一種快速定量檢測肌鈣蛋白T的均相螢光免疫試劑及其製備與檢測方法與流程

2023-06-04 20:49:46 2

本發明屬於醫學檢驗領域，具體涉及一種快速定量檢測肌鈣蛋白T的均相螢光免疫試劑及其製備與檢測方法。
背景技術：
：冠心病已成為影響人群健康的主要疾病。急性心肌梗死則是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及時地發現急性心肌梗死病人及其相應的治療是挽救心肌梗死病人生命的關鍵所在。傳統的診斷主要是根據典型的臨床表現，心電圖的改變及實驗室酶學檢查。但相當一部分心肌梗死病人臨床表現不明顯，早期心電圖無明顯改變。在這種情況下，心肌損傷特異性標誌物的應用對心肌梗死的早期確診就起到了關鍵的作用。肌鈣蛋白T(CardiactroponinT，cTnT)是一重要的心肌組織損傷特異性標識物，臨床用於急性心肌梗死及其它心肌損傷性疾病的診斷。肌鈣蛋白是橫紋肌的結構蛋白，由TnI、TnT和TnC三種亞單位組成。TnT是與原肌球蛋白結合的亞單位，Tnl是肌原纖維ATP酶的抑制性亞單位，TnC是鈣離子結合亞單位。這三種亞單位與原肌球蛋白一起構成肌凝蛋白(Tm)—肌鈣蛋白(Tn)複合體。在鈣離子的誘導下，調節肌肉收縮和舒張的力量和速度。骨骼肌與心肌中的TnT和TnI是由不同的基因編碼的，導致其胺基酸組成序列的差異，因此可以用免疫學的方法加以區分。TnC在骨船肌和心肌中則是相同的。cTnT是僅存在於心肌細胞中的特異性調節蛋白，分兩種形式存在：游離形式存在於細胞胞漿中，佔6％～8％；結合形式存在於心肌收縮單位中肌纖維的細肌絲上，佔92％～94％。當出現可逆性心肌缺血，心肌細胞尚未壞死，但細胞膜受到損傷，胞漿中的cTnT可短暫釋放入血；當發生不可逆性心肌缺血，心肌細胞壞死，細肌絲降解，可導致結合池cTnT釋放入血。因此不穩定型心絞痛(UAP)患者血液中cTnT僅短暫輕度升高隨後恢復正常；而急性心肌梗塞(AMI)患者血中cTnT可顯著升高且維持較長時間。cTnT在心肌損傷後2～8小時釋放入血，12～24小時達高峰，在血中可維持14天左右，所以它的最大有效診斷窗口寬至2小時～14天。在心肌損傷後，cTnT較cTnI更早釋放入血，更易被檢測到，血中濃度更高，對檢測心肌損傷的價值也就可能更高。cTnT僅存在於心肌細胞中，可用免疫酶標定量法測得，對心肌損傷的診斷具高度敏感和特異性。雖然早期的測定方法不成熟，使cTnT與骨骼肌TnT有微量交叉反應，採用心臟特異和非心臟特異兩種抗體測定cTnT，發現cTnT與骨骼肌TnT有1％～2％的交叉反應。檢測方法改進後，採用兩種均為心臟特異的單克隆抗體作為檢測抗體測定cTnT時，與骨骼肌TnT的交叉反應陽性率0.1ng/mL)，胸痛發作24小時內cTnT診斷AMI的敏感性和特異性分別為99％和93％，第2天敏感性和特異性均為100％，因cTnT的升高在血清中持續時間較長，故到第6天仍均達100％；而頭24小時內CK和CK-MB的敏感性分別為99％和98％，特異性分別為75％和92％。cTnT的價值優於CK、CK-MB，在AMI後，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，診斷AMI的絕對敏感窗(以症狀發作後時間計)在cTnT也遠較CK和CK-MB寬，cTnT為10.5～140小時，CK和CK-MB為9～31小時。cTnT診斷AMI的價值優於CK、CK-MB的可能原因有：(1)心肌中cTnT的含量較高，每克心室肌(溼重)含10－8mg的cTnT，cTnT總量中的6％～8％存在於胞漿中，而這胞漿中的cTnT量已經相當於心肌中CK的總量，所以cTnT在AMI後的升高幅度要遠高於CK(cTnT可達30～40倍，而CK僅升高9倍)。(2)cTnT在心肌損傷後釋放入血也較CK要早，它最早可在症狀發作後1小時在血中檢出，3～4小時其敏感性可達50％。(3)其在血中持續升高的時間較長。cTnT大部分(94％)以結合形式存在於心肌細胞收縮單位中，它從細肌絲的肌鈣蛋白複合物中分離出來的過程是一個消耗時間的過程，且此過程不斷進行，因此雖然cTnT在血漿中的半衰期只有120分鐘，但卻可在血中持續升高達2周左右。在10.5～140小時的絕對敏感診斷窗中，100％的AMI患者cTnT均升高，敏感性是CK的6倍。cTnT的測定始於20世紀90年代初，多採用雙抗體競爭放射免疫法和競爭性ELISA測定法。有研究者將金標記或硒標記單克隆抗體與免疫層析技術相結合，用紙條法半定量床邊檢測cTnT濃度，最低檢測值為0.1μg/L。目前cTnT的檢測多採用化學發光法，用化學發光物質標記後作為檢測抗體，大大提高了測定的精確性和敏感性，但需要昂貴的檢測設備。目前的床旁檢測方法(膠體金試紙法)，不能滿足臨床診斷準確定量的要求，無法對AMI的病程起到很好的療效監測作用。因此，建立一種檢測時間儘量縮短，並且檢測除了能在實驗室進行外，還要求能夠進行床旁檢測，同時能定量測定cTnT的檢測方法，從而為臨床提供準確的診斷依據，是十分必要的。均相螢光分析法(homogeneousfluoroimmunoassay,HFIA)是在時間分辨螢光免疫分析(time-resoluedfluoroimmunoassay,TRFIA)技術的基礎上形成的一種新的螢光免疫分析技術。TRFIA技術採用的螢光物質與傳統的螢光染料完全不同，採用的是鑭系元素銪(Eu)、鎝(Tb)等作為螢光材料，靈敏度非常高，穩定性好，低溫條件可保存三年，因而成為二十一世紀最熱門的免疫分析技術。均相螢光免疫檢測法是用同一抗原的兩個抗體分別標記Eu3+和螢光染料Alexa647。Eu3+標記抗體在游離狀態時，受到340nm光線激發，只發射平均波長為615nm螢光，而在抗原、抗體複合物形成時，發生能量傳遞，激發螢光染料Alexa647發射出665nm螢光。標記抗體直接與待測樣品進行抗原、抗體反應，如果能形成抗原、抗體複合物，則在665nm出可測得螢光信號。這種方法省卻了酶聯免疫法反覆孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結果，省時省力。並且，此法也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的幹擾，穩定性和重複性都較好，能較真實地反映被測物質的含量。此外，Eu3+和Alexa647這對螢光物質的最大發射光波長之間相差較大，未發生抗原抗體反應的本底螢光值就非常低。而人血清中非特異性物質產生的300～500nm螢光，不能激發Alexa647發射螢光信號650nm激發光，因此非特異性螢光非常低。中國專利文件CN102841206A(申請號：201110168449.5)公開了一種測定血清中的肌鈣蛋白T含量測定的試劑盒。所要解決的技術問題是克服上述
背景技術：
的不足，提供一種樣本無需稀釋、操作簡單、準確度高、重複性好，適用於各種類型的全自動生化分析儀以及各種特種蛋白儀的免疫比濁法檢測肌鈣蛋白T含量的試劑盒。技術方案是：免疫增強比濁法檢測肌鈣蛋白T試劑盒，包括：a、試劑R1：緩衝液、防腐劑、加速劑、無機鹽、表面活性劑，其餘為純化水；b、試劑R2：緩衝液、結合有抗人的肌鈣蛋白抗體、防腐劑，乳膠微球直徑為60-150nm；c、參考校準品：緩衝液，穩定劑，防腐劑以及根據濃度需要確定的一定量的重組人蛋白肌鈣蛋白T純品，其餘為純化水。但該方法靈敏度偏低，線性範圍偏窄，很少應用於臨床檢測。中國專利文件CN102565422A(申請號：201110451623.7)公開了一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的螢光免疫層析方法及其試劑盒。本發明的定量檢測cTnT螢光免疫層析方法是利用量子點的優良螢光特性，結合雙色標記技術及免疫層析技術，在優化試紙條各組成部件基礎上，實現的螢光定量檢測。中國專利文件CN104502595A(申請號：201410629661.0)公開了一種肌鈣蛋白的檢測方法及試劑盒，尤其涉及一種肌鈣蛋白的雙波長螢光免疫層析檢測方法及其檢測試劑盒。包括以下步驟：1)免疫層析試紙條製備；2)凍幹探針製備；3)樣品稀釋液製備；4)樣品檢驗。但是，這兩種方法均受硝酸纖維素膜本身的非均一性缺陷而導致檢測重複性較差。技術實現要素：針對現有cTnT檢測技術的不足，本發明提供一種快速定量檢測肌鈣蛋白T的均相螢光免疫試劑及其製備方法與檢測方法。本發明根據免疫螢光技術特點和cTnT抗原抗體系統特點，設計新的原材料，試劑和工藝流程。應用本發明提供的試劑檢測cTnT水平，具有簡單，快速，靈敏和特異性好等特點，可同時定量檢測高值和低值樣品，並且性價比高，適用於臨床快速檢測。本發明的技術方案如下：一種快速定量檢測肌鈣蛋白T的均相螢光免疫試劑，包括稀土元素螯合物標記的anti-cTnT、近紅外螢光化合物標記的另一個anti-cTnT和系列濃度的cTnT校準品。根據本發明，優選的，所述的稀土元素螯合物為銪離子(Eu3+)螯合物，進一步優選BHHCT-Eu3+、BHHBCB-Eu3+。稀土元素螯合物標記的anti-cTnT獨立包裝。根據本發明，優選的，所述的近紅外螢光化合物為Alexa或系列染料，進一步優選AlexaFluor647、DyLight-DY647或CF647的染料。近紅外螢光化合物標記的另一個anti-cTnT獨立包裝。根據本發明，優選的，所述的cTnT校準品是用磷酸鹽緩衝液稀釋溶解cTnT純品得到；進一步優選的，磷酸鹽緩衝液的濃度為0.01mol/L，磷酸鹽緩衝液中含有0.01％-0.5％PEG、1％-5％BSA、0.01％-0.05％表面活性劑，均為質量百分比含量；優選的，所述的表面活性劑為吐溫20。系列濃度的cTnT校準品獨立包裝。根據本發明，優選的，所述的cTnT校準品的濃度分別為0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL。根據本發明，所述的稀土元素螯合物標記的anti-cTnT的製備方法，包括步驟如下：將鼠抗人cTnT溶液透析後，加入NaHCO3，調pH至9.1，得抗體溶液；將BHHCT或BHHBCB的甲醇溶液滴加到抗體溶液中，攪拌反應，離心除去不溶物後，色譜柱分離標記蛋白質和游離的標記物；紫外/可見分光光度計檢測各收集液的A330值，合併含有標記抗體的溶液；加入最終質量百分比濃度為0.1％的BSA和0.05％的NaN3，調pH至6.2；加入EuC13溶液，即得稀土元素螯合物標記的anti-cTnT。根據本發明，所述的近紅外螢光化合物標記的另一個anti-cTnT的製備方法，包括步驟如下：將anti-cTnT單克隆抗體，用碳酸氫鈉溶液稀釋，加入近紅外螢光化合物溶解液，攪勻，室溫孵育；過柱分離純化，收集標記好的螢光化合物標記抗體，用磷酸鹽緩衝液稀釋混勻，即得近紅外螢光化合物標記的另一個anti-cTnT。根據本發明，所述的系列濃度的cTnT校準品的製備方法，包括步驟如下：用含質量百分比濃度為0.01％-0.5％PEG1000、1％-5％BSA、0.01％-0.05％表面活性劑的磷酸鹽緩衝液，按照0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的濃度稀釋溶解cTnT純品，混合均勻，即得系列濃度的cTnT校準品。根據本發明，利用上述均相螢光免疫試劑快速定量檢測肌鈣蛋白T的方法，包括步驟如下：先將稀土元素螯合物標記anti-cTnT溶液加入反應微孔中，再加入近紅外螢光化合物標記的另一個anti-cTnT溶液，最後加入cTnT校準品，37℃反應20分鐘後，用均相螢光免疫分析儀檢測螢光強度，依據相對螢光強度數據，製作cTnT濃度-螢光強度的標準曲線；將臨床檢測樣品代替cTnT校準品，重複上述過程，根據相對螢光強度數據對應標準曲線，得到肌鈣蛋白T含量。本發明的原理：本發明提供的快速定量檢測cTnT的均相螢光免疫法，其反應原理為雙抗體夾心法的均相螢光免疫法。待測樣品與適當比例的Eu3+和螢光標記抗體在液相均質介質中充分混和均勻，在此過程中樣品中的cTnT既能專一性地與Eu3+標記抗cTnT抗體充分結合，也能與螢光標記cTnT抗體充分反應，形成的Eu3+-anti-cTnT1—cTnT—anti-cTnT2-AlexaFluor647免疫複合物，螢光強度可用均相螢光免疫分析儀器定量測定，螢光強度與樣品中cTnT濃度成正比。本發明的有益效果如下：1、本發明採用均相螢光免疫快速檢測技術，利用螢光的高靈敏特點，同樣也避免了膠體金或者螢光cTnT乾式免疫試紙中的硝酸纖維素膜本身孔隙不均一特性對檢測準確度和重複性的不良影響。由於均相螢光免疫檢測中樣品與螢光標記抗體全過程都在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高檢測靈敏度和線性範圍，最低檢測限可達0.01ng/mL，線性範圍為0.1-50ng/mL。同時反應在液相進行也增加了樣品的稀釋倍數，消除了樣品的基質效應影響，使定量結果有很好的可重複性，提高了定量結果的精密度和準確度，可滿足臨床診斷大規模檢測的要求。2、應用本發明提供的試劑檢測人體內cTnT水平，成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套均相螢光免疫檢測儀。因此，可廣泛應用於各級醫療檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展。3、本發明可同時檢測高值和低值cTnT，尤其是低值cTnT，其對於心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。附圖說明圖1為本發明免疫檢測原理結構示意圖。其中，1：Eu3+標記anti-cTnT；2：AlexaFluor647標記anti-cTnT；3：校準品或待測樣本中cTnT；4：Eu3+-anti-cTnT—cTnT—anti-cTnT-AlexaFluor647免疫複合物。圖2為本發明試驗例1中cTnT濃度的標準曲線。圖3為本發明試驗例2中cTnT相關性分析曲線。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明作進一步說明，凡依照本發明公開內容所作出的本領域等同替換，均屬於本發明的保護範圍。實施例中「％」均為質量百分比。實施例1：定量檢測肌鈣蛋白T(cTnT)均相螢光免疫試劑的製備方法，包括如下步驟：1、標記用anticTnT的準備：選用純化的基因工程表達的抗cTnT單克隆抗體。Eu3+標記用抗cTnT單克隆抗體商品編號為19C7；螢光素標記用抗cTnT單克隆抗體商品編號為16A11和560。2、稀土元素螯合物標記anti-cTnT的製備：用3L0.9％NaCl於4℃透析鼠抗人cTnT單抗19C7溶液(3mg/mL)兩次，每次24hr。加水調濃度至1.5mg/mL。取0.6mL該抗體溶液，加入1mLNaHCO3(0.2mol/L)，並用1mol/LNaOH調pH至9.1。將20μLBHHCT甲醇溶液(30μg/mL)滴加到攪拌下的抗體溶液中，並繼續攪拌反應lhr。離心(10000rpm，10min)除去不溶物後，上SephadexG-50柱，用0.05mol/LNH4HCO3(pH＝8.0)洗脫，分離標記蛋白質和游離的標記物。紫外/可見分光光度計檢測各收集液的A330值，合併含有標記抗體的溶液。加入終濃度為0.1％的BSA和0.05％的NaN3，用1mol/LHCl調pH至6.2。分裝後-20℃儲存備用。用於免疫分析前，加入EuC13溶液(BHHCT與Eu3+等摩爾濃度)。用於免疫分析時，用標記物稀釋液稀釋使用，2-8℃分裝保存。3、AlexaFluor647標記抗體的製備：將抗cTnT單克隆抗體16A11、560，分別用0.1mol/L碳酸氫鈉溶液稀釋至1mg/mL，各取5mL抗體溶液，分別加入30mg螢光染料AlexaFluor647溶解液，攪勻，室溫孵育1小時，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的螢光染料標記抗體，用含0.01％PEG、1％BSA、5％甘油、0.01％表面活性劑吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4℃保存。4、系列濃度cTnT校準品的製備：用含0.08％PEG1000、4.5％BSA、0.045％表面活性劑吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液，按照0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的濃度稀釋溶解cTnT純品，混勻後於4℃保存。實施例2：本實施例的製備方法與實施例1基本相同，不同點在於：2、稀土元素螯合物標記anti-cTnT的製備方法是：用3L0.9％NaCl於4℃透析鼠抗人cTnT溶液(3mg/mL)兩次，每次24hr。加水調濃度至1.5mg/mL。取0.6mL該抗體溶液，加入1mLNaHCO3(0.2mol/L)，並用1mol/LNaOH調pH至9.1。將20μLBHHBCB甲醇溶液(30μg/mL)滴加到攪拌下的抗體溶液中，並繼續攪拌反應lhr。離心(10000rpm，10min)除去不溶物後，上SephadexG-25柱，用0.05mol/LNH4HCO3(pH＝8.0)洗脫，分離標記蛋白質和游離的標記物。紫外/可見分光光度計檢測各收集液的A330值，合併含有標記抗體的溶液。加入終濃度為0.1％的BSA和0.05％的NaN3，用1mol/LHCl調pH至6.2。分裝後-20℃儲存備用。用於免疫分析前，加入EuC13溶液(BHHBCB與Eu3+等摩爾濃度)。用於免疫分析時，用標記物稀釋液稀釋使用，2-8℃分裝保存。實施例3：本實施例的製備方法與實施例1基本相同，不同點在於：3、將抗cTnT單克隆抗體16A11、560，分別用0.1M碳酸氫鈉溶液稀釋至1mg/mL，各取5mL抗體溶液，分別加入40mg螢光素DyLight-DY647溶解液，攪勻，室溫孵育1.5小時，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的螢光素標記抗體，用含0.05％PEG600、3.5％BSA、10％甘油、0.05％表面活性劑的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4℃保存。實施例4：本實施例的製備方法與實施例1基本相同，不同點在於：3、將抗cTnT單克隆抗體16A11、560，分別用0.1mol/L碳酸氫鈉溶液稀釋至1mg/mL，各取5mL抗體溶液，分別加入50mg螢光染料CF647溶解液，攪勻，室溫孵育2小時，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的螢光染料標記抗體，用含0.03％PEG、5％BSA、10％甘油、0.05％表面活性劑的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4℃保存。實施例5：在臨床檢測中，實驗步驟為：先將50μL的稀土元素螯合物標記anti-cTnT溶液加入反應微孔中，再加入50μL的近紅外螢光化合物標記的另一個anti-cTnT溶液，最後加入cTnT校準品，37℃反應20分鐘後，用均相螢光免疫分析儀檢測螢光強度，依據相對螢光強度數據，製作cTnT濃度-螢光強度的標準曲線；將臨床檢測樣品代替cTnT校準品，重複上述過程，根據相對螢光強度數據對應標準曲線，得到肌鈣蛋白T含量。用均相螢光免疫分析儀檢測判讀結果。試驗例1：用均相螢光免疫分析儀檢測螢光強度，各濃度校準品檢測結果如下：cTnT濃度(ng/mL)0.10.55.02550相對螢光強度466685125331626316依據相對螢光強度數據，製作cTnT的標準曲線，如圖2所示，線性範圍為0.1-50ng/mL。cTnT的標準曲線計算公式為y＝113.43x+547.83，R2＝0.996。對濃度為0.1ng/ml校準品進行系列稀釋檢測，本方法最低檢測限可達0.01ng/mL。試驗例2：採用本發明試劑，用均相螢光免疫分析儀檢測48例臨床冠心病患者血清樣本，同步採用瑞士Roche公司的電化學法cTnT試劑進行對比檢測，進行相關性分析，結果如圖3所示。由圖3可知，本發明與已上市產品檢測結果一致，具有臨床等效性。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp