一種蛻皮激素受體基因EcRdsRNA及其在控制蚜蟲危害中的應用的製作方法

2023-06-04 14:05:36

一種蛻皮激素受體基因EcR dsRNA及其在控制蚜蟲危害中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛻皮激素受體相關基因EcR?dsRNA在控制蚜蟲危害中的應用。本發明提供的dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。本發明的實驗證明，本發明得到麥長管蚜蛻皮激素受體相關基因EcR?cDNA的dsRNA，採用體外飼餵dsRNA方法，可抑制麥長管蚜體內EcR基因的表達，導致麥蚜生長發育受阻並產生致死效應。
【專利說明】-種蛻皮激素受體基因 EcR dsRNA及其在控制蚜蟲危害中 的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種蛻皮激素受體基因 EcR dsRNA及其在控 制蚜蟲危害中的應用。

【背景技術】
[0002] 麥蚜（尤其是麥長管蚜）是危害中國小麥生產的主要害蟲之一，據統計，中國每年 小麥蚜蟲危害面積可高達〇. 17億公頃，佔小麥總種植面積的62%，造成減產15%-30%，嚴 重時可高達50%。近年來，由於全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和 適應性顯著增強，其危害日趨嚴重。目前，蚜蟲防治以噴灑農藥為主，但大量使用農藥，不僅 對人畜有害，而且造成了嚴重的環境汙染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的 最有效途徑，但由於現有種質資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機制尚不明確，常規育種難 以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因並通過基因工程培育小麥抗蚜新種質具有重要意義。
[0003] 植物介導的RNAi技術已成為農作物抗蟲基因工程的熱點之一，通過寄主植物表 達相應昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物後沉默其相應的基因從而達到控制害蟲危 害的目的。RNAi現象其作用過程是雙鏈RNA(dsRNA)進入生物體內，被Dicer酶切割成 21-23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導沉默複合物結合，與互補序列的靶mRNA結合，被Dicer 識別，造成靶基因表達量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼餵或注射來篩選RNA靶標基 因，導致靶標基因表達和沉默，已經廣泛應用於昆蟲生長發育關鍵基因的鑑定和功能分析。 孟山都公司通過植物介導的昆蟲腸道特異基因 RNAi技術成功獲得了抗玉米根螟的轉基因 玉米，有效緩解了長期應用Bt轉基因玉米誘發昆蟲產生抗性等問題，目前已完成生產性試 驗。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質和棉酚的耐受性， 試驗表明，利用表達棉鈴蟲P450基因 dsRNA的轉基因菸草和棉花葉片飼餵棉鈴蟲幼蟲，可 導致幼蟲體內P450基因的表達量下降，同時幼蟲發育受阻，表現出抗棉鈴蟲性能；Zha等從 褐飛蝨中腸中克隆了 3個高度表達的基因：NlHTl、Nlcar和Nltry，構建載體，轉化水稻，褐 飛蝨取食轉基因水稻後，體內3種基因的mRNA表達水平下降了 40%到70%，並且在水稻的 篩管部發現了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達） 和Rack-Ι (主要在腸道中表達）2個基因分別導入菸草和擬南芥中，用轉基因植物飼餵桃 蚜，導致桃蚜體內的MPC002或Rack-Ι的表達量降低了高達60%，蚜蟲的產仔數目減少。
[0004] 小麥抗蚜蟲種質資源缺乏，抗性機制尚不明確，常規育種難以奏效，每年給農業生 產造成巨大經濟損失。迫切需要挖掘和鑑定新型抗蚜基因並通過基因工程育種提高小麥抗 蚜特性。
[0005] 蚜蟲是不完全變態發育，發育過程中要經歷蛻皮。已知蛻皮激素與它的核受 體EcR和異源二聚體配體USP在細胞核內形成轉錄複合體，調控EcR和USP激素接受子 3 (HR3)，E75, Broad Complex (BR-C)，E93, bFTZ-Fl和E74等轉錄因子的表達，這些轉錄因子 再進一步調控下遊效應基因如蛋白酶的表達，進而調控蚜蟲的蛻皮、生長發育和繁殖。


【發明內容】

[0006] 本發明的一個目的是提供了 dsRNA。
[0007] 本發明提供的dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補序列所示 的核苷酸組成的雙鏈RNA。
[0008] 上述dsRNA的編碼基因或含有該編碼基因的DNA片段也是本發明保護的範圍，上 述dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列1所示的核苷酸。
[0009] 上述dsRNA或上述的編碼基因在如下1)_4)中至少一種中的應用也是本發明保護 的範圍：
[0010] 1)防治蚜蟲或製備防治蚜蟲產品；
[0011] 2)促進蚜蟲死亡或製備促進蚜蟲死亡產品；
[0012] 3)抑制蚜蟲生長中或製備抑制蚜蟲生長產品；
[0013] 4)抑制蚜蟲體內生長發育相關基因 ECR的表達或在製備抑制蚜蟲體內生長發育 相關基因 ECR的表達產品。
[0014] 上述應用為將上述dsRNA導入蚜蟲，實現防治蚜蟲、促進蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長 和/或抑制蚜蟲體內生長發育相關基因 ECR的表達；所述導入具體為飼餵；
[0015] 所述蚜蟲具體為麥長管蚜。
[0016] 本發明的另一個目的是提供具有功能的產品，其活性成分為上述dsRNA或其編碼 基因；
[0017] 所述功能為如下1)-4)中任意一種：1)防治蚜蟲；2)促進蚜蟲死亡；3)抑制蚜蟲 生長；4)抑制蚜蟲體內生長發育相關基因 EcR(序列1)表達。
[0018] 所述蚜蟲具體為麥長管蚜。
[0019] 本發明的實驗證明，本發明得到麥長管蚜蛻皮相關基因 EcR的dsRNA，採用體外飼 餵dsRNA方法，進行了利用RNAi技術沉默麥長管蚜體內EcR基因，導致麥長管蚜產生致死 效應，並且隨著dsRNA濃度增大和飼餵時間延長，麥長管蚜的死亡率均逐漸增加。結果表明 蚜蟲生長發育相關基因 EcR的保守序列可應用於通過植物介導的RNAi技術提高小麥抗蚜 性的研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為基因 EcR和GFP的PCR擴增情況
[0021] 圖2為目的基因和對照基因的dsRNA

【具體實施方式】
[0022] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0023] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0024] 下述實施例中麥長管蚜（錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的 研究.植物保護，1982, 1:14-15。公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得）由中國 農業科學院植物保護研究所提供，飼養蚜蟲的小麥品種為科農199,將蚜蟲接種到小麥幼苗 上，放入人工氣候箱中（溫度（20±2)°C，溼度60%-80%，光周期L : D = 16 : 8)進行 繁殖。
[0025] 質粒提取試劑盒購自Biomega公司，內切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7體外 轉錄試劑盒購自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaq DNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit購自Qiagen公司，各種胺基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。
[0026] 實施例1、生長發育相關基因 EcR dsRNA的獲得
[0027] 1、麥長管蚜總RNA的提取和cDNA的合成
[0028] 分別取約20頭麥長管蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總 RNA，用RNA Cleaning Kit進行純化，反轉錄合成cDNA第一鏈，操作步驟均參考試劑盒說明 書。
[0029] 2、引物設計與基因克隆
[0030] 根據豌豆蚜和桃蚜EcR基因保守序列（genbank登錄號分別為NM_001159360和 EF174334,提交時間分別為2012年8月31日和2007年4月17日），利用Primer Primer5. 0 軟體設計引物P1 (表1)，由北京華大基因公司合成，以麥長管蚜cDNA為模板擴增並測序得 到麥長管蚜蛻皮相關基因 EcR(序列1)。綠色螢光蛋白基因（GFP)片段從國家小麥改良中 心實驗室保存的GFP質粒上擴增，利用Primer Primer5. 0軟體設計引物P2(表1)。
[0031] PCR 反應體系為 10 X PCR Buffer5 μ L、dNTP (2. 5mmol · Γ1) 4 μ L、rTaqO. 5 μ L， Forward primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、Reverse primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、cDNA/GFP 質粒 lyL，用 ddH20 補足至 50yL。PCR 的反應條件為 94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s， 39 個循環；72°C lOmin ;4°C保存。
[0032] 以麥長管蚜的cDNA為模板，用PI作為引物進行擴增，得到472bp PCR產物（含 40bp的T7啟動子序列），經過測序，該472bp PCR產物具有序列表中的序列1 (可人工合 成）所示的核苷酸。
[0033] 以GFP質粒為模板，用P2作為引物進行擴增，得到360bp PCR產物（含40bp的T7 啟動子序列），其具有序列表中的序列3 (可人工合成）所示的核苷酸。
[0034] 將上述PCR電泳結果如圖1所示，M :Trans2K DNA marker ;1 :EcR基因；2 :GFP，可 以看出得到目的片段。
[0035] 表1為PCR擴增引物
[0036]

【權利要求】
1. dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的 雙鏈RNA。
2. 權利要求1中所述dsRNA的編碼基因或含有該編碼基因的DNA片段。
3. 根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於：所述dsRNA的編碼基因的核苷酸序 列為序列表中序列1。
4. 權利要求1所述dsRNA或權利要求2所述的編碼基因在如下1)-4)中至少一種中的 應用： 1) 防治蚜蟲或製備防治蚜蟲產品； 2) 促進蚜蟲死亡或製備促進蚜蟲死亡產品； 3) 抑制!牙蟲生長中或製備抑制!牙蟲生長廣品； 4) 抑制蚜蟲體內生長發育相關基因 EcR的表達或在製備抑制蚜蟲體內生長發育相關 基因 ECR的表達產品。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於：所述應用為將權利要求1或2所述dsRNA 導入蚜蟲，實現防治蚜蟲、促進蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長和/或抑制蚜蟲體內生長發育相關 基因 EcR的表達。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於： 所述導入為飼喂。
7. 根據權利要求4-6中任一所述的應用，其特徵在於： 所述蚜蟲為麥長管蚜。
8. -種具有功能的產品，其活性成分為權利要求1所述dsRNA或權利要求2所述的編 碼基因，所述功能為如下1)_4)中任意一種：1)防治蚜蟲；2)促進蚜蟲死亡；3)抑制蚜蟲生 長；4)抑制蚜蟲體內生長發育相關基因 EcR表達。
【文檔編號】C12N15/113GK104109672SQ201410328241
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】夏蘭琴, 陳紅梅, 孫永偉 申請人:中國農業科學院作物科學研究所