兔肺炎克雷伯氏菌凝集原及其應用的製作方法

2023-06-04 18:42:56 2

專利名稱：兔肺炎克雷伯氏菌凝集原及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉生物技術領域，特別涉及兔肺炎克雷伯氏菌的凝集反應實驗技木。
背景技術：
兔肺炎克雷伯氏菌病(Klebsiellosis)是由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)引起兔的肺炎和其它器官化膿性炎症為特徵的散發性疾病，常呈地方性流行，很少造成大規模流行。家兔發病後表現出一系列的呼吸道症狀，消化紊亂，母兔流產，嚴重者發生敗血症而死亡。各種品種、年齡和性別的兔都對本菌有易感性，以斷奶前後的仔兔和
妊娠母兔發病率最高，子兔感染後極度衰竭，迅速死亡，危害十分嚴重。由於本病的臨床症狀和病理變化缺乏特徵性，僅根據臨床資料難以作出準確的診斷，通常只能在有條件的實驗室做細菌學檢查才能確診，這樣就會耽誤防治的最佳時間。為了在基層獸醫站或養兔場能快速診斷本病，以便迅速制定控制措施，建立ー種快速檢測試劑盒及檢測方法十分必要。目前，細菌病檢測方法通常有形態學觀察、培養特性鑑定、生化特性鑑定、免疫學檢測和核酸檢測。兔肺炎克雷伯氏菌病的診斷主要通過細菌分離培養、形態學觀察、生化鑑定、動物接種試驗，這種方法繁瑣、費吋。免疫學檢測方法主要有莢膜腫脹試驗、平板凝集反應、SPA協同凝集試驗、對流免疫電泳、間接免疫螢光試驗。莢膜腫脹試驗雖然快速、方便，但需要藉助顯微鏡觀察，在很多基層獸醫站和兔場都無法進行。對流免疫電泳、間接免疫螢光試驗雖然準確，但對操作人員的技術要求較高，且需要較昂貴的設備。PCR檢測法靈敏度高、準確，但需要昂貴的儀器和試劑，檢測成本高，對操作人員技術要求較高，不適合基層用。通過文獻檢索尚未發現兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試劑盒及檢測方法的相關研究報導，特別是用復紅對兔肺炎克雷伯氏菌進行染色後再進行微量凝集試驗的方法。

發明內容
本發明的目的之ー在於提供ー種兔肺炎克雷伯氏菌凝集原，其可以作為凝集反應實驗試劑。凝集反應是ー種血清學反應，顆粒性抗原(完整的病原微生物或紅細胞等)與相應抗體結合，在有電介質存在的條件下，經過一定時間，出現肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。傳統的凝集原不經過任何色素染色。本技術方案必須經過染料染色，確保實驗結果可直觀判斷。傳統的染料包括結晶紫、臺盼藍、美蘭、吖啶橙、羅丹明及復紅染液等。設定了眾多平行實驗篩選出兔肺炎克雷伯氏菌凝集原，由經復紅染色液染色的兔肺炎克雷伯氏菌液製備而成。進ー步，所述兔肺炎克雷伯氏菌液中每毫升含有80-120億個兔肺炎克雷伯氏菌，所述復紅染液與所述兔肺炎克雷伯氏菌液的體積比為8-12 I。作為優選，所述兔肺炎克雷伯氏菌液中每毫升含有100億個兔肺炎克雷伯氏菌，所述復紅染液與所述兔肺炎克雷伯氏菌液的體積比為10 I。本發明的目的之ニ在於提供上述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原的應用方法，該方法操作簡單，便於掌握，無需藉助昂貴精密的儀器。為實現上述目的，本發明的技術方案為所述的兔肺炎克雷伯氏菌凝集原的應用方法，所述應用方法具體為凝集反應實驗中的應用方法將所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與凝集素結合，判斷凝集結果。所述應用方法還設有平行實驗組，包括陽性對照組和/或陰性對照組和/或空白對照組。可以通過同空白對照組、陰性對照組及陽性對照組比對數據，進一歩判斷樣品為陰性或陽性。基於上述原理，上述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原的應用方法，既可以用於對兔肺炎克雷伯氏菌的定性檢測，又可以用於兔肺炎克雷伯氏菌抗體定性或定量檢測，或測其效價。作為優選方案,所述凝集反應實驗為微量凝集反應實驗，以96孔微量反應板為載體進行。

作為優選方案，所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與凝集素的體積比為I : I。作為優選方案，所述凝集結果的判斷方式有肉眼觀察。肉眼觀察或許具備一定的主觀性，一般技術員基本可實現定性檢測；為了降低主觀性導致的誤差，可設平行實驗組，包括陽性對照組和/或陰性對照組和/或空白對照組；肉眼觀察判定凝集結果的程度標準為++++:孔底形成紅色的傘狀沉澱，或沉澱物呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑彡O. 20cm,即100%凝集；+++ :菌體凝集呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑O. 15cm-0. 19cm,，即75%凝集；++ :孔底有凝集沉澱，呈紅色的塊狀或小片絮狀物，直徑O. IOcm-O. 14cm,即50%
凝集;+ :空底紅色凝集沉澱或僅有凝集沉澱的痕跡，直徑O. Olcm-O. 09cm,即25%凝集；-:液體呈渾濁、不透明，無紅色凝集沉澱或凝集沉澱的痕跡；以出現「++」以上判為所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與所述凝集素凝集；或以出現「++」的血清最高稀釋度為待檢血清效價，如血清稀釋度為I : I時未出現凝集反應，則待檢血清效價仍記為O,如果出現凝集反應,則記為待檢血清效價記為I 2 ;生理鹽水對照中抗體凝集效價應< I : 2。進ー步，所述應用方法是檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗體的方法，具體為將所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與待測樣品充分混合，當所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原和所述待測樣品發生凝集時，判定待測樣品中存在兔肺炎克雷伯氏圃抗體。作為優選方案，所述待測樣品為血清，作1-256倍體積稀釋。作為優選方案，所述判斷結果為吸光度檢測，判斷標準為當OD28tl ^ O. 5時，判為不凝集；0. 2 < OD280 < O. 5時，判為可疑；0D28(i く O. 2時判為凝集。與現有的技術相比，本發明的有益效果在於兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試劑盒及檢測方法與平板凝集反應、SPA協同凝集試驗相比較，共同的優點是不需要昂貴的儀器和試劑、成本低、快速、操作簡便、對操作人員技術要求不高、結果直觀，適合基層現場檢測應用，但平板凝集反應和SPA協同凝集試驗的檢測抗原未染色，凝集顆粒模糊、不便觀察，而兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試劑盒的檢測抗原進行了染色，凝集顆粒或凝集塊呈紅色，更易於觀察，其檢測方法既可以定量檢測兔血清抗體效價，又可以定性檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗原，特別適合基層獸醫站、兔場現場診斷兔肺炎克雷伯氏菌病，同時還可以用於兔肺炎克雷伯氏菌病的檢疫和流行病學調查。本發明建立了兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試劑盒及檢測方法，快速、特異性強，既可用於檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗體，又可用於檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗原，用於兔肺炎克雷伯氏菌病的快速診斷、檢疫及流行病學調查。用該試劑盒及檢測方法檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗體或抗原，凝集顆粒或凝集塊呈紅色，結果易判定。用該試劑盒及檢測方法操作簡便，不需要昂貴的儀器設備和試劑，一般技術員都可以操作，檢測成本低，適合在基層和兔場應用。
具體實施例方式抗原是指能夠刺激機體產生(特異性)免疫應答，井能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體內外結合，發生免疫效應(特異性反應)的物質。凝集原是指參與凝集反應的抗原。本發明中的凝集原均指兔肺炎克雷伯氏菌凝集 原。凝集素是指參與凝集反應的抗體。本發明中涉及的凝集素均指兔肺炎克雷伯氏菌凝集素。凝集反應實驗ー種血清學反應。顆粒性抗原(完整的病原微生物或紅細胞等)與相應抗體結合，經過一定時間，出現肉眼可見的凝集小塊。待測樣品的形式可以為液體或固體；通過檢測液體或固體中是否含有兔肺炎克雷伯氏菌抗體。所述抗體主要分布在血清中，也分布於組織液及外分泌液中。所述抗體可以是體內分泌的，也可以是通過生物學方法體外獲得的。主要材料及儀器兔肺炎克雷伯氏菌SZ株(本實驗室分離鑑定)，TSA培養基(BD公司)，復紅染色液、96孔微量反應板(杭州微生物試劑公司)，體重I. 5-2. OKg的試驗家兔(西南大學榮昌校區實驗動物科)，稀釋液(生理鹽水)、兔巴氏桿菌陽性血清、兔波氏桿菌陽性血清、兔葡萄球菌陽性血清、兔魏氏梭菌陽性血清(本實驗室製備)。恆溫培養箱TG-16(四川蜀科儀器有限公司)，離心機HPX-9080MBE (上海博迅實業有限公司)。分光光度計 223 IHamburg (Eppendorf)。實施例I試劑的配製一待測樣品血清的製備血清的製備離體的兔的血液，自然凝固，分離血清，置56°C水浴滅能30分鐘，備用。ニ凝集原的製備將兔肺炎克雷伯氏菌接種TSA瓊脂平板，置37°C恆溫箱培養24h，用生理鹽水洗下菌苔；純粹檢驗；活菌計數；調整菌液濃度為100億個/mL ;加入相當於菌液體積O. 3%的甲醛溶液，搖勻，置37°C恆溫箱滅活24小時(每4h振搖I次)；在所述菌液中加入復紅染色液，搖勻，4°C冰箱過夜；5000rpm離心lOmin，棄上清，加入生理鹽水懸浮沉澱，如此洗滌3次後，加入生理鹽水至原體積，懸浮沉澱；無菌檢驗；加入1/10000的硫柳汞防腐；分裝成2mL/瓶，置4-8°C冰箱保存。作為優選方案，按ImL菌液中加入100 μ L復紅染色液，實施例2和3中，採用該配方製備的試劑作為凝集原。
三陽性血清的製備將兔肺炎克雷伯氏菌接種TSA瓊脂平板，置37°C恆溫箱培養24小時，用生理鹽水洗下菌苔，菌液純粹檢驗，活菌計數，菌液濃度應在100億個/mL以上，加入相當於菌液體積O. 3%的甲醛溶液，搖勻，置37°C恆溫箱滅活24小時，每4小時振搖I次，無菌檢驗，加入相當於菌液體積20%的鋁膠，混勻，即為免疫抗原。將抗原接種健康家兔，基礎免疫為每隻兔皮下注射lmL，14d後加強免疫，每隻兔皮下注射2mL，10天後採血，分離血清，56°C水浴滅能30min，加入1/10000的硫柳汞防腐，分裝成2mL/管，-20°C保存。血清中含有凝集素(兔肺炎克雷伯氏菌凝集素)。四陰性血清的製備選擇未免疫兔肺炎克雷伯氏菌疫苗的健康家兔，進ー步用兔肺炎克雷伯氏菌所 述凝集原檢測其血清抗體為陰性的免，無菌採血，分離血清，56°C水浴滅能30min，加入1/10000的硫柳汞防腐，分裝成ImL/管，-20°C保存。五稀釋液的配製稀釋液的配製。氯化鈉為分析純，用蒸餾水配製O. 9%的生理鹽水，121°C滅菌30分鐘，冷卻，分裝成5mL/瓶，置4-8°C冰箱保存。將上述凝集原與上述陽性血清在玻板上進行結合，經具有凝集反應實驗技能的技術員判定，發生凝集反應。將上述凝集原與上述陽性血清以96孔微量反應板為載體進行結合，經具有凝集反應實驗技能的技術員判定，發生凝集反應。六兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試驗結果判定標準的制定在96孔微量反應板上加生理鹽水，每孔50 μ L，在第一孔中加兔肺炎克雷伯氏菌陽性血清 50 μ L，混勻，分別進行 I : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16、1 : 32、1 : 64 :、1 : 128、
I 256倍體積稀釋；陰性血清對照4孔，分別是原液、I 2、1 4、1 8倍體積稀釋；生理鹽水對照3孔，每孔50 μし在陽性血清、陰性血清對照和生理鹽水對照各孔中加入兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集抗原(120201批)50 μ L，混勻，4-8°C冰箱靜置3h，第I小時每IOmin觀察一次，觀察紅色凝集顆粒或凝集塊的出現。最後判定結果靜置3小時後，將微量反應板傾斜約60°，在2分鐘內從微量反應板背面觀察凝集結果。結果見下表「兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試驗結果判定表」。用所製備的120201批兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與兔肺炎克雷伯氏菌陽性血清做微量凝集試驗，在4-8°C冰箱靜置10min、20min後，陽性血清第1_2孔可見紅色凝集顆粒或紅色凝集塊，第3_4孔為可疑，第5-12孔不凝集，陰性血清和生理鹽水對照孔無凝集；靜置30min、40min後，陽性血清第1-4孔可見紅色凝集顆粒或紅色凝集塊，第5-6孔為可疑，第7-12孔不凝集，陰性血清和生理鹽水對照孔無凝集；靜置50min、60min後，陽性血清第1_6孔可見紅色凝集顆粒或紅色凝集塊，第7-12孔不凝集，陰性血清和生理鹽水對照孔無凝集；靜置60min後，將微量反應板傾斜約60°，在2min內從微量反應板背面觀察，陽性血清第1_6孔可見紅色凝集顆粒或凝集塊，第7-12無凝集，陰性血清和生理鹽水對照孔無凝集；靜置3h後，將微量反應板傾斜約60°，在2min內從微量反應板背面觀察，陽性血清第1_6孔有清晰的紅色凝集顆粒或凝集塊，第7-12孔無凝集，陰性血清和生理鹽水對照孔都無凝集，判定陽性血清抗體效價是61og2。由此可見，兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試驗結果判定方法是微量反應板加樣混勻後，置4-8°C冰箱靜置3h，將微量反應板傾斜約60°，在2min內從微量反應板背面觀察。判定標準是++++:孔底形成紅色的傘狀沉澱，或沉澱物呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑彡O. 20cm,即100%凝集；+++:菌體大部分凝集呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑O. 15cm O. 19cm，，即75%凝集；++ :孔底有明顯的凝集沉澱，呈紅色的塊狀或小片絮狀物，直徑O. IOcm O. 14cm,即50%凝集；+ :空底有不甚顯著的紅色凝集沉澱或僅有凝集沉澱的痕跡，直徑O. Olcm O. 09cm,即 25% 凝集； -:液體呈渾濁、不透明，無紅色凝集沉澱或凝集沉澱的痕跡。以出現++的血清最高稀釋度為待檢血清效價。如果血清稀釋度為I : I時未出現凝集反應，則待檢血清效價仍記為O ;如果出現凝集反應,則記為待檢血清效價記為I : 2。生理鹽水對照中抗體凝集效價應< 1:2。兔肺炎克雷伯氏囷微量減集試驗結果判定表
lf,vlPiJfIuiiI-i.'ftt 十
抗原 な:則性_—沽稀釋度(XI< 2)釋度(X 水
V , . 、log2)對照
1234 S 6789 1011 12 0123
I v)I ·"""" """"""""
I K β II^iTII II_
Ζ,υI s~T~ — — — — — — — — — 一 — 一 — — — — —注「 + 」表示凝集，表示不凝集，「 土 」表示可疑。實施例2基於檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗體的方法待檢血清的製備採集患病兔或患病耐過兔的血液，自然凝固，分離血清，置56°C水浴滅能30min,備用。待檢血清的稀釋在96孔微量反應板上加稀釋液，甸孔50 u L,在弟一孔中加待檢血清 50 μ L，混勻，分別進行 I : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16、1 : 32、1 : 64 :、1 : 128、I 256倍體積稀釋，設陽性血清(以實施例I製備的陽性血清)、陰性血清(以實施例I製備的陰性血清)、稀釋液對照(以實施例I製備的稀釋液)。加入凝集原每孔加入50 μ L檢測抗原，輕輕搖勻，置4-8 °C冰箱靜置3小時。結果判定將微量反應板傾斜約60°，在2分鐘內，從微量反應板背面觀察。判定標準為++++:孔底形成紅色的傘狀沉澱，或沉澱物呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑彡O. 20cm,即100%凝集；+++:菌體大部分凝集呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑O. 15cm O. 19cm，，即75%凝集；
++ :孔底有明顯的凝集沉澱，呈紅色的塊狀或小片絮狀物，直徑O. IOcm O. 14cm,即50%凝集；+ :空底有不甚顯著的紅色凝集沉澱或僅有凝集沉澱的痕跡，直徑O. Olcm O. 09cm,即 25% 凝集；-:液體呈渾濁、不透明，無紅色凝集沉澱或凝集沉澱的痕跡。以出現++的血清最高稀釋度為待檢血清效價。如果血清稀釋度為I : I時未出現凝集反應，則待檢血清效價仍記為O ;如果出現凝集反應,則記為待檢血清效價記為I : 2。生理鹽水對照中抗體凝集效價應< 1:2。或採用分光光度計測定吸光度，判定標準為當OD28tl ^ O. 5時，判為不凝集；0. 2< OD280 < O. 5時，判為可疑；OD280 く O. 2時判為凝集。 經分光光度儀檢測的結果和肉眼判斷的結果一致。結果見表I。從表I看出，用所述凝集原檢測13隻發病兔血清抗體，其中6隻兔的抗體凝集效價為llog2-31og2(l 2 I : 8)，另7隻為陰性；檢測7隻發病耐過兔血清抗體，其中4隻兔的抗體凝集效價為410g2-610g2(l 16 I : 64)，另3隻為陰性；陽性血清抗體凝集效價為61og2(l 64)，陰性血清和生理鹽水對照為不凝集。表I兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試劑盒檢測抗體結果表
2- - 3 I - 醫
S瘤兔血 (Xlog2)
ο _ 2 - - 2
耐過兔愈清(XIog2)4 - 5 ........ 6 4
ΡΒ*Ι41ι淸對麗(Xlog2)6
酬性血沽對遐一
故水對照一注表示不凝集。實施例3疑似兔肺炎克雷伯氏菌的定性檢測a、待檢樣本的檢測從臨床病死兔分尚到10株疑似兔肺炎克雷伯氏圃,將待檢圃接種TSA瓊脂平板，置37°C恆溫箱培養24h，用生理鹽水洗下菌苔；活菌計數；調整菌液濃度為120億個/mL ;按菌液量加入甲醛使其體積終濃度為O. 3%，搖勻，置37 °C恆溫箱滅活24h (每4h振搖I次)；按ImL菌液加入120 μ L復紅染色液，搖勻，4°C冰箱過夜；5000rpm離心lOmin，棄上清，加入生理鹽水懸浮沉澱，如此洗滌3次後，加入生理鹽水至原體積，懸浮沉澱，即為待檢抗原。b、在微量反應板上加實施例I方法製備的所述陽性血清(實施例I製備的陽性血清)，每孔50 μ L，再每孔分別加待檢抗原50 μ L ;設待檢抗原加陰性血清對照組(實施例I製備的陰性血清)、待檢抗原加生理鹽水對照、檢測抗原加陰性血清對照、檢測抗原加生理鹽水對照、檢測抗原加陽性血清対照。混勻，置4-8°C冰箱靜置3小吋。C、觀察結果。將微量反應板傾斜約60°，在2分鐘內從微量反應板背面觀察。判定標準為++++:孔底形成紅色的傘狀沉澱，或沉澱物呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑彡O. 20cm,即100%凝集；+++ :菌體大部分凝集呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑O. 15cm O. 19cm,，即75%凝集；++ :孔底有明顯的凝集沉澱，呈紅色的塊狀或小片絮狀物，直徑O. IOcm O. 14cm,即50%凝集；+ :空底有不甚顯著的紅色凝集沉澱或僅有凝集沉澱的痕跡，直徑O. Olcm O. 09cm,即 25% 凝集；-:液體呈渾濁、不透明，無紅色凝集沉澱或凝集沉澱的痕跡。以出現++以上判為凝集。結果見表2。從表2看出，用所述凝集素檢測10份待檢菌，其中7份與兔肺炎克雷伯氏菌陽性血清發生特異性凝集反應，3份無凝集反應；待檢樣品與陰性血清和生理鹽水都無凝集反應；兔肺炎克雷伯氏菌檢測抗原與陽性血清發生特異性凝集反應，與陰性血清和生理鹽水都無凝集反應。說明10株疑似兔肺炎克雷伯氏菌中有7株是兔肺炎克雷伯氏菌，有3株不是該菌。表2微量凝集試劑盒檢測兔肺炎克雷伯氏菌的試驗結果表待測樣品(疑似免肺炎iMiiilK爾)
權利要求
1.兔肺炎克雷伯氏菌凝集原，其特徵在於由經復紅染色液染色的兔肺炎克雷伯氏菌液製備而成。
2.根據權利要求I所述的兔肺炎克雷伯氏菌凝集原，其特徵在於所述兔肺炎克雷伯氏菌液中每毫升含有80-120億個兔肺炎克雷伯氏菌，所述復紅染液與所述兔肺炎克雷伯氏菌液的體積比為8-12 I。
3.根據權利要求I所述的兔肺炎克雷伯氏菌凝集原，其特徵在於所述兔肺炎克雷伯氏菌液中每毫升含有100億個兔肺炎克雷伯氏菌，所述復紅染液與所述兔肺炎克雷伯氏菌液的體積比為10 : I。
4.權利要求1-3任一項所述的兔肺炎克雷伯氏菌凝集原的應用方法，所述應用方法具體為在凝集反應實驗中的應用方法將所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與凝集素結合，判斷凝集結果。
5.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述凝集反應實驗為微量凝集反應實驗，以96孔微量反應板為載體進行。
6.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與凝集素的體積比為I : I。
7.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述凝集結果的判斷方式為肉眼觀察，判定凝集結果的程度標準為 ++++:孔底形成紅色的傘狀沉澱，或沉澱物呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑彡O. 20cm,即100%凝集； +++ :菌體凝集呈紅色的片狀、塊狀或顆粒狀，直徑O. 15cm-0. 19cm,，即75%凝集； ++ :孔底有凝集沉澱，呈紅色的塊狀或小片絮狀物，直徑O. IOcm-O. 14cm，即50%凝集； + :空底紅色凝集沉澱或僅有凝集沉澱的痕跡，直徑O. Olcm-O. 09cm,即25%凝集； -:液體呈渾濁、不透明，無紅色凝集沉澱或凝集沉澱的痕跡； 以出現「++」以上判為所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與所述凝集素凝集； 或以出現「++」的血清最高稀釋度為待檢血清效價，如血清稀釋度為I : I時未出現凝集反應,則待檢血清效價仍記為O,如果出現凝集反應,則記為待檢血清效價記為I : 2 ;生理鹽水對照中抗體凝集效價應< 1:2。
8.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述應用方法是檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗體的方法，具體為將所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與待測樣品充分混合，當所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原和所述待測樣品發生凝集時，判定待測樣品中是否存在兔肺炎克雷伯氏菌抗體、其效價或含量。
9.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述待測樣品為血清，進行I 256倍體積稀釋。
10.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述判斷結果為吸光度檢測，判斷標準為當OD28tl彡O. 5時，判為不凝集；0. 2 < OD280 < O. 5時，判為可疑；0D28(I ( O. 2時判為凝集。
全文摘要
本發明涉生物技術領域，特別涉及兔肺炎克雷伯氏菌的凝集反應實驗技術，兔肺炎克雷伯氏菌凝集原，由經復紅染色液染色的兔肺炎克雷伯氏菌液製備而成；所述應用方法具體為凝集反應實驗中的應用方法將所述兔肺炎克雷伯氏菌凝集原與凝集素結合，判斷凝集結果；本發明不需要昂貴的儀器和試劑、成本低、快速、操作簡便、對操作人員技術要求不高、結果直觀，適合基層現場檢測應用，兔肺炎克雷伯氏菌微量凝集試劑盒的檢測抗原進行了染色，凝集顆粒或凝集塊呈紅色，更易於觀察，其檢測方法既可以定量檢測兔血清抗體效價，又可以定性檢測兔肺炎克雷伯氏菌抗原，特別適合基層獸醫站、兔場現場診斷兔肺炎克雷伯氏菌。
文檔編號G01N33/536GK102818891SQ20121030775
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月27日 優先權日2012年8月27日
發明者王孝友, 楊睿, 沈克飛, 徐登峰, 付利芝, 黃偉 申請人:重慶市畜牧科學院