施氏假單胞菌Zh9944及其篩選方法和防治青枯病的微生物製劑的製作方法

2023-06-04 03:41:31

專利名稱：施氏假單胞菌Zh9944及其篩選方法和防治青枯病的微生物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌及其篩選方法和以該細菌為主要成分的防治作物如菸草、番茄等的青枯病的微生物製劑。
由青枯病假單胞菌引起的青枯病發病於菸草、番茄、花生、茄子、辣椒等等作物，迄今為止尚未發現有效的農藥以及防治方法。
本發明的目的是提供一種施氏假單胞菌及其篩選方法和以該細菌為主要成分的防治青枯病的微生物製劑。
實現本發明目的中的提供一種施氏假單胞菌的技術方案是施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(以下簡稱為PSZh9944菌株)，於1999年3月自我國江蘇省常州市郊區的番茄青枯病發生地區的採集樣品中分離篩選而得，已於2000年9月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為NO.0494。
上述施氏假單胞菌的分離篩選和菌株的獲得方法是，採用平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結合的方法，其技術路線為(1)在菸草、番茄等青枯病發生地區的田塊中採集發病株和健康株的根、莖和根圍土；(2)從採集樣品中分離菌株；(3)通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗和分離菌株的致病性試驗，區分出拮抗菌株和病原菌株兩類；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物學參數分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關係以及在細菌分類上屬假單胞桿菌(Pseudomonas spp.)或芽孢桿菌(Bacillsspp.)選取拮抗菌株；(5)選出的拮抗菌株通過田間小區多點試驗以田間防效不小於60％為基準挑選有效菌株。
PSZh9944菌株具有下述性質1、形態特徵用光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察菌株。結果表明菌株為單個杆狀細胞，大小為0.8×1.5～3.8微米，革蘭氏染色菌體為紅色、呈陰性，不形成芽孢，以單生極毛運動，在營養瓊脂上產生銅綠色水溶性色素，不產生螢光色素及膿青素。
在營養瓊脂培養基上，菌落圓形，表面光滑，有光澤，邊緣較整齊，淺灰藍色，半透明，30℃培養48小時，菌落直徑在0.5～2.0毫米左右。
2、菌株的生理生化特徵專性好氧，在厭氧條件下能進行反硝化作用，不需要生長因子，在細胞內不積儲聚-β-羥基丁酸鹽顆粒，水解明膠，不水解澱粉，在蔗糖培養基上不產生果聚糖。其它生理生化特徵如下氧化酶(+)； 接觸酶 (+)；O/F測定為氧化型產酸； H2S (-)；賴氨酸脫羧酶 (-)；精氨酸雙水解酶(-)；M.R.反應 (-)；色氨酸脫氨酶 (-)；吲哚試驗 (+)；V.P.反應 (-)；脲酶 (-)；41℃生長 (+)；精氨酸脫羧酶 (+)。
由於該菌株革蘭氏試驗呈陰性G(-)，直的杆狀，以單生極毛運動，氧化酶(+)，O/F為氧化型，在厭氧條件下能進行反硝化作用，接觸酶陽性，在細胞內不積累聚-β-羥基丁酸鹽顆粒，不產生螢光色素，在41℃能生長等特徵，可歸為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
菌株PSZh9944與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)模式菌株比較存在相異如下在培養特徵上，生長物不粘連在培養物上，始終光滑，呈淺灰藍色，在營養瓊脂上產生銅綠色水溶性色素，在生理生化性質上，PSZh9944水解明膠，不水解澱粉，不能利用麥芽糖。
實現本發明目的中的提供一種防治青枯病的微生物製劑的技術方案是該微生物製劑為粉劑，以禾本科植物種皮粉、莖幹粉為載體，以施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)Zh9944 CGMCC NO.0494為活性成分，每克載體含有活性菌數500億CFU以上。
上述載體可以是礱糠粉、麩皮粉、稻杆粉、麥杆粉、高粱杆粉或玉米杆粉。
優選的載體是礱糠粉，礱糠粉的粒度以能通過20～60目篩為準，粉劑的顏色為褐色至土黃色。
上述載體含有活性菌數的優選範圍是每克1000～6000億CFU。
培養方法可以用常規的微生物製劑發醇罐方法培養PSZh9944。所得的培養液以一定的比例與礱糠粉混合，物料含水量應降低在15％以內，約為8％～15％，即製得本發明所述的微生物製劑。培養方法為液體培養，將生產菌的菌懸浮液接種到培養基上，並進行通氣攪拌。
對培養基的營養源並無特殊的規定，其中碳源為澱粉、葡萄糖，不宜用蔗糖。氮源可為腖、大豆粉、肉膏、玉米漿等，其它營養源，例如磷酸鹽、硫酸鎂等可適當添加。
對溫度限定在29～31℃之間，pH值可保持在消後6.9～7.0，培養時間為20～24小時。發醇罐培養終止後，及時將培養液與礱糠以適合比例混合，並在乾燥通風的條件下，使物料含水量為8％～15％以內，活菌量保持在每克500億CFU以上。
如以上所得的微生物製劑具有下述物理與生物性質1、形狀褐色至土黃色粉末。
2、含活菌量每克500億活菌以上；以下毒性試驗中含活菌量為每克3000億活菌。
3、急性毒性分級大鼠經口LD50＞4640mg/kg，大鼠經皮LD50＞2000mg/kg。按GB-15670-1995「農藥登記毒理學試驗方法」中農藥急性毒性分級標準，屬低毒類農藥。
4、急性眼睛皮膚刺激分級急性眼刺激積分指數為2(1小時)，急性皮膚刺激分值為0(1小時)。按GB-15670-1995「農藥登記毒理學試驗方法」中農藥急性皮膚眼睛刺激分級標準，對眼睛、皮膚均無刺激性。
5、對鳥類、魚類、蜜蜂、家蠶的毒性安全性評價對鳥類，用高於最高使用濃度一倍的溶液一次性劑量直接經口注入灌胃，經10天試驗觀察無死亡現象及其他中毒症狀，說明鵪鶉對粉劑的耐受劑量LD0＞100億CFU/kg，因此，正常使用該生物製劑對鳥類是安全的。
對魚類，斑馬魚在高於最高使用濃度一倍的溶液中，經一周試驗觀察，無死亡現象及其他中毒症狀，斑馬魚對粉劑的最大耐受濃度LC0＞300倍稀釋液(10000億CFU/升)。因此，正常使用該生物製劑對魚類是安全的。
對蜜蜂，以田間常用量及兩倍田間常用量的藥液對蜜蜂進行胃殺毒性和觸殺毒性試驗，受試蜜蜂在試驗觀察期內均未出現中毒症狀及死亡現象。該生物製劑對蜜蜂低毒，正常使用時對蜜蜂安全。
對家蠶，以田間常用量及兩倍田間常用量的藥液浸漬過的桑葉飼餵受試二齡起蠶，24小時後改餵未浸藥桑葉，受試家蠶在24小時、48小時，至三齡起蠶的觀察期內未出現中毒症狀及死亡。繼續觀察至四齡起，生長正常。以上結果表明，該生物製劑對蠶低毒，正常使用對家蠶安全。
本發明具有積極的效果(1)由於因青枯假單胞菌引起的青枯病日趨嚴重(包括感病程度、作物和地區的上升和擴展)，迄今為止無任何農藥可治。本發明所提供的可以有效用於防治細菌性青枯病的細菌菌株以PSZh9944為主要成分製造出微生物農藥，是一種高效、無毒、安全、無殘留的新型微生物農藥。(2)PSZh9944能在感病作物體內外拮抗青枯病原菌。該菌株具有在感病作物根際土壤中繁殖的能力，並向作物根部聚集和進入根組織內部，向上轉移至莖。並且定植於根和莖的韌皮部薄壁細胞間，構成所謂「拮抗防線」，並與感病作物形成互生關係。PSZh9944對青枯假單胞菌拮抗能力的大小與向田間接種PSZh9944的菌量成對應關係。(3)本發明的微生物製劑對因青枯假單胞菌引起的菸草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很強的抑制作用，田間防效達60～80％左右。(4)本發明所述的PSZh9944為主的微生物製劑不僅對青枯假單胞菌引起的青枯病害有治療作用，而且使受施作物具有對青枯病害的預防作用，還能刺激作物生長。(5)在製造所述的微生物製劑時，以纖維類物質、尤以礱糠粉為載體吸附較適宜，不能與其他殺菌劑混配或混合使用。
以下就本發明的製造、試驗事例舉例說明。
製造例以葡萄糖1.5％、澱粉2.0％、酵母粉1.5％、蛋白腖0.4％，MgSO4為0.05％，KH2PO4為0.05％，CaCO3為0.6％的比例製成培養基，滅菌前pH值為7.2～7.4，在250毫升三角瓶放置70毫升培養基，將PSZh9944接種於該培養基中。在30℃、220r.p.m下振蕩培養48小時作為種子液，取1000ml種子液於1噸發醇罐中，內盛600升的上述相同比例的培養基。在30℃，向發酵罐通風、攪拌培養20～24小時。培養終止後，及時將培養液與粒度為過40目篩的礱糠以1∶1～1∶3的比例混合，通風乾燥至物料含水量為8～15％，活菌量達1000～6000億CFU/g，色澤為土黃色至褐色。
試驗和應用例根據細菌性青枯病的發病原理，對於此類病害的控制，能被普遍接受的方法只能用以生物防治為主的預防方法，以此達到阻止青枯病菌侵入植物根內潛伏和發展成為病害。因此，使用本發明的生物製劑的時機應在播種、假植、定植和定植後的20～60天，總共4～5次，總用量為2～2.5kg(3000億CFU/g)，在使用時以水為「溶劑」、使菌體釋放出來，防效可達60～80％。具體的試驗例見表1、應用例見表2。表1
表權利要求
1.一種施氏假單胞菌，其特徵在於施氏假單胞菌Zh9944，已於2000年9月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為NO.0494。
2.一種施氏假單胞菌的篩選和菌株的獲得方法是，採用平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結合的方法，其技術路線為(1)在菸草、番茄等青枯病發生地區的田塊中採集發病株和健康株的根、莖和根圍土；(2)從採集樣品中分離菌株；(3)通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗和分離菌株的致病性試驗，區分出拮抗菌株和病原菌株兩類；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物學參數分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關係以及在細菌分類上屬假單胞桿菌屬或芽孢桿菌屬選取拮抗菌株；(5)選出的拮抗菌株通過田間小區多點試驗以田間防效不小於60％為基準挑選有效菌株。
3.一種防治青枯病的微生物製劑，該微生物製劑為粉劑，其特徵在於以禾本科植物種皮粉、莖幹粉為載體，以施氏假單胞菌Zh9944 CGMCC NO.0494為活性成分，每克載體含有活性菌數500億CFU以上；含水量為8～15％。
4.根據權利要求3所述的防治青枯病的微生物製劑，其特徵在於載體是礱糠粉、麩皮粉、稻草粉、麥杆粉、高粱杆粉或玉米杆粉。
5.根據權利要求4所述的防治青枯病的微生物製劑，其特徵在於載體是礱糠粉，礱糠粉的粒度以能通過20～60目篩為準，粉劑的顏色為褐色至土黃色。
6.根據權利要求3至5之一所述的防治青枯病的微生物製劑，其特徵在於每克載體含有活性菌數1000～6000億CFU。
全文摘要
本發明涉及一種細菌及以該細菌為主要成分的防治作物的青枯病的微生物製劑。所述的細菌為施氏假單胞菌Zh9944。所述的防治青枯病的微生物製劑,以施氏假單胞菌Zh9944為活性成分,以禾本科植物種皮粉或莖杆粉為載體,每克載體含有活菌數500億CFU以上;含水量為8～15%。本發明的微生物製劑是一種高效、無毒、安全、無殘留的新型微生物農藥。對因青枯假單胞菌引起的菸草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很強的抑制作用,田間防效達60～80%左右。
文檔編號C12N1/20GK1347981SQ00119018
公開日2002年5月8日 申請日期2000年10月11日 優先權日2000年10月11日
發明者楊仲華, 張春明, 任熾麓, 安鳳霞, 任敏, 張逸慶, 張華泉 申請人:常州蘭陵製藥有限公司, 張春明