瘧疾診斷的用途
【專利摘要】本發明提供了結合瘧原蟲蛋白乳酸脫氫酶和富含組氨酸蛋白II的核酸適體及其用於診斷瘧疾的用途。針對富含組氨酸蛋白II的適體可用於通常檢測瘧原蟲物種的存在，而針對乳酸脫氫酶的適體可用於特異性檢測惡性瘧原蟲。
【專利說明】針對瘧原蟲乳酸脫氫酶和富含組氨酸蛋白Μ的核酸適體 及其用於瘧疾診斷的用途
[0001] 交叉引用相關申請 本申請要求2012年2月9日提交的美國臨時申請序列號61/596, 774的權益，所述申 請以其整體通過引用併入本文。 發明領域
[0002] 本發明涉及特異性結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)和富含組氨酸蛋 白II (HRPII)的DNA適體及其用於診斷瘧疾的用途。
[0003] 背景 瘧疾，熱帶和亞熱帶地區廣泛傳播的傳染性疾病，由寄生原生生物瘧原蟲的感染引起。 儘管存在可以感染人的四種痕原蟲，但物種惡性痕原蟲引起痕 疾的最危險形式，具有最高的死亡率。根據世界衛生組織（WHO)，每年有超過兩億確診的瘧 疾病例，導致近一百萬例死亡。
[0004] 此外，瘧疾對國家和個人的財富具有負面影響。根據世界銀行，瘧疾使非洲每年花 費約120億美元，且每年使國內生產總值（GDP)減緩超過1 %。瘧疾的負擔使家庭和社區陷 入由於生產力損失導致的更深的貧困和對國內和國外投資和旅遊業的負面影響。此外，瘧 疾大大影響社會的結構，因為高死亡率經常折磨五歲齡以下的年齡組。
[0005] 美國疾病控制和預防中心注意到，雖然徹底消除瘧原蟲將是最優的，但這對於大 部分瘧疾流行的國家是不現實的。瘧疾病例的改進管理對於控制瘧疾傳播是根本性的。
[0006] 快速診斷測試（RDT)對於管理瘧疾以減少瘧疾的發病率、死亡率和傳播是至關重 要的。對於瘧疾常用的RTD包括顯微鏡測定法、聚合酶鏈式反應（PCR)測定法、和基於抗體 的測定法。瘧疾的顯微鏡診斷，其基於血液塗片中瘧原蟲的顯微鏡觀察，可以區分不同種的 瘧原蟲。基於PCR的檢測也可以以高靈敏度區分不同種的瘧原蟲。然而，顯微鏡和基於PCR 的診斷測試兩者都需要昂貴的設備和訓練有素的健康護理工作人員，這通常對於發展中國 家中的大多數處於風險中的群體是不可得的。
[0007] 基於抗體的測定法利用抗體來檢測瘧原蟲抗原。用於瘧疾診斷的常用瘧原蟲抗原 包括瘧原蟲乳酸脫氫酶（pLDH)、富含組氨酸蛋白2 (PfHRP2)和醛縮酶。儘管基於抗體的快 速診斷測定法已經使瘧疾管理大大受益，但它們具有顯著的缺點，包括熱不穩定性、批次間 變化和高生產成本。
[0008] 因此，對於用於瘧疾診斷的改進方法存在需求。
[0009] 概述 本發明提供了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶和瘧原蟲富含組氨酸蛋白II的核酸適體（本文 中被稱為"瘧疾適體"）和使用這些瘧疾適體診斷和治療瘧疾的方法。
[0010] 在一個實施方案中，本發明提供了以高特異性和親和力靶向並結合兩種瘧疾蛋白 乳酸脫氫酶和富含組氨酸蛋白II的核酸適體。針對乳酸脫氫酶的適體可用於泛物種檢測 (pan-species detection)痕原蟲，而針對富含組氨酸蛋白II的適體可用於特異性檢測惡 性瘧原蟲。並行地，可以將這兩種適體併入裝置以通常檢測瘧原蟲和診斷瘧疾，以及確定瘧 疾是否特異性地由惡性瘧原蟲引起。
[0011] 本發明涉及使用瘧疾適體作為用於診斷瘧疾的診斷裝置的組分的方法。該方法提 供了基於瘧疾適體與瘧疾蛋白目標的結合的特異性的瘧疾抗原的特異性檢測。
[0012] 在某些實施方案中，本發明提供了包含本發明的核酸適體、或此類適體的穩定的 衍生物、或其藥學上可接受的鹽的製劑。該製劑可以包含結合瘧原蟲乳酸脫氫酶或瘧原蟲 富含組氨酸蛋白Π 或其變體或片段的任何適體。
[0013] 本發明還提供了使用本發明的核酸適體用於通過特異性結合瘧原蟲編碼蛋白和/ 或抑制瘧原蟲編碼蛋白的功能而診斷或治療瘧疾的方法。
[0014] 在診斷方面，本發明可以與其它診斷方法組合使用。在一個實施方案中，本發明可 以給個體施用單獨或與其它藥物組合的一定量的瘧疾適體。
[0015] 在一個實施方案中，本發明還提供了定量樣品中瘧原蟲蛋白水平的診斷方法。瘧 疾適體可以通過可檢測物質進行標記，所述可檢測物質包括但不限於螢光材料、酶、發光材 料和放射性材料。本發明的此類實施方案可以用於檢測生物樣品中的瘧原蟲蛋白水平。
[0016] 附圖簡述 圖1是描繪使用"通過指數富集配體的系統進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) "（SELEX?)方法體外選擇適體的不意圖。
[0017] 圖2顯示體外選擇LDH適體的瓊脂糖凝膠分析。在第1、第3、第5、第7、第9、第 12、第15、第18、第19和第20輪採集的樣品。
[0018] 圖3顯示本發明的適體的實施方案的核酸序列。所述適體特異性結合惡性瘧原蟲 乳酸脫氫酶（PfLDH)或富含組氨酸蛋白2 (HRP2)。分別在20輪針對惡性瘧原蟲PfLDH或 針對惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRP2)的SELEX(包括通過使用人LDH和磁珠的反向 SELEX方法）之後從ssDNA庫克隆並測序適體。
[0019] 圖4是顯示使用等溫滴定量熱法的2009(在每個5'和3'末端具有兩個18聚體 (18-mer)序列的PfLDH適體）和2009s之間的比較的圖。左側小圖是2009的原始量熱法 數據和結合等溫線，右側小圖是2009s(SEQ ID N0:3)的原始量熱法數據和結合等溫線。通 過連續注射用適體滴定PfLDH，且使用單一結合位點模型擬合結合等溫線。
[0020] 圖5是顯示PfLDH適體（SEQ ID NO: 1; 2004s)和重組惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶之 間的結合的等溫滴定量熱法分析結果的圖。上面小圖是用連續注射PfLDH適體劑（SEQ ID N0:1; 2004s)滴定PfLDH的原始量熱法數據。下面小圖是針對適體稀釋的熱校正之後由原 始量熱法數據的整合產生的結合等溫線。
[0021] 圖6是顯示PfLDH適體（SEQ ID N0: 2; 2008s)和重組惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶之 間的結合的等溫滴定量熱法分析結果的圖。上面小圖是用連續注射PfLDH適體（SEQ ID N0:2; 2008s)滴定PfLDH的原始量熱法數據。下面小圖是針對適體稀釋的熱校正之後由原 始量熱法數據的整合產生的結合等溫線。
[0022] 圖7是顯示PfLDH適體（SEQ ID N0: 3; 2009s)和重組惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶之 間的結合的等溫滴定量熱法分析結果的圖。上面小圖是用連續注射PfLDH適體（SEQ ID N0:3; 2009s)滴定PfLDH的原始量熱法數據。下面小圖是針對適體稀釋的熱校正之後由原 始量熱法數據的整合產生的結合等溫線。
[0023] 圖8是顯示PfLDH適體（SEQ ID NO: 4; 2021s)和重組惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶之 間的結合的等溫滴定量熱法分析結果的圖。上面小圖是用連續注射PfLDH適體（SEQ ID N0:4; 2021s)滴定PfLDH的原始量熱法數據。下面小圖是針對適體稀釋的熱校正之後由原 始量熱法數據的整合產生的結合等溫線。
[0024] 圖9顯示四聚的PfLDH與兩個本發明的DNA適體的結合。（A)四聚的LDH在與本 發明的DNA適體的兩個具體實施方案的複合體中的晶體結構。（B)複合狀態中本發明的 DNA適體的具體實施方案的結構，以及該DNA適體的核酸序列。（C)適體與PfLDH(左）和 人LDHA1和LDHB (右）結合的等溫滴定量熱法滴定。
[0025] 圖10顯示在蛋白：適體結合：適體結合界面處的底物特異性環決定適體對於 PfLDH相比於hLDH的辨別。（A) DNA適體與PfLDH的直接相互作用。⑶適體結合的辨別 是由於底物特異性環中的差異。PfLDH和hLDHB的底物特異性環顯示於（B)。
[0026] 圖11顯示用於分子診斷中的綴合至金納米顆粒的適體。（A)方法的原理。（B)單 獨的納米顆粒（左）、適體綴合的納米顆粒（中）和在PfLDH存在的情況下適體綴合的納 米顆粒（右）的TEM。（C)使用納米顆粒來檢測具體以25 ng/μ 1的PfLDH的定性觀察。 (D) (C)中數據的定量吸光度。
[0027] 序列概述 SEQ ID NO: 1是結合惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的DNA適體的核酸序列。
[0028] SEQ ID N0: 2是結合惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的DNA適體的核酸序列。
[0029] SEQ ID N0: 3是結合惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的DNA適體的核酸序列。
[0030] SEQ ID N0: 4是結合惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的DNA適體的核酸序列。
[0031] SEQ ID N0: 5是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸序 列。
[0032] SEQ ID N0: 6是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸序 列。
[0033] SEQ ID N0: 7是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸序 列。
[0034] SEQ ID N0: 8是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸序 列。
[0035] SEQ ID N0: 9是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸序 列。
[0036] SEQ ID N0: 10是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸 序列。
[0037] SEQ ID N0: 11是結合惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體的核酸 序列。
[0038] SEQ ID N0: 12是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0039] SEQ ID N0: 13是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0040] SEQ ID N0: 14是根據本發明有用的核酸序列。
[0041] SEQ ID N0: 15是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0042] SEQ ID N0: 16是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0043] SEQ ID NO: 17是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0044] SEQ ID N0: 18是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0045] SEQ ID N0: 19是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0046] SEQ ID N0: 20是根據本發明有用的引物的核酸序列。
[0047] 詳述 本發明提供了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)的核 酸適體。本發明的核酸適體可以包含DNA或RNA核苷酸。在一個實施方案中，本發明提供 了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II(HRPII)的DNA適體。
[0048] 在某些具體實施方案中，本發明提供了包含選自SEQ ID NOs: 1-11的核酸序列的 i^一種不同的DNA適體序列。這些適體中的四種（SEQ ID N0s: 1-4)針對瘧原蟲乳酸脫氫 酶進行選擇，且這些適體中的七種（SEQ ID N0s:5-ll)針對富含組氨酸蛋白II進行選擇。 [0049] 等溫滴定量熱法結果顯示本發明的適體與它們各自的目標（瘧原蟲乳酸脫氫酶 和瘧原蟲富含組氨酸蛋白II)的緊密結合（圖4-8)。這些適體還顯示與對照蛋白的可忽略 的結合，表明與各自目標的特異性結合。具體而言，本發明的瘧原蟲LDH適體不結合人LDH。
[0050] 本發明還提供了本發明的核酸適體用於快速且靈敏地檢測樣品中的瘧原蟲，以及 用於檢測個體中的瘧疾的用途。
[0051] 結合瘧原蟲LDH和瘧原蟲HRPII的適體 本發明提供了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)的核 酸適體。本發明的核酸適體可以包含DNA或RNA核苷酸。在一個實施方案中，本發明提供 了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)的DNA適體。
[0052] 在一個實施方案中，本發明提供了結合或特異性結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的 核酸適體，其中所述適體包含SEQ ID NOs: 1-4中的任一種： 5^ΛCtCGΛCιC^ΛGGTCfGTΛCiΛΛTC^ATΛΛTCjGCΓTGΛΓΓ-.V (St*：Q ID M?: i) (2004^； 5·<?Τι0(?Γ001'Λ(1ΑAC：C\<I：A(ll，GACrrAGCCCrrCl，AC-3'(SEQ ID K〇：2) (2(10X^}; 5 -?'ΛΟΟΤΟΟΓΓΛΟ Λ ΛΟΟΤΛΟΛ ΛΓΓΛΤΛΟΤΟΟΙ'Γ 1'OG TA-3*{Sl：；〇 ID NO; 31 fi 5*-Λ0Λ AlOCXlIGGACiAGCCll'ACiCTiArCATTf：fi1'AC：-；r(SH〇 1D MO:4) (2021 s)
[0053] 在另一個實施方案中，本發明提供了結合或特異性結合瘧原蟲富含組氨酸蛋白 II (HRPII)的核酸適體，其中所述適體包含SEQ ID NOs: 5-7中的任一種： i'-ACK'CK'ATTf'ATGC'GC'TCX'CXiCTTATCKXJtXKifXjiKX'AC'CiTCKiAAAC'CXXiGI ΙΓΓΟΓΙΤΟ?πΤΟΓ?Λ?ΚΤ^' {SEQ 1DK0:5) CJOb): 5"-TCK'(rACTTATCJTTCCiCC'CCXTX'CCTCTTGTTCTC.J'CSEQ ID N〇：6) (2f〇5^)： S'-CjCTTATCX'OATCK'AtiAC'CCCTTCCKiTCrTCJC'rCTr.S'tSEQ ID K:7) (21 Ofe); 5*-ixiGit：Airi(XtTritiGG/\cTiAir：A'ii'Ccraiiv\ror-;r(Sb：〇 id no：k) m 12s)； 5'4'\Α--ΤΧ\·\€ΠΧ?Λ(3ΛΛ€,1?Γ?Γ〇4〇--Γι1·€ΧΓΛΙ--?*Λ€Γ1，ΛΓι(·Τ(Τ1Γ?ΧΓιΓΛΓΤ ΟΓ1Γι€--?Τ1?ΤΟ€ΟΟΛ(ΧΓι·Ι'Λ'ΙΤχν(?；|·；〇 ID \〇；9) (2115s); 5'-(T(KiCKJ(iGGTT(TAC}(iCiC；CKi<iOCK'ACTTAT(TOCA-.riSCQ ID NO:剛 f212fc): p 5'.TTATTCiCKi(ICKi(iITACKKKi<JCjCiCJCTTTTATTCACT-3*lSEQ ID NO:l 1) |?144s)
[0054] 如等溫滴定量熱法的結果（圖4)中顯示，當與具有SEQ ID NO:3的適體相比時， 在SEQ ID N0:3的5'和3'末端添加兩個18聚體序列的適體具有相似的對瘧原蟲LDH的 化學計量、解離常數和結合親和力（在納摩爾範圍內的相似結合親和力）。
[0055] 在某些實施方案中，本發明提供了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的核酸適體，其 中所述適體包含核酸序列，所述核酸序列與SEQ ID NOs: 1-4中的任一種具有至少約80%同 一性，或高於80%的任何百分比，諸如，至少85%、90%、92%、93%、94%、95%或98%。
[0056] 在某些實施方案中，本發明提供了結合瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)的核酸 適體，其中所述適體包含核酸序列，所述核酸序列與SEQ ID N0s:5-ll中的任一種具有至少 約80%同一性，或高於80%的任何百分比，諸如，至少85%、90%、92%、93%、94%、95%或98%。
[0057] 在某些實施方案中，本發明提供了結合瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)的核酸適體，其 中所述適體包含核酸序列，所述核酸序列相對於SEQ ID NOs: 1-4中的任一種具有不超過8、 7、6、5、4、3、2或1個核酸的修飾（諸如添加、缺失、取代）。
[0058] 在某些實施方案中，本發明提供了結合瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)的核酸 適體，其中所述適體包含核酸序列，所述核酸序列相對於SEQ ID NOs: 5-11具有不超過15、 14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核酸的修飾（諸如添加、缺失、取代）。
[0059] 在一個實施方案中，本發明提供了特異性結合瘧原蟲乳酸脫氫酶(LDH)或瘧原蟲 富含組氨酸蛋白II(HRPII)的核酸適體。在一個實施方案中，本發明提供了特異性結合惡 性瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)或惡性瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)的核酸適體。
[0060] "特異性結合"或"特異性"是指適體可檢測地結合呈遞在抗原上的表位，同時具 有與其它蛋白或結構相對小的可檢測的反應性的能力。特異性可以通過，例如，與特定抗原 的結合相比於與其它無關分子的非特異性結合的親和力/親和力（affinity/avidity)的約 10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10. 000:1或更高比例來表現。
[0061] 除非另有說明，如本文所用，兩個序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使 用如Karlin和Altschul(1993)中修改的Karlin和Altschul(1990)的算法來確定。將此 類算法併入Altschul等人（1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序、評分 =100、字長=12進行BLAST搜索，以獲得具有期望百分比序列同一性的序列。為了獲得用 於比較目的的有缺口的比對，可以如Altschul等人（1997)中所述使用Gapped BLAST。當 利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各自程序（NBLAST和XBLAST)的默認參數。 參見NCBI/NIH網站。
[0062] 適體序列的修飾 可以對適體進行各種修飾，以降低外切核酸酶降解並增加其用於診斷或用於治療的壽 命。用反轉胸苷、脫氧胸苷核苷酸和聚乙二醇（PEG)修飾適體的3'末端可以降低寡核苷酸 適體的降解並且增加適體的穩定性。在一個實施方案中，PEG具有約20 - 80 kDa的平均 分子量。
[0063] 進一步，還可以修飾適體的脫氧核糖-磷酸酯骨架的磷酸二酯鍵，以改善穩定性。
[0064] 在一個實施方案中，本發明的核酸適體是寡核酸分子，其包含式1所示結構的重 復單元。波浪線區別一個核苷酸和/或重複單元與鄰近的核苷酸和/或重複單元。
【權利要求】
1. 結合瘧原蟲乳酸脫氫酶的適體，其包含與SEQ ID NOs: 1-4中任一種具有至少85% 同一'I"生的核酸序列。
2. 根據權利要求1的適體，其包含選自SEQ ID NOs: 1-4中任一種的核酸序列。
3. 根據權利要求1的適體，其具有15-50個核苷酸鹼基。
4. 根據權利要求1的適體，其中所述適體與一個或多個選自脫氧胸苷核苷酸、反轉胸 苷和聚乙二醇的部分綴合。
5. 根據權利要求1的適體，其中所述適體是具有由脫氧核糖-磷酸酯鍵形成的骨架的 寡核苷酸。
6. 根據權利要求1的適體，其中所述適體是這樣的寡核苷酸，所述寡核苷酸的骨架包 含由一個或多個硫酯鍵和/或一個或多個醯胺鍵穩定的一個或多個脫氧核糖-磷酸酯鍵。
7. 結合瘧原蟲富含組氨酸蛋白II的適體，其包含與SEQ ID N0s:5-ll中任一種具有至 少85%同一性的核酸序列。
8. 根據權利要求7的適體，其包含選自SEQ ID N0s:5-ll中任一種的核酸序列。
9. 根據權利要求7的適體，其具有15-100個核苷酸鹼基。
10. 根據權利要求7的適體，其中所述適體與一個或多個選自脫氧胸苷核苷酸、反轉胸 苷和聚乙二醇的部分綴合。
11. 根據權利要求7的適體，其中所述適體是具有由脫氧核糖-磷酸酯鍵形成的骨架的 寡核苷酸。
12. 根據權利要求7的適體，其中所述適體是這樣的寡核苷酸，所述寡核苷酸的骨架包 含由一個或多個硫酯鍵和/或一個或多個醯胺鍵穩定的一個或多個脫氧核糖-磷酸酯鍵。
13. 試劑盒，其包含根據權利要求1的適體，和載體。
14. 試劑盒，其包含根據權利要求7的適體，和載體。
15. 用於診斷個體中的瘧原蟲感染的方法，其包括： 從個體獲得生物樣品； 將所述生物樣品與核酸適體接觸，所述核酸適體包含與SEQ ID NOs: 1-11中任一種具 有至少85%同一性的序列； 確定所述核酸適體和瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)和/或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)之間的結合複合體的形成， 其中所述結合複合體的存在表明所述個體具有瘧原蟲感染。
16. 根據權利要求15的方法，其中所述核酸適體包含選自SEQ ID NOs: 1-11中任一種 的序列。
17. 根據權利要求15的方法，其中所述結合複合體的存在表明所述個體具有惡性瘧原 灰{Plasmodium falciparum)感染。
18. 根據權利要求15的方法，其中所述生物樣品是血液或尿液樣品。
19. 用於檢測樣品中瘧原蟲的存在的方法，其包括： 將樣品與核酸適體接觸，所述核酸適體包含與SEQ ID N0s:l-ll中任一種具有至少 85%同一性的序列； 確定所述核酸適體和瘧原蟲乳酸脫氫酶（LDH)或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII) 之間的結合複合體的形成，其中所述結合複合體的形成表明所述樣品中瘧原蟲的存在。
20. 根據權利要求19的方法，其進一步包括確定所述核酸適體和瘧原蟲乳酸脫氫酶 (LDH)或瘧原蟲富含組氨酸蛋白II (HRPII)之間形成的結合複合體的濃度或量。
21. 根據權利要求19的方法，其中所述核酸適體包含選自SEQ ID NOs: 1-11中任一種 的序列。
22. 根據權利要求19的方法，其中所述結合複合體的存在表明個體具有惡性瘧原蟲感 染。
【文檔編號】C07H21/04GK104245957SQ201380008737
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月6日 優先權日:2012年2月9日
【發明者】唐柱霖, 張綺蕙, 小高雅代 申請人:香港大學