積雪草酸在製備藥物方面的用途的製作方法

2023-06-04 18:47:11 1

專利名稱：：積雪草酸在製備藥物方面的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及積雪草酸在製備藥物方面的用途，特別是涉及積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的用途。
背景技術：
：積雪草為傘形科積雪草屬植物，廣泛分布於長江流域以南各地。全草入藥。在我國積雪草外用及內服治病已有兩千多年歷史。其具有清熱利溼，解毒消腫之功能。適用於溼熱黃疸，中暑腹瀉，砂淋血淋，癰腫瘡毒，跌扑損傷。積雪草的化學成分以三萜類為主，如積雪草苷、羥基積雪草苷等五環三萜型酯苷。積雪草還含有三萜酸類，如積雪草酸、羥基積雪草酸等。此外，積雪草中還有少量的多炔烯類、揮髮油類、香草酸等。積雪草酸是一種已知物質。購自美國SIGMA公司的積雪草酸為高效液相色譜技術提取物，黃棕色粉末，無臭，味苦。分子式為C48H78O5，分子量為488.70道爾頓(D)，熔點為325℃-330℃，不溶於水，溶於二甲亞碸。其分子結構式如下式所示肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發展過程中的一個病例過程，其主要機理是肝星狀細胞活化並轉化為成纖維細胞，產生大量以膠原纖維為主要成分的細胞外基質，使肝組織結構逐漸改變，肝功能不斷下降的病理過程。轉化生長因子β(TGFβ)的信號經過細胞內的Smad信號轉導促使纖維化相關的基因的表達，TGFβ/Smad信號途徑最主要的肝纖維化信號途徑，TGFβ與肝星狀細胞(HSC-T6)TGFβ受體結合後，使Smad2/3磷酸化，並與Smad4結合進入細胞核，啟動肝肝星狀細胞(HSC-T6)纖維蛋白相關基因的轉錄。Smad7是TGFβ信號途徑的負反饋調節因子，可以抑制Smad2/3磷酸化，進而抑制肝纖維化。在病理條件下，TGFβ信號持續使Smad2/3磷酸化，導致纖維蛋白基因的轉錄和蛋白合成。本發明的過程證明積雪草酸可抑制大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)活化和轉化，使alpha肌動蛋白(alpha-SMA)表達下降。同時，本發明的過程證明積雪草酸可抑制大鼠肝星狀細胞膠原蛋白合成，從而抑制肝纖維化。本發明的過程還證明積雪草酸抑制肝膠原蛋白合成通過上調Smad7負反饋信號發揮對TGFβ/Smad信號轉導的抑制作用。肝纖維化是一個可逆的過程，在肝纖維化階段採取積極的治療措施對防止肝硬化是至關重要的。目前西藥抗肝纖維化的治療尚缺乏理想的藥物。積雪草酸是一種有顯著地抗肝纖維化作用的藥物。肝星狀細胞約佔所有肝細胞總數的15％。在致肝纖維化因素的作用下，肝星狀細胞分泌大量細胞外基質，基質主要由纖維蛋白和由肝星狀細胞活化和轉化而來的成纖維細胞組成。大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)細胞系是研究肝纖維化的細胞模型，由美國FriedmanSL(DivisionofLiverDiseases，MountSinaiSchoolofMedicine，NewYork，USA)教授建立並惠贈。文獻資料報導，積雪草酸的公知藥物用途有用其製備癒合皮膚傷口、治療瘢痕疙瘩的藥物，以及製備防治心血管疾病、防治腦血管疾病的藥物。至今，國內外有關積雪草酸在抗肝纖維化方面的研究均缺乏有說服力的實驗證據表明積雪草酸確實能夠抗肝纖維化。積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的用途至今未見報導。而我們發明積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的新用途完全是建立在充分和有說服力的實驗證據基礎之上的。
發明內容本發明的目的在於提供積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的新用途。本發明提供積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的用途。為此，通過實驗要證明1、積雪草酸抑制TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞活化和轉化，使alpha-SMA蛋白表達減少。2、積雪草酸抑制TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞膠原蛋白合成。3、積雪草抑制膠原蛋白合成的機理是上調TGFβ/Smad信號途徑中Smad7負反饋信號。以下為整個實驗過程材料方法1.細胞培養HSC-T6維持培養在低糖型DMEM(Invitrogen)培養基中，添加1％青鏈黴素(Invitrogen)和10％胎牛血清(Hyclone).每孔1×104細胞2.5ml鋪6孔培養板，24小時後，換含0.2％胎牛血清DMEM培養24小時，加AA(5μM，10μM，20μM，30μM，)達2小時，加1ng/mlTGFβ，設立各組對照，24小時後從細胞提取蛋白或mRNA。2.蛋白質提取將各孔細胞的培養基棄去，用預冷的0.01MPBS衝洗2次。六孔板每孔加250uLRIPA細胞蛋白裂解液，搖晃使其充分覆蓋底部，冰上放置30min。RIPA蛋白裂解緩衝液的成分為1％NonidetP-40，0.1％SDS，1mMPMSF，0.5％sodiumdeoxycholate，1mMsodiumorthovanadate，10mMsodiumfluorideinPBS。細胞刮子刮取細胞，收集至1.5mLEppendorf管中。在冰上對樣本進行超聲粉碎，500W、3s×6次，4℃、12000rpm離心10min，取上清。儲存於-70℃備用。3.信使核糖核酸(mRNA)抽提將各孔細胞的培養基棄去，用PBS緩衝液衝洗後在十二孔板的每個孔中加入350uL含有β2-巰基乙醇的RLT裂解液。輕輕搖晃使裂解液與細胞充分接觸後收集標本到1.5mL離心管中，按照QIAGEN公司RNeasyMiniKit(Cat74104)的說明書進行提取細胞的總RNA。4.聚合酶鏈反應(PCR)逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)取質量為1.5ug的總RNA以Oligo(dT)為引物合成第一鏈cDNA(按試劑盒說明書進行)，反應試劑10XPCRBuffer2.0μL，50mMMgCl22.0μL，10mMdNTPs2.0μL，Oligo(dT)12-181.0μL，RnaseInhibitor1.0μL，M-MLV0.25μL，H2O9.75μL，RNA2.0μL，TotalVolume20μL.反應條件22℃10minutes，42℃15minutes，99℃5minutes，將cDNA-20℃保存備用。實時定量聚合酶鏈反應(Real-TimePCR)引物的序列如下RatSmad7FCGCTGTACCTTCCTCCGATRatSmad7RAGAAGATATCCAGGGAGGGCTCTTReal-TimePCR反應試劑2×iQSYBRGreenSupermix10μL，H2O7.2μL，Primer-10.4μL，Primer-20.4μL，DNA2μL，反應條件94℃，5min，循環條件94℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸42s。共擴增40個循環，最後一個循環後置72℃孵育5min。5.免疫印記(Westernblot)試劑0.5MTris-HCl，PH6.8，1.5MTris-HClPH8.8；40％Acrylamide/BisSolution；20×NuPAGEMESSDS電泳緩衝液；20×NuPAGE轉膜緩衝液；PVDF膜；X-感光膠片；ECL(supersignalwestpicostableperoxidesolution)；ECLplus(LumigenPS-3DetectionReagentSolution)；4％積層膠，10％分離膠，總蛋白20ug的樣本；非連續SDS-PAGE電泳100V，90分鐘。然後將蛋白轉移至PVDF膜，150V，90分鐘。轉膜後TBST洗膜。以5％脫脂奶粉-TBST封閉液室溫下封閉60min；TBST洗膜。加入合適濃度的一抗(1∶1000至1∶2000)孵育4℃輕搖過夜。TBST洗膜加入合適濃度的結合HRP的二抗(1∶10000至1∶30000)及HRP-anti-biotin二抗(1∶5000)孵育室溫下輕搖60min。ECL或ECLplus顯影1分鐘後，將PVDF膜致於兩張乾淨的透明薄膜之間，在暗室中進X-線膠片曝光2秒-15分鐘不等。曝光後的膠片進行顯影及定影。結果經掃描成像系統成像，並用ImageJ軟體進行定量分析蛋白質帶的含量。採用上述實驗方法所得實驗數據，經分析可得出以下結果和結論結果1.TGFβ增加大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白表達2.TGFβ誘導大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白表達的劑量為1ng/ml，時間為24小時。3.積雪草酸抑制大鼠肝星狀細胞alpha-SMA蛋白表達積雪草酸可抑制TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞alpha-SMA蛋白表達，統計學分析差別具有顯著性。4.積雪草酸抑制大鼠肝星狀細胞膠原蛋白合成積雪草酸抑制TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成，統計學分析差別具有顯著性。5.積雪草酸上調大鼠肝星狀細胞Smad7mRNA負反饋信號積雪草酸上調大鼠肝星狀細胞Smad7mRNA負反饋信號，通過Smad7阻止TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成。統計學分析差別具有顯著性。結論1.積雪草酸抑制TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞活化和轉化。2.積雪草酸抑制TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成。3.積雪草酸上調Smad7mRNA負反饋信號，通過Smad7阻止TGFβ誘導的大鼠肝星狀細胞I型膠原蛋白合成。達到抑制肝纖維化的藥效。從以上實驗結果可知，積雪草酸確實在抗肝纖維化方面有著良好的藥效作用，積雪草酸確實可以用於製備抗肝纖維化的藥物。具體實施例方式以下用實施例來進一步說明本發明積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的用途。實施例1積雪草酸作用於大鼠肝星狀細胞，製備蛋白標本，Westernblot1.HSC-T6細胞1×104鋪6孔板，5％CO2，37℃，24小時後加入積雪草酸(購至於美國SIGMA公司)，濃度分別為5μM，10μM，20μM，30μM，2小時後加入TGFβ1ng/ml，繼續培養24小時後，常規方法提取細胞蛋白，蛋白含量測定，-70℃儲存備用或直接做Westernblot。2.Westernblot方法完全參照金冬雁，黎孟楓等翻譯的《分子克隆實驗指南》第二版。蛋白質的丙烯醯胺凝膠電泳方法參見880-885頁，蛋白質從SDS丙烯醯胺凝膠轉移至PVDF膜的方法參見888-893頁。3.轉膜後TBST洗膜。以5％脫脂奶粉-TBST封閉液室溫下封閉60min；TBST洗膜。加入合適濃度(1∶1000至1∶2000)的一抗孵育4℃輕搖過夜。TBST洗膜加入合適濃度的結合HRP的二抗(1∶10000至1∶30000)及HRP-anti-biotin二抗(1∶5000)孵育室溫下輕搖60min。ECL或ECLplus顯影1分鐘後，將PVDF膜致於兩張乾淨的透明薄膜之間，在暗室中進X-線膠片曝光2秒-15分鐘不等。曝光後的膠片進行顯影及定影。結果經掃描成像系統成像。積雪草酸作用於大鼠肝星狀細胞，提取mRNA，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和實時定量聚合酶鏈反應(Real-TimePCR)1.信使核糖核酸(mRNA)抽提將各孔細胞的培養基棄去，用PBS緩衝液衝洗後在十二孔板的每個孔中加入350uL含有β2-巰基乙醇的RLT裂解液。輕輕搖晃使裂解液與細胞充分接觸後收集標本到1.5mL離心管中，按照QIAGEN公司RNeasyMiniKit(Cat74104)的說明書進行提取細胞的總RNA。2.逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)取質量為1.5ug的總RNA以Oligo(dT)為引物合成第一鏈cDNA(按試劑盒說明書進行)，反應試劑10XPCRBuffer2.0μL，50mMMgCl22.0μL，10mMdNTPs2.0μL，Oligo(dT)12-181.0μL，RnaseInhibitor1.0μL，M-MLV0.25μL，H2O9.75μL，RNA2.0μL，TotalVolume20μL.反應條件22℃10minutes，42℃15minutes，99℃5minutes，將cDNA-20℃保存備用。3.實時定量聚合酶鏈反應(Real-TimePCR)引物的序列如下RatSmad7FCGCTGTACCTTCCTCCGATRatSmad7RAGAAGATATCCAGGGAGGGCTCTTReal-TimePCR反應試劑2×iQSYBRGreenSupermix10μL，H2O7.2μL，Primer-10.4μL，Primer-20.4μL，DNA2μL，反應條件94℃，5min，循環條件94℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸42s。共擴增40個循環，最後一個循環後置72℃孵育5min。統計學分析使用SSPS統計軟體對所獲數據進行方差齊性分析，組間對比進行t檢驗。從以上實施例可知，積雪草酸確實在抗肝纖維化方面有著良好的藥效作用，積雪草酸確實可以用於製備抗肝纖維化的藥物。權利要求1.積雪草酸在製備抗肝纖維化藥物方面的用途。2.根據權利要求1所述的積雪草酸在製備藥物方面的用途，其中所述積雪草酸的分子結構式如下式所示全文摘要本發明公開了積雪草酸在製備藥物方面的新用途，特別是在製備抗肝纖維化藥物方面的用途。研究表明，積雪草酸確實在抗肝纖維化方面有著良好的藥效作用，積雪草酸確實可以用於製備抗肝纖維化方面的藥物。文檔編號A61P1/00GK1943579SQ20061012256公開日2007年4月11日申請日期2006年9月30日優先權日2006年9月30日發明者譚家駒,湯麗霞,楊光,藍輝耀申請人:佛山市第一人民醫院