一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴xla及製備方法和應用的製作方法

2023-06-04 14:02:06 1

一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴xla及製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明為一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴XLA及製備方法和應用，其步驟：A、稱取重金屬鎘含量為50mg/Kg的用於重金屬修復的盆栽試驗土樣於加有玻璃珠的無菌水中，在恆溫搖床上振蕩、靜置後，取上清液進行系列稀釋；B、將不同稀釋倍數的稀釋液塗布在含有60mM鎘的馬丁平板上，靜止片刻，倒置於恆溫培養箱中培養；C、將平板上生長的單菌落進行劃線分離純化，然後重新塗布到上述含鎘的馬丁平板上進行培養；D、分離篩選後，得到對鎘具有穩定抗性的淡紫擬青黴XLA，在PDA斜面上保存備用。淡紫擬青黴XLA已保藏，保藏編號為CCTCCNO：M2012135。XLA的活菌和死菌體都可以高效吸附移除重金屬汙水中的重金屬鎘，成本低廉，工藝簡單，具備高效修復重金屬汙染土壤和水體的潛力。
【專利說明】—種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴XLA及製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於水體環境治理領域。更具體涉及一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴XLA,同時還涉及一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的製備方法，還涉及一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的用途。
【背景技術】
[0002]20世紀以來，工業化的發展對人類社會進步起到巨大的推動作用，但同時也給水體和土壤帶來了嚴重的環境汙染，尤其是重金屬汙染，進而影響到人類健康(Hsu etal., 2006; Beyer, 1985)，一系列的重金屬中毒、重金屬超標事件，例如鎘汙染造成的日本「痛痛病」、汞汙染引起的水俁病等(Luigi C.，et al，2006 ;馬小凡等，2004)。重金屬汙染是目前最主要的環境問題之一。
[0003]鎘(Cd)是一種生物體 非必需金屬元素，在低濃度條件下便能對細胞產生毒性。由於人類的活動，鎘通過各種途徑進入環境中，造成嚴重的鎘汙染。鎘在環境中和生物體內具有穩定積累和不易消除的特點。鎘遷移轉化的最大特點在於不易被生物體分解轉化並排出體外，不易隨水移動，而是沿食物鏈逐級往上傳遞並通過富集作用使人體慢性中毒。1992年鎘的化合物被國際癌症研究中心(IARC)確認為IA級致癌物；被美國毒性物質管理委員會(ATSDR)列為第六位危害人體健康的有毒物質(黃寶聖，2005)。目前，尋找土壤和水體的鎘汙染治理策略成為一個巨大的挑戰(BastaN.T.，et al.2001;McGregorD B, et al.，2000)。
[0004]對重金屬汙染的土壤及水體的處理方法有化學法、離子交換法、吸附法、電解法、化學氧化還原法、電化學處理法、反滲透法和膜分離法等，但均由於技術繁瑣，易導致二次汙染和處理成本相對過高等限制因素無法投入實際生產應用中(Kratochvil D, Volesky
B,1998)。生物吸附法修復重金屬汙染土壤及水體是指通過生物體與重金屬顆粒間的相互作用來減輕重金屬對於環境的危害(Volesky B.，1999)。在生物修複方法所用的生物材料中，真菌材料具有生物量大、重金屬吸附容量大、吸附後金屬易回收等眾多優點(高偉等，2005; Bhainsa K.C., Souza S.F., 1999; Sud D, et al., 2008 ；ffang J, Chen
C,2006;Goksungur Y, et al.，2005)。而微生物代謝物質如胞外多糖，幾丁質等也參與重金屬的吸附與固定化過程(May H.et al, 1993; Gadd GM, White C, 1993; Brim H., etal, 2000;Galun Μ.，et al, 1983) 0這主要是基於微生物細胞表面的功能基團，如羥基，羰基，巰基和胺基基團等，這些功能基團能夠與重金屬陽離子有效地結合，從而具有對重金屬的吸附效應(VoleSky，B.，Holan, Z.R, 1995)。真菌對重金屬的生物吸附是汙染治理研究和運用的熱點。
[0005]目前，隨著社會經濟的發展，重金屬汙染日益嚴重，建立經濟，高效的重金屬汙染修復體系顯得尤為重要。微生物種類繁多，繁殖迅速；吸附後的微生物細胞還可通過化學試劑解吸附，來回收生物材料。同時，用於重金屬修復的微生物可以對某些重金屬吸收、沉澱、氧化和還原作用減少重金屬濃度，從而降低毒性。本發明利用微生物在受到自然環境重金屬脅迫而產生耐性這個特點，對抗鎘微生物進行篩選，獲得並提供了可用於生物治理重金屬汙染的高效耐受菌株。同時，本發明將該菌株用於處理重金屬汙染水體，發現該菌株具有良好的處理能力和運用潛力。本發明旨在為微生物修復重金屬汙染提供對多種重金屬具有相對高吸附能力且性能穩定的抗性菌株。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是在於提供了一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA。本發明從用於重金屬鎘汙染修復的盆栽試驗土樣中分離了一株絲狀真菌。該菌株在實驗室條件下能顯著吸附重金屬鎘；同時，本發明還涉及菌活性狀態對吸附的影響以及該菌在重金屬汙染水體修複方面的實際應用，結果顯示本發明所提供的絲狀真菌在重金屬汙染的土壤和水體治理和商業化應用上均具有廣闊的前景。
[0007]本發明的另一個目的是在於提供了一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的製備方法，該製備方法簡便快捷，所獲取的菌體具有高吸附重金屬的能力，且吸附過程不受營養條件的限制。
[0008]本發明再一個目的是在於提供了一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA在重金屬鎘汙染治理中的應用。絲狀真菌XLA活菌和死菌都可以高效的吸附移除重金屬汙水中的重金屬鎘，達到治理重金屬汙染的目的，有效地降低生產成本，簡化處理工藝，從而為大規模製備重金屬汙染廢水淨水劑提供了可能，具備商業化發展的潛力。
[0009]為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施:
[0010]一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的製備方法，其步驟是分離、純化和復篩。具體過程為:
[0011]A、稱取重金屬鎘含量為50mg/Kg的用於重金屬修復的盆栽試驗土樣IOg於90ml帶有5個0.5mm玻璃珠的無菌水中，於28°C恆溫搖床上200r/min振蕩30min,靜置Imin後，取上清液進行10倍系列稀釋；
[0012]B、將IOOyL不同稀釋倍數的稀釋液塗布在含有60mM鎘的馬丁平板上，靜止片刻，倒置於28°C恆溫培養箱中培養5d ；
[0013]C、將平板上生長的微生物進行劃線分離純化，然後重新塗布到上述含鎘的馬丁平板上進行培養；
[0014]D、經10次分離篩選後，保存對鎘具有穩定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進行保存，備用。
[0015]依據上述方法， 申請人:從用於重金屬鎘汙染修復的盆栽試驗土樣中，利用真菌選擇性培養基進行篩選，分離得到了一株能在含60mM鎘的馬丁孟加拉紅培養基上生長的絲狀真菌， 申請人:將其命名為XLA。經鑑定該絲狀真菌為淡紫擬青黴(PaecilomycesIilacinus)，該菌株的保存及產孢子培養基為PDA培養基。 申請人:於2012年4月24日將該菌株送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號=CCTCC NO:M2012135，分類命名:淡紫擬青黴XLA Paecilomyceslilacinus XLA0
[0016]絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的特性如下:
[0017]①生物學特性:絲狀真菌，專性需氧，最適生長溫度20°C-28°C，生長較迅速，但是在35°C以上產孢能力下降，在PDA培養基中產孢量大，菌落呈現氈狀，中部隆起，培養早期菌落呈現白色，後期產孢子變為酒紅色。
[0018]②遺傳學特性:結合形態學觀察和分子生物鑑定確認該菌為淡紫擬青黴菌(Paecilomyces lilacinus)。
[0019]③培養條件:保存該真菌及獲取其孢子時所使用的培養基為PDA培養基；分離篩選該真菌所用的為馬丁培養基:葡萄糖10g，蛋白腖5g，MgSO4 0.5g，蒸餾水1000ml，pH自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。用於吸附實驗及測試其對重金屬耐受性用礦物鹽培養基(MM):葡萄糖20g,硫酸銨5g,磷酸二氫鉀15g,無水硫酸鎂0.6g,無水氯化韓0.6g,七水硫酸亞鐵0.005g, 一水硫酸錳0.0016g,七水硫酸鋅0.0014g,氯化鈷0.002g,蒸餾水IOOOml溶解，調節pH至5.5，115°C高壓蒸汽滅菌15min。培養該菌可以孢子的形式進行接種:以2%體積比的吐溫-80衝洗PDA斜面上的孢子，然後用0.2%體積比的吐溫-80稀釋至需要的孢子濃度後接種，然後進行28°C，150r/min搖瓶培養。
[0020]④功能特性:具有對多種重金屬的耐受性。絲狀真菌XLA對不同重金屬離子的耐受性檢測結果為:液體培養條件下對鎘(Cd2+)130mM、鈷(Co2+)45mM、銅(Cu2+)80mM、鋅(Zn2+) 220mM、鉻(Cr3+)60mM、鉻(Cr6+)5mM、鎳(Ni2+) 24mM等重金屬有較好的耐受性，固體培養條件下則分別為 265mM、50mM、80mM、145mM、35mM、4mM、16mM。
[0021]一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA在重金屬汙染水體及土壤的生物修復中的應用，其步驟是:
[0022](I)靜態鎘的吸附:
[0023]將菌株XLA在PDA培養基上培養4d產生大量孢子，製備孢子懸液，然後按照1:100的比例接種到200毫升的新鮮礦物鹽培養基中培養5d，過濾收集菌體並進行真空冷凍乾燥處理後，將菌體打散至鬆散狀態，然後進行鎘的吸附實驗。
[0024]將0.002g凍幹菌體 加入至含有20mL鎘溶液的50mL離心管中進行，置於28°C恆溫搖床中，150r/min反應240min，反應過程中分別在0、5、15、30、45、60、120、180和240min取100 μ L上清液，稀釋後通過石墨爐原子吸收分光光度計進行鎘含量分析。
[0025](2)吸附-解吸附實驗:
[0026]選用凍幹處理後的菌體進行鎘的吸附實驗。具體吸附實驗條件:鎘溶液濃度為500mg/L、pH 4.0、0.lg/L凍幹菌體充分吸附4h，吸附飽和後上清取樣，樣品稀釋後用石墨爐原子吸收分光光度計測定吸附前後上清液中鎘的含量，計算吸附到菌體表面的鎘的含量。過濾收集吸附後樣品並進行冷凍乾燥。分別選取去離子水、0.lmol/L硝酸、0.lmol/L鹽酸、2%質量體積比的EDTA、0.lmol/L氫氧化鈉作為解吸附劑，以0.0lg吸附樣品/20ml解吸附劑的體系反應4h，選擇最適解吸附劑，並對最適解吸附劑作用下解吸附動力學進行研究。
[0027](3)菌株的活性狀態對鎘吸附的影響:
[0028]將菌株XLA在PDA培養基活化4天後產生的孢子收集製成懸液，然後按照1:100的比例接種到200ml的新鮮礦物鹽培養基中培養5d，過濾收集菌體(培養收集活性狀態菌體的三角瓶為底部帶稜的三角瓶，培養收集死菌的三角瓶為普通三角瓶)。活菌收集後儘量除去水分，取一小部分80°C烘乾至恆重測的菌體含水量。死菌收集後進行冷凍乾燥一高壓蒸汽滅菌一冷凍乾燥一研磨後過300 μ m孔徑的篩子製成死菌粉末。分別對兩種狀態的菌進行鎘吸附實驗，實驗在含有20mL鎘溶液的50mL離心管中進行，吸附體系條件為活菌:pH5.0、鎘濃度300mg/l、吸附120min、活菌乾重0.5g/l ;死菌:pH 5.0、鎘濃度300mg/l、吸附45min、死菌重0.5g/l。菌體吸附達到飽和後，用石墨爐原子吸收分光光度計測定吸附前後上清液中鎘的含量，從而獲得其吸附能力。
[0029]將吸附飽和的菌體回收，金屬洗脫液去除結合在菌表面的鎘後進行酸消化處理，同樣用石墨爐原子吸收分光光度計測定菌體中鎘的含量。具體酸消化過程如下:菌體乾重
0.1-0.5g稱重加入消化管底部，滴Iml去離子水將樣品潤溼。加5ml濃硫酸，與樣品混勻後放置過夜再加約0.5ml高氯酸到消化管，消化爐低溫180°C消化0.5h，300°C高溫消煮至透明無色則消化完成。
[0030](4)電鍍廢水中重金屬移除實驗:
[0031]發明人分別進行了一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA活菌與死菌對採集的電鍍廢水中鎘去除能力的實驗:按實施例3.4中描述收集活菌以及製備死菌，兩種菌體均用於移除電鍍廢水中的鎘離子。
[0032]一種絲狀真菌 淡紫擬青黴XLA對電鍍廢水中鎘的實際移除實驗體系為:20mL電鍍廢水(Cd2+:0.13mg/L)、乾重0.01g/l菌體、28°C和150r/min處理2h後過濾收集上清液，按照前述方法測定吸附前後鎘的含量。另外發明人再次利用一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA死菌和活菌處理絮凝劑處理過後的汙水，以了解一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA在去除低濃度汙水中的實際應用能力。
[0033] 申請人:利用絲狀真菌XLA進行靜態鎘吸附實驗後，顯示該菌株能夠快速高效吸附重金屬鎘。該菌在不同活性狀態下對重金屬鎘吸附性能具有明顯差異，其中活性菌體的吸附能力更高。隨後進行的XLA對電鍍廢水中重金屬的移除實驗結果證明，該絲狀真菌XLA可以在實際應用中高效吸附並去除汙染水體中的鎘。
[0034]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0035](I)菌體原料易獲取，成本低廉，處理工藝簡單。
[0036](2)利用絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的凍幹菌體作為生物吸附劑不僅可以高效吸附移除汙水中的重金屬離子，同時還具備良好的吸附劑再生能力，具備商業化應用的潛能。
[0037](3)絲狀真菌淡紫擬青黴XLA對多種重金屬具有高耐受性和高吸附特性，對環境中的重金屬具有較高的固定能力，降低其生物毒害性。該菌株可以在高濃度重金屬水平下存活，因此以淡紫擬青黴XLA作為土壤重金屬吸附劑可實現對土壤中重金屬長期固定化的同時，避免向環境中多次施加重金屬的吸附劑，具備高效修復重金屬汙染土壤和水體的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為一種絲狀真菌XLA凍幹菌體的靜態鎘吸附量測定結果示意圖。
[0039]圖2為一種絲狀真菌XLA對鋪的解吸附劑的選擇不意圖。
[0040]圖3為一種絲狀真菌XLA對鎘的解吸附動力學結果示意圖。
[0041]其中，實驗採用最佳解吸附劑為2%質量體積比的EDTA。
[0042]圖4為一種絲狀真菌XLA死菌與活菌對電鍍廢水以及絮凝作用後廢水中鎘移除結果示意圖。具體實施方案
[0043]以下敘述是根據本發明實施方案的實施例，應該說明的是，本發明的實施例對於本發明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品參考《分子克隆實驗指南》所描述的內容(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京)。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規操作技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。
[0044]實施例1:一種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA的製備方法，其步驟是:分離、純化和復篩。
[0045]I)分離鎘抗性菌株XLA
[0046]A、稱取重金屬鎘含量為50mg/Kg的用於重金屬修復的盆栽試驗土樣IOg於90ml帶有5個0.5mm玻璃珠的無菌水中，於28°C恆溫搖床上200r/min振蕩30min,靜置Imin後，取上清液進行10倍系列稀釋；
[0047]B、將100μ L不同稀釋倍數的稀釋液塗布在含有60mM鎘的馬丁平板上，靜止片刻，倒置於28°C恆溫培養箱中培養5d ；
[0048]C、將平板上生長的微生物進行劃線分離純化，然後重新塗布到上述含鎘的馬丁平板上進行培養；
[0049]D、經10次分離篩選後，保存對鎘具有穩定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進行保存，備用。
[0050] 申請人:將上述分離得到的菌株中的一株菌命名為絲狀真菌XLA。
[0051 ] 2 )菌株XLA的生物學特性
[0052]①生物學特性:絲狀真菌，專性需氧，最適生長溫度20°C-28°C，生長較迅速，但是在35 V以上產孢能力下降，在PDA培養基中產孢量大，菌落呈現氈狀，中部隆起，培養早期菌落呈現白色，後期產孢子變為酒紅色。
[0053]②培養條件:保存該真菌及獲取其孢子時所使用的培養基為PDA培養基；分離篩選該真菌所用的為馬丁培養基:葡萄糖IOg,蛋白腖5g,MgSO40.5g,蒸懼水1000ml,pH自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。用於吸附實驗及測試其對重金屬耐受性用礦物鹽培養基(MM):葡萄糖20g,硫酸銨5g,磷酸二氫鉀15g,無水硫酸鎂0.6g,無水氯化韓0.6g,七水硫酸亞鐵0.005g, 一水硫酸錳0.0016g,七水硫酸鋅0.0014g,氯化鈷0.002g,蒸餾水IOOOml溶解，調節pH至5.5，115°C高壓蒸汽滅菌15min。培養該菌可以孢子的形式進行接種:以2%體積比的吐溫-80衝洗PDA斜面上的孢子，然後用0.2%體積比的吐溫-80稀釋至需要的孢子濃度後接種，然後進行28°C，150r/min搖瓶培養。
[0054]3)分子生物學鑑定
[0055]採用CTAB法提取分離篩選得到的菌株的總DNA，並作為PCR模板，以ITS1-1TS4引物進行PCR擴增上述分離菌株的ITS保守序列(部分18S rRNA基因，ITS1，5.8S rRNA基因，ITS4，28S rRNA基因)，以用於菌株的分子鑑定。結合形態學觀察和分子生物鑑定確認該菌為淡紫擬青黴菌(Paecilomyces lilacinus)。 申請人:於2012年4月24日將該菌株送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為=CCTCC NO:M2012135。[0056]實施例2:
[0057]—種絲狀真菌淡紫擬青黴XLA在重金屬鎘汙染治理中的應用，其應用過程是:
[0058]I)絲狀真菌XLA對多種重金屬的耐受性檢測
[0059]液體培養條件:接種前向礦物鹽(MM)液體培養基中添加一定量過濾滅菌的重金屬母液至需要濃度，然後按1%接種量接種淡紫擬青黴XLA孢子懸液，培養7d，觀察其生長狀況。
[0060]固體培養條件:接種孢子至礦物鹽(MM)液體培養基，搖床培養至菌絲球剛好形成。將含有一定濃度重金屬的礦物鹽(MM)固體平板劃分三等分區域，分別在每一區域以點種法接種直徑相同的菌絲球，28°C培養7天。每24小時記錄一次菌絲球直徑。用Sigmaplot10.0分析不同濃度平板上隨著時間變化菌落大小變化趨勢。能使菌落直徑基本無變化的重金屬濃度即為該菌的最低抑菌濃度。
[0061]表I (見下表)為淡紫擬青黴XLA對不同重金屬離子的耐受性。液體培養條件下不同重金屬對淡紫擬青黴XLA的最低抑菌濃度分別為鎘(Cd2+)130mM、鈷(Co2+)45mM、銅(Cu2+) 80mM、鋅(Zn2+) 220mM、鉻(Cr3+) 60mM、鉻(Cr6+) 5mM、鎳(Ni2+) 24mM ；固體培養條件下則分別為265mM、50mM、80mM、145mM、35mM、4mM、16mM。這表明本發明所提供的淡紫擬青黴XLA
對多種重金屬的毒害具有較強耐受性。
[0062]表I (本實施例中絲狀真菌XLA在礦物鹽培養基中對不同重金屬離子耐受性檢測結果)
【權利要求】
1.一種絲狀真菌淡紫擬青黴，其特徵在於，淡紫擬青黴菌(Paecilomyces Iilacinus)XLA, CCTCC NO:M2012135o
2.權利要求1所述的一種`絲狀真菌淡紫擬青黴XLA在重金屬鎘汙染治理中的應用。
【文檔編號】C12N1/14GK103451103SQ201210180738
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2012年6月4日
【發明者】陳雯莉, 黃巧雲, 夏璐, 朱偉, 徐興健, 張哲軼 申請人:華中農業大學