基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法

2023-06-04 10:13:06

專利名稱：：基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法
技術領域：
：本發明涉及一種食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的精確定量方法，特別是涉及採用免疫法測量多種獸藥和飼料添加劑混合殘留的情況下，且測量用抗體與多種殘留物間存在交叉反應時的各組分精確定量方法。
背景技術：
：現在食品安全中有害物質的殘留是一項突出的問題，尤其是動物源性食品，如肉類、禽類、奶、蛋等等，其在人們日常膳食結構中所佔比例越來越大。動物源性食品的安全問題主要包括獸藥殘留、飼料添加劑殘留、工業廢物的汙染、病原微生物及寄生蟲感染等。本發明針對基於免疫法的獸藥和飼料添加劑殘留的檢測方法進行改進。動物源性食品中常見的獸藥和飼料添加劑來源有很多。一是濫用獸藥，如磺胺類藥物等等；二是惡意添加的化學物質，如鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、類固醇激素、蘇丹紅、三聚氰胺等等；三是治療用抗生素殘留，如青黴素、四環素、氯黴素等等。這些殘留對人體健康造成很大的危害。隨著食品安全法的實施，我國大大加強了監管和監測的力度。現在針對這些獸藥和飼料添加劑的檢測方法有很多，國家標準也有相應的規定。例如抗生素的殘留，採用微生物測定法；三聚氰胺的檢測採用液相色譜法；瘦肉精採用色譜與質譜聯用的方法等等。這些檢測技術均比較複雜、耗時長，不適宜多樣本的快速檢測。因此，為了適應實際應用場合的需要，一些快速檢測的新技術得到了發展。其中最具代表的就是基於免疫法的檢測技術，其檢測速度快、精度高。具體包括酶聯免疫法、免疫層析法、免疫生物傳感器等等。大量基於免疫法的產品也相應產生，主要是免疫試紙和免疫試劑盒。這些檢測技術採用殘留物與其抗體的特異性反應，能夠快速、準確的檢測出食品中的殘留，檢測限也遠遠滿足國家標準的規定。酶聯免疫法的發展最為迅速和廣泛，針對各種有害殘留物的檢測試劑盒都在商品化出售。以免疫法為基礎的檢測技術，均利用了被測物質與其相應抗體的特異性結合作用，其原理的不同只是在於，當兩者的吸附作用發生時，各種方法引起的檢測信號改變的不同。例如酶聯免疫法，其原理是將抗體或抗原進行酶標記，通過檢測酶與底物的顯色反應，間接的反應抗體與被測物的結合情況；螢光免疫法是對抗體或抗原進行螢光色素標記，通過檢測螢光物質的量，反映抗體與被測物結合的量；放射免疫技術是採用放射性核素對抗體或抗原進行標記，通過檢測放射性核素的量間接檢測抗體與被測物的結合；而基於表面等離子體共振的免疫傳感器其原理是通過光學信號的變化反應被測物與抗體的結合。可以看出，諸多的免疫檢測技術均是基於被測物與其抗體的特異性結合作用，需要用到抗體為耗材，因此這種檢測技術勢必受到抗體製備技術發展的限制。由於有些現有技術所製備抗體與多種抗原存在交叉反應，因此，免疫法存在無法精確測量多種混合殘留物的弊病。以磺胺類藥物為例，具體包括磺胺甲基異惡唑(SMZ)、磺胺異唑(SIZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、磺胺脒(SG)、酞醯磺胺噻唑(PST)、琥珀醯磺胺噻唑(SST)等等。這些藥物均是氨苯磺胺的衍生物，具有相似的化學結構式，因此，以其中某個藥物作為抗原所製備出的抗體對該藥物以外的其他磺胺類藥物也有交叉反應，交叉反應率很高，10%-200%不等。因此，採用某種抗體進行檢測時，無法區分具體的磺胺藥物。抗生素的檢測也是類似，在同族的抗生素中，各個抗生素具有相似的結構。例如P-內醯胺類抗生素，其化學結構式都含有一個P-內醯胺環，具體有青黴素G、氨苄青黴素、羥氨苄青黴素、頭孢菌素、頭孢氨苄等等；氨基糖苷類抗生素，其化學結構式均是以氨基環醇與氨基糖縮合而成的苷，具體有鏈黴素、卡那黴素、慶大黴素等等；大環內酯類抗生素均含一個大環內酯作為配糖體，以苷鍵和13個糖相連，具體有紅黴素、白黴素等等；四環類抗生素以四並苯為母核，有四環素、土黴素等等。由於化學結構式的相似，同類抗生素的抗原決定簇往往也相同或相似，因此，同類抗生素的抗體也具有交叉反應。類似的還有其他添加劑，例如沙丁胺醇、克倫特羅、特布他林等，其均屬於P_興奮劑，具有相似的化學結構，其抗體往往對這些物質均有交叉反應，如有的公司製備的沙丁胺醇抗體對克倫特羅的交叉反應率達到13%。因此，當被測食品中含有多種相似化學結構的殘留物時，採用免疫法檢測，某一種抗體可能與多種殘留物均發生特異性結合，並且該抗體對不同的殘留物的反應效率也不同，這些複雜的情況導致無法精確的測量出單個殘留物的含量，總量測定也不準確。現有的檢測用試紙、試劑盒都是針對某一種抗生素的，比如青黴素G檢測試紙/試劑盒、頭孢氨苄檢測試紙/試劑盒、鏈黴素檢測試紙/試劑盒、慶大黴素檢測試紙/試劑盒、氯黴素檢測試紙/試劑盒等等。也有針對多種物質的檢測試紙/試劑盒，如磺胺類藥物檢測試劑盒，其檢測結果為磺胺類藥物的殘留總量。在一些國際標準以及我國的國家標準中，對各個殘留物的最低限量值都是分別制定的，因此，基於免疫法的檢測技術要想真正滿足測量要求，還需要進一步的發展和改進。
發明內容本發明要解決的技術問題是，提供一種用於免疫法測量具有交叉反應的多種殘留物的精確定量方法，解決現有技術中所製備抗體與多種抗原存在交叉反應，免疫法無法精確測量多種混合殘留物的弊病。本發明所採用的技術方案是首先獲得多種被測物相應的抗體對所有的其他被測物的完全抑制率，並採用多種抗體分別對被測樣品進行測量，獲得初步測量結果，最後根據抗體與被測物之間的交叉反應情況建立數學模型，修正初步測量的結果，最終獲得精確的多組分含量。所述方案的第一步需要首先獲得測量用抗體與被測物的完全抑制率，其是通過向已知濃度的被測物溶液中加入抗體，測量兩者完全反應時所需的最少抗體量得到的。此處完全抑制率是指，當殘留物與抗體存在抗原抗體免疫反應時，兩者完全反應所需抗體的最小量與殘留物量的比值；當殘留物與抗體不存在抗原抗體免疫反應時，完全抑制率為0。當被測樣品中含有N種殘留物時，需要首先獲得相應的N種測量用抗體分別對這N種殘留物的完全抑制率(一般測量某種殘留物採用的是該殘留物作為抗原製備的抗體，兩者的交叉反應率往往為100%)。測量方法為分別配製已知濃度的N種殘留物純溶液，將N種抗體分別加入溶液中，測量剩餘抗體量，反推出參與反應的抗體量，其與殘留物量的比值即為該抗體對該殘留物的完全抑制率，其計算示意圖見附圖1。所述的剩餘抗體的測量可採用通用的免疫檢測技術，如酶聯免疫法、螢光法、放射性核素法等等。也可採用針對該抗體的免疫傳4感器，如表面等離子體共振傳感器，在其表面固定抗原，測量相應的抗體含量。設N種殘留物分別為W^W2，...Ww，測量用的N種抗體(交叉反應率為100%)分別為Ap4，...A爐則N種抗體對N種殘留物的完全抑制率分別記為aN1、aN2，...aNN。其中a".即表示第i種抗體對第j種殘留物的完全抑制率。顯然，當第i種抗體&與第j種殘留物Wj不存在交叉反應時，完全抑制率為a".=0。所述的採用多種抗體分別對被測樣品進行測量是指假定此時不存在交叉反應，第i種抗體只與第i種殘留物反應，利用通用的免疫測量法，如酶聯免疫法等等，採用N種抗體分別測量出被測樣品中的N種殘留物含量。此處，必須採用競爭法，即在樣品中加入過量抗體，待抗體與殘留物充分反應後，測量剩餘的抗體量，從而推導出參與反應的抗體量，記為y工，y"...，yN。由於假設交叉反應不存在，因此，殘留物的含量即為各抗體消耗量yi除以該殘留物與抗體反應的完全抑制率aii。此時得到了殘留物的初步檢測結果，該結果也是現階段所有免疫法檢測所採用的結果。所述的修正模型的建立，從根本上依據了當抗體過量的情況下，不存在多抗原競爭與抗體反應，所有發生的抗原抗體反應具有可加性。模型認為，抗體與多種組分有交叉反應時，加入樣品中的抗體會分別與殘留物發生反應，消耗抗體量為多種反應消耗抗體量的加和。附圖2為混合物測量的示意圖。設被測的樣品中含有的N種殘留物，其含量分別為Xl、x2，...x爐則利用第i種抗體進行測量時，抗體i與第j種殘留物的反應量為ai,Xj，則抗體消耗總量為yi=an*Xl+ai2*x2+.+aiN*xN，i=1，2，，N，則yi=an氺Xi+ai2氺X2+,+a1N*xNy2=a2i氺Xi+a22氺X2+,+a2N*xN…yN=aN一Xi+aN2氺X2+,+ara*xN所述測量結果的修正是指利用數學模型修正測量結果，最終獲得精確的多組分含量。以上獲得了N個等式構成的方程組，其中N種抗體對所有N種殘留物的完全抑制率an、ai2，aiN，a21、a22，a2N，a31、a32，a3N，，aNl、aN2，aNN已糹5事先測Y尋，為已知直；而利用N種抗體進行測量時，加入樣品後參與反應的抗體量y^y2，...yN也可由測量剩餘抗體量間接得到，因此，在上述的方程組中只有Xl、x2，...xN為未知變量。對方程組進行求解，可以方便的得到Xl、x2，...xN的值。Xl、x2，...xN即為被測樣品中N種殘留物的精確含量。則方程組變為y丄=an氺x!y2=a22*x2yN=ara*xN該方程組即為現階段免疫法檢測所採用的方法。若存在交叉反應時，設5formulaseeoriginaldocumentpage6則Y=MX。此處M稱為修正矩陣，矩陣M反應了各測量用抗體與被測物之間的交叉反應情況。若M可逆，則X有解，且X=M—1Y。由此可知，通過建立的數學模型修正了初步測量的結果，最終獲得的是混合樣品中各殘留物的精確含量。本發明解決了利用免疫法進行多種混合殘留物測量時的精確定量問題，通過事先測得各測量用抗體與被測物的完全抑制率，推導出該抗體在混合殘留物中反應的消耗量，由於抗體過量時，抗原抗體反應的可加性，因此建立了抗體消耗量與各殘留物含量之間的線性關係式，通過求解線性方程組，最終獲得了各殘留物組分的精確含量。本發明為免疫法測量技術的改進，解決了由於交叉反應的存在，利用免疫法測量多組分時不準確的共性問題，不僅適用於在食品中的獸藥、飼料添加劑的檢測，也同樣適用於免疫法測量其他具有相似化學結構的混合物的場合，只要被測物為多組分且存在交叉反應時，利用該發明均可進一步修正檢測結果，實現各組分的精確定量。圖l是本發明所述的完全抑制率的計算方法示意圖；圖la為抗體對殘留物一的完全抑制率=1;圖lb為抗體對殘留物二的完全抑制率=0.5;其中厶表示殘留物一，人表示某抗體，令表示殘留物二。圖2是本發明所述的多抗體測量混合物的示意圖；圖2a森表示殘留物一^=4;令表示殘留物二X2=4;圖2b為利用抗體一人對樣品進行測量an=l，a12=0.5;圖2c為利用抗體二/:對樣品進行測量，321=0.5，a22=1;yi=Xl*l+x2*0.5=6;y2=Xl*0.5+x2*l=6。具體實施例方式下面結合實施例對本發明提出的免疫法測量具有交叉反應的多種殘留物的精確定量方法進行詳細說明。實施例主要針對採用免疫法檢測多種抗生素殘留的情況，具體以13_內醯胺類抗生素為例，介紹其各抗生素的精確定量方法。以牛奶中的13-內醯胺類抗生素為例，具體實例包含四種殘留物青黴素G、氨苄青黴素、頭孢哌酮、頭孢唑啉。需要準備四種抗生素的單克隆抗體，抗體與相對應抗生素的交叉反應率均為100%。具體操作方法分為3個步驟[OO39](—)完全抑制率的測量首先測量青黴素G抗體、氨苄青黴素抗體、頭孢哌酮抗體和頭孢唑啉抗體分別對青黴素G、氨苄青黴素、頭孢哌酮和頭孢唑啉的完全抑制率。以青黴素G抗體為例，測量步驟如下1)分別配製青黴素G、氨苄青黴素、頭孢哌酮和頭孢唑啉的水溶液10ml，濃度均為lmmol/ml52)配製青黴素G抗體的水溶液lOrnl，濃度為2mmol/ml;3)取青黴素G水溶液lml，其中青黴素G含量為lmmol;青黴素G抗體水溶液lml，其中抗體含量為2mmo1，兩者混合，室溫下孵化10分鐘；(注該處抗體量為抗生素量的2倍，是因為4種抗體與4種抗生素的交叉反應率不會超過200%)4)利用青黴素G的ELISA試劑盒，檢測出3)中混合液中剩餘青黴素G抗體的量，青黴素G抗體總量2mmo1扣除剩餘量，即為參與反應的抗體量W;5)青黴素G抗體對青黴素G的完全抑制率為W;6)同理，只需將3)改為氨苄青黴素、頭孢哌酮和頭孢唑啉的水溶液，利用4)的方法測量出青黴素G抗體與三種水溶液混合時參與反應的量，即可獲得青黴素G抗體對其他三種抗生素的完全抑制率。氨苄青黴素抗體、頭孢哌酮抗體和頭孢唑啉抗體對四種抗生素的完全抑制率的測量方法與青黴素G類似。最終，獲得四種抗體對四種殘留物的完全抑制率，繪製表格如下表1抗體與抗生素的完全抑制率測量結果tableseeoriginaldocumentpage7(二)多種殘留物混合樣品的初步測量對含有多種殘留物的混合樣品進行測量時，需要首先分別對各個殘留物進行測量，測量方法可採用通用的免疫檢測方法，必須採用競爭法，即在樣品中加入過量抗體，通過測量剩餘抗體的量反推出參與反應的抗體量。本例採用酶聯免疫法，採用青黴素G試劑盒、氨苄青黴素試劑盒、頭孢哌酮試劑盒和頭孢唑啉試劑盒。採用四個試劑盒分別進行檢測，獲得青黴素G抗體、氨苄青黴素抗體、頭孢哌酮抗體和頭孢唑啉抗體分別與樣品參與反應的消耗量yi，y2，y3，y4。若假設交叉反應不存在，則抗生素的含量即為各抗體消耗量yi除以該抗生素與抗體反應的完全抑制率aii。此時得到了四種抗生素的初步檢測結果，分別記為x/，x2'，y4/a44cx3'，x4'。貝Ux/二y/an，X2'=y2/a22，x3'=y3/a33，x4'[OO56](三)混合殘留物的精確定量利用(一)、(二)的測量結果建立校正模型，其中m、y和x分別為formulaseeoriginaldocumentpage8則x=m—1y其中Xl，x2，x3，x4分別為校正後四種抗生素的精確含量。本發明為了敘述的準確和方便，在實施例中以牛奶中殘留的四種抗生素為例進行詳細描述，但本發明同樣適用於食品中其他獸藥和飼料添加劑，如具有交叉反應的沙丁胺醇、克倫特羅、特布他林的精確檢測，還有交叉反應比較嚴重的磺胺類藥物殘留等等，上述內容均在本發明保護範圍之內。儘管本發明的組合和方法已通過詳細實施過程進行了描述，但是本領域技術人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本申請所述的方法進行拼接或改動，或增減某些附加方法，更具體地說，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發明精神、範圍和內容之中。權利要求一種基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法，其特徵在於，首先測量所採用的抗體對各個殘留物的完全抑制率，並據其建立修正模型，在採用多種抗體分別對殘留物進行單一測量的基礎上，利用模型進行測量結果的修正，最終獲得樣品中混合殘留物的各組分的精確含量。2.根據權利要求l中所述的基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法，其特徵在於，所述抗體對殘留物的完全抑制率是指，當殘留物與抗體存在抗原抗體免疫反應時，兩者完全反應所需抗體的最小量與殘留物量的比值；當殘留物與抗體不存在抗原抗體免疫反應時，完全抑制率為0。所述測量所採用的抗體對各個殘留物的完全抑制率是指，需要測量出所有殘留物的相應抗體分別對各殘留物的完全抑制率，設有N種殘留物，則N種相應抗體對所有N種殘留物的完全抑制率分別為an、a12，a1N，a21、a22，a2N，a31、a32a3N，aNl、aN2&麗？其中&即表示第i種抗體對第j種殘留物的完全抑制率。3.根據權利要求1中所述的基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法，其特徵在於，所述根據測量用抗體對各個殘留物的完全抑制率建立修正模型，是將各個測量用抗體對各個殘留物的完全抑制率構成修正模型中的修正矩陣formulaseeoriginaldocumentpage24.根據權利要求1中所述的基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法，其特徵在於，所述修正模型從根本上依據了當抗體過量的情況下，不存在多抗原競爭與抗體反應，所有發生的抗原抗體反應具有可加性，抗體與多種組分均有交叉反應時，加入樣品中的抗體會分別與殘留物發生反應，消耗抗體量為多種反應消耗抗體量的加和；設被測的樣品中含有的N種殘留物，其含量分別為Xl、x2，...x爐則利用第i種抗體進行測量時，抗體i與第j種殘留物的反應量為a^Xj，則抗體消耗總量為yi=ail*Xl+ai*x2+.+aiN*xN，i=1，2，...，N;當交叉反應不存在時，殘留物的初步測量結果即為各抗體消耗量yi除以該殘留物與抗體的完全抑制率aii。5.根據權利要求1中所述的基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法，其特徵在於，所述採用多種抗體分別對殘留物進行單一測量是指測量過程中必須採用競爭法，即在樣品中加入過量抗體，待抗體與殘留物充分反應後，測量剩餘的抗體量，從而推導出參與反應的抗體量。6.根據權利要求l中所述的基於免疫法的食品中獸藥和飼料添加劑殘留檢測的方法，其特徵在於，所述利用模型對測量結果進行修正，採用初步的測量結果和修正矩陣進行求解，得出被測樣品中所含殘留物的精確含量Xl、x2，...％，設X=[Xl，x2，...，xN]T，Y=[yi，y2，，.，yN]T，當M可逆時，X二M—"Y。全文摘要本發明公開一種利用免疫法精確測量多種具有交叉反應的獸藥或者飼料添加劑混合殘留物的方法，提出首先測量抗體對各個殘留物的完全抑制率，並據其建立修正模型，在採用多種抗體分別對殘留物進行單一測量的基礎上，利用模型進行測量結果的修正，最終獲得樣品中混合殘留物的各組分的精確含量。本發明解決了利用免疫法在殘留物測量過程中，特異性抗體無法區分化學結構式相似的殘留物而發生交叉反應，導致測量不準確的問題。本發明該方法適用於所有基於抗原抗體特異性反應的免疫法檢測，是對免疫測量技術的改進。文檔編號G01N33/53GK101694493SQ20091007080公開日2010年4月14日申請日期2009年10月14日優先權日2009年10月14日發明者劉瑾,張婉潔,徐可欣,林旺,蘇洋申請人:天津大學;