鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識和方法

2023-06-04 18:21:36

專利名稱：鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識和方法
技術領域：
本發明涉及一種鑑定結核分枝桿菌的分子標識和方法，尤其涉及一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識和方法。
背景技術：
世界衛生組織報告指出，結核分枝桿菌引起的結核病是世界上感染率最高的感染性疾病，同時也是全球各種傳染病中引起最多死亡的疾病，據估計，全球人口中的三分之一感染結核分枝桿菌。其中，北京基因型結核分枝桿菌(#. tb Beijing genotype,又稱北京株，Beijing Strain)最早發現於中國、蒙古、俄羅斯等地，是結核分枝桿菌中的重要家族，傳播疾病快、耐藥性強，而且北京基因型結核分枝桿菌在吞噬細胞或單核球內，具有更好的生長能力，該家族病毒成員導致了較高的耐藥率和死亡率，世界範圍內多個地區耐藥率的 增長與該家族有關。據臺灣衛生署調查研究，在較年輕的結核病感染人群中，北京株感染比例較高，小於24歲的結核病患者,北京株感染所佔比例高達61. 5%。據西班牙Gran Canaria Island的研究，北京株感染人數成逐年增加的趨勢。總之，北京株在世界各國有逐漸蔓延的趨勢。北京株致病比例與男女性別統計學上的顯著性，北京株在30歲以下青少年比例較高，而且北京株較其它結核分枝桿菌具有較高的致病性，傳播率以及耐藥性；加之結核病具有潛伏感染的特點，因此，對北京基因型結核分枝桿菌的鑑定對於結核的預防非常重要。間隔區寡核苷酸分型法(spoligotyping)是鑑定北京基因型結核分枝桿菌的金標準，由於這種方法過於複雜和繁瑣，存在花費時間長、價格昂貴等缺點，許多研究者都致力於找出快速低廉的替代方法。PCR方法已經被廣泛的應用於結核分枝桿菌的鑑定，尋找分子標識是PCR方法的關鍵所在，目前常用的鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識主要包括1)具有類似IS6110類型(15 20拷貝);2)均屬於主遺傳群I ;3)基因組DNA A DNA N位點有一個IS6110插入；4)具有相同的特徵性間隔寡型(S00034);5)耐異胭肼相關的kat G基因315位密碼子的雙核苷酸改變(AGC — ACA) ；6) RD105區缺失。

發明內容
本發明提供了一種新的鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識，以及利用所述分子標識鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法；所述分子標識為位於結核分枝桿菌Rv0050編碼基因中的CCG簡單串聯重複序列，為鑑定北京基因型結核分枝桿菌提供了一種新的途徑和方法。本發明第一個目的是提供一種用於鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識，所述分子標識為寡核苷酸串聯重複序列(CCG)4CCT(CCG)4TCG,具體為CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。
所述序列中，含有10個重複單元，從左到右，第5個重複單元發生改變(CCG — CCT)，第十個重複單元發生改變(CCG — TCG)，其餘八個重複單元為CCG。本發明第二個目的是提供一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法，步驟包括 步驟1，以含有微衛星CCG位點的Rv0050基因序列為模板，設計一對同源引物；
步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設計的一對同源引物進行PCR擴
增；
步驟3，將PCR產物克隆測序獲得PCR擴增片段的核酸序列，如果擴增片段中有的CCG簡單串聯重複序列形態是(CCG) 4CCT (CCG) 4TCG，則判定為北京基因型結核分枝桿菌，如果擴增片段中有的CCG簡單串聯重複序列形態不是(CCG)4 CCT (CCG)4TCG,則不是北京基因型結核分枝桿菌。其中，所述一對同源引物優選為
5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；
5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。本發明第三個目的是提供另一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法，步驟包括
步驟1，以含有微衛星CCG位點的RV0050基因序列為模板，設計一對同源引物；
步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設計的一對同源引物進行PCR擴
>曰，
步驟3，將步驟2中得到擴增產物進行電泳、染色，對比所述擴增產物的電泳條帶與(CCG) 4CCT (CCG) 4TCG在相同條件下下PCR擴增和電泳標準條帶，如果擴增產物與標準條帶大小相同，則為北京基因型結核分枝桿菌，如果擴增產物與標準條帶大小不同，則不是北京基因型結核分枝桿菌。其中，所述一對同源引物優選為
5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；
5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。本發明上述的鑑定方法中，所述電泳為6%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。本發明上述的鑑定方法中，所述電泳條件包括將PCR擴增產物於94°C變性7分鐘，然後經變性聚丙烯醯胺電泳，1500V條件下電泳1. 5^2小時。本發明上述的鑑定方法中，所述染色為硝酸銀染色。本發明提供了一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識、以及使用所述分子標識鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法，該方法簡單、快速、廉價，準確性高，敏感度和特異性高達100%，為鑑定北京基因型計劃分枝桿菌提供了一種新的有效地途徑，可用於臨床北京基因型結核分枝桿菌感染的鑑定、預防和治療北京基因型結核分枝桿菌感染結核病藥物的研發篩選、以及北京基因型結核分枝桿菌耐藥性研究等領域。
具體實施例方式本發明提供了一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識，具體為 CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。本發明還提供了利用所述分子標識鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法。
下面通過具體實施例對本發明利用所述分子標識鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法進行詳細的描述和介紹，以使更好的理解本發明，但下述實施例並不限制本發明範圍。實施例1
步驟1，設計引物
以含有微衛星CCG位點的RV0050基因序列為模板，設計同源引物 同源引物一 5』 -TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3』，
同源引物二 5』 -GGGACCGATCGGGATGGTAA-3』。步驟2，PCR擴增
提取結核分枝桿菌臨床菌株DNA為模板DNA，利用步驟I中設計的同源引物，進行PCR擴增，擴增體系如下
IOXTaq PCR 緩衝液2yL
MgCl22. 5 mM
dNTPO. 2 mM
同源引物一O. 2μΜ
同源引物二O. 2μΜ
Taq DNA聚合酶IU
模板 DNAIOng
ddH20加至總體積為20 μ L
PCR 反應條件94°C，5min— (94°C，30s—65°C，30s—72°C，2min) X 35 個循環一72°C，7min。即:首先 94°C，5min ;然後重複如下過程 35 次 94°C，30s—65°C，30s — 72°C，2min 』最後 72°C，7min。步驟3，凝膠電泳檢測
製備6%的變性聚丙烯醯胺凝膠；將步驟2中PCR擴增產物於94°C變性7min，上樣於變性聚丙烯醯胺凝膠，1500 V條件下電泳1.5 2 h;硝酸銀染色，將擴增條帶與陽性標準條帶比較，根據條帶的大小判定是否為北京基因型菌株。其中，所述陽性標準條帶為(CCG)4CCT(CCG)4TCG在相同條件下下PCR擴增和電泳標準條帶。如果擴增產物與標準條帶大小相同，則為北京基因型結核分枝桿菌，如果擴增產物與標準條帶大小不同，則不是北京基因型結核分枝桿菌。實施例2 步驟1，設計引物
以含有微衛星CCG位點的Rv0050基因序列為模板，設計同源引物 同源引物一 5』 -TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3』，
同源引物二 5』 -GGGACCGATCGGGATGGTAA-3』。步驟2，PCR擴增
提取結核分枝桿菌臨床菌株DNA為模板DNA，利用步驟I中設計的同源引物，進行PCR擴增，擴增體系如下
IOXTaq PCR 緩衝液2yLMgCl22. 5 mM
dNTPO. 2 mM
同源引物一O. 2μΜ
同源引物二O. 2μΜ
Taq DNA聚合酶IU 模板 DNAIOng
ddH20加至總體積為20 μ L
PCR 反應條件94°C，5min— (94°C，30s—65°C，30s—72°C，2min) X 35 個循環一72°C，7min。即:首先 94°C，5min ;然後重複如下過程 35 次 94°C，30s—65°C，30s — 72°C，2min 』最後 72°C，7min。步驟3，測序檢測
將步驟2中的PCR擴增產物克隆測序，獲得PCR擴增片段的核酸序列，根據其中含有的CCG簡單串聯重複序列形態是否為(CCG)4 CCT (CCG)4TCG,判定菌株是否為北京基因型菌株。如果擴增片段中有的CCG簡單串聯重複序列形態是(CCG)4CCT (CCG)4TCG,則判定為北京基因型結核分枝桿菌，如果擴增片段中有的CCG簡單串聯重複序列形態不是(CCG)4CCT (CCG) 4TCG，則不是北京基因型結核分枝桿菌。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。
權利要求
1.一種用於鑑定北京基因型結核分枝桿菌的寡核苷酸序列，其特徵在於，所述寡核苷酸序列包括如下CCG簡單串聯重複序列CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。
2.一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法，其特徵在於，步驟包括步驟1，以含有微衛星CCG位點的Rv0050基因序列為模板，設計一對同源引物；步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設計的一對同源引物進行PCR擴增；步驟3，將PCR擴增產物克隆測序獲得PCR擴增片段的核酸序列，如果擴增片段中有的CCG簡單串聯重複序列形態是(CCG)4CCT (CCG)4TCG,則判定為北京基因型結核分枝桿菌，如果擴增片段中有的CCG簡單串聯重複序列形態不是(CCG)4 CCT (CCG)4TCG,則不是北京基因型結核分枝桿菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述一對同源引物為5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。
4.一種鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法，其特徵在於，步驟包括步驟1，以含有微衛星CCG位點的Rv0050基因序列為模板，設計一對同源引物；步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設計的一對同源引物進行PCR擴增，步驟3，將步驟2中得到擴增產物進行電泳、染色，對比所述擴增產物的電泳條帶與(CCG) 4CCT (CCG)4TCG在相同條件PCR擴增和電泳標準條帶，如果擴增產物與標準條帶大小相同，則為北京基因型結核分枝桿菌，如果擴增產物與標準條帶大小不同，則不是北京基因型結核分枝桿菌。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述染色為硝酸銀染色。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述電泳為6%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述電泳條件包括將PCR擴增產物於94°C變性7分鐘，然後經變性聚丙烯醯胺電泳，1500V條件下電泳1.5^2小時。
8.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述一對同源引物為·5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；·5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。
全文摘要
本發明提供了一種用於鑑定北京基因型結核分枝桿菌的分子標識，所述分子標識為寡核苷酸串聯重複序列(CCG)4CCT(CCG)4TCG。本發明還提供了利用所述分子標識鑑定北京基因型結核分枝桿菌的方法，該方法簡單、快速、廉價，準確性高，為鑑定北京基因型結核分枝桿菌提供了一種新的有效地途徑，可用於臨床北京基因型結核分枝桿菌感染的鑑定、預防和治療北京基因型結核分枝桿菌感染結核病藥物的研發及篩選、以及北京基因型結核分枝桿菌耐藥性研究等領域。
文檔編號C12Q1/04GK103014134SQ20111028277
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者秦蓮花, 胡忠義, 王潔, 鄭瑞娟, 崔振玲, 麥廣良 申請人:上海市肺科醫院