銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因fimL及應用的製作方法

2023-06-04 19:06:06 2

專利名稱：銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因fimL及應用的製作方法
銅綠假單胞菌生tlW^細錢因M鵬用
技術領域：
本發明屬於微生物生,術領域，特別涉及一種銅綠假單胞菌生物豐 形成相關基
因，即鞭秘動相錢因力附z。
背景默銅綠假單胞菌(Pseucfofflo朋saenygi/wsa)屬假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，它是一 種分布廣泛的斜頓病菌，在臨床上，它能引起菌血病、耳、眼、^S軟組織、骨及關節、心內 膜和呼吸系統等的感染，是人類的三，病菌之一，是引趟巿炎的首，病菌。由於 有形成生 物TO等多重耐藥機制，耐藥率高，常在臨床上引^^員固性、難治性感染，成為臨床治療的棘手問 題。
細菌生物l鵬或稱為菌膜，是細菌為適應不禾啲自然環境、維持自身生命而發生的形態學變 化，形成一種有禾盱生存的棘的生命5腺。當生物體內的細菌處於生長發育不禾啲環境時，菌 體周邊會分泌多糖複合物，使細菌相互粘連，附^惰性物附fJ生物醫學材料或黏膜表面並將其 自身包繞在其中而形成的皿物，使細菌可以停留在一^HS宜的微環境中而不會被衝散。生物被
膜的這種特殊結構可以作為一種屏p章保護細菌抵禦抗an物的殺傷和mm宿主免疫系統的清除，
而成為潛在的感染源，導lfe隹治性臨床生t^鵬的相關感染。鞭毛介導的泳動(swimming motility) 和IV型菌毛介導的蹭動(twitchingmotility)都參與了生物柳莫的早期形成。其中，蹭動是f魏菌 在固相表面上，依靠IV型菌毛的收縮和延伸，向周圍運動的能力。
對生物M^形成機制的研究，國內尚未見相關報導。由於生物MH有非常重要的臨床意義，最近 幾年，已弓胞國外一些科學家的重視，使他們涉赴匕領職行研究。但其形成機制仍有許多未知 領域等待探索。目前已知，生物被膜的形成大致分為三步個體細胞的吸附；微菌落的形成；及 成突擬鵬的發育。我們對銅綠假單胞菌生物鵬形^"後錢因/m丄的研究可以±真補國內這"^頁域 的空白，並完善銅綠假單胞菌生物MIi^成的機理。
發明內容1本發明目的是^^綠假單胞菌生tM^^+目^S因、即鞭，動相關基因力w丄' 並用該基因為新藥耙點研製抑制銅綠假單胞菌的新型藥物。
本發明^的銅綠假單胞菌鞭^it動相關基因具有如序列表所示核苷 列，其基因 長度為1689bp，位ffl綠假單胞菌基因組169節10946—10950。
，的銅綠假單胞，^動相，因力m丄可以用於以該基因為新藥耙點設計並制MCM 物；以及在食品衛生和耐藥防治諸方面的鵬。
本發明基因的獲得方法^ffl人工Mu轉座fe^ (—種基於噬菌體Mu轉座子的轉座技術)，造 成銅綠假單胞菌基因突變，粒突變子文庫。臓曾動能力喪失的突變子，〗頓5amHI酶切基因 組DNA，酶切片段與pUC18載體連接，il31電轉化將連接，導入^lf桿菌DH5a，用卡那黴素和氨 節青黴素雙抗LB平板篩選陽性轉化子，測定轉化子中插入片段的核苷,列，發現Mu插入的基 因，確定此基因與銅綠假單胞MII^M動有相關性。
本發明的有^m:
實M現本發明基因的缺失f雜使IV型菌毛介導的蹭動能力喪失。
Mu插入失活的基因泳動能力喪失，說明此基因與銅綠假單胞mH毛的運動有關，3^t鞭^g 動相關新基因的發現以及揭^ff基因的功倉娜有指導意義。
ilii本發明，可以針對^j丄基因設計藥物，限制其正常毅，使得細菌無法iliilE斷話動形 成生辦鵬，斷氐其耐藥性，達到治療銅綠假單胞菌弓l起的感染的目的。

圖1題曾動能力喪失的陽性轉化子的蹭動運動檢測圖， 1 、野 PA68作為陽',照2、 ^ml::Mu PA68突變株 圖2是Mu克隆子酶切產物電泳圖，1、 DL15000 2、質粒3、質粒酶切 圖3是Mu轉座子PCR產物電泳圖(用PCR方法檢測轉化子的Mu轉座子)， 4、 DL20005、 Mu克卩好PCR產物。 用Mu-kam Pl和Mu-kam P2作為引物，克隆子質粒DNA為模板，可以擴增出700bp的特異性片 段，說明所檢測的克隆子質粒中攜帶著插入了 Mu轉座子的基因片段。
具體實lfi^1
^JS例i: ^fflMu轉座技術進行突變子文庫的^
(1) 將臨床分離糊綠假單胞菌PA68接種於50 ml L-broth培養基(10 g/L胰蛋白腺5 g/L酵 母粉，5g/LNaCl)中，37°C,200 rpm振蕩培微夜。
(2) 次日按l: 100接種至200mlL—broth培養基中，200ipm， 37。C培養至ODs4o"0.5，終止蹄。
(3) 於2。C 7000 g離心10 min，收集菌體。
(4) 依7細##^、、 1/2#|R、 1/5#|只在冰浴中預冷的300福蔗糖溶體織浮、洗滌菌體，2 。C畫g離心10min,倒淨賺。
(5) 根據菌體的多少用不同體積的300mM薪塘溶液混勻,並fflii活細胞計數製備，度約為1011 個cells/ml的感受態細胞。
(6) 將感受態細胞^g 100"滑， 一部分直接用於電轉化，1分在液氮中冷凍後，放—80 'C^II中保存。另一部分直接放一80"}*||保#^用。
(7) 取感受態細胞100 u 1、質粒pSMC28和Mu轉座復，約50ng，加入到在冰浴中預冷的0.2 cm 電轉化杯中(陰'艦照只加感受態細胞不加質粒)，在Bio-Rad電穿孑W灶設置電容25nF，電阻 200 Wf口戰的電壓誠電擊。
(8) 電擊後將轉化體系轉入職37。C溫浴的900ulL-broth培養基中。37°C， 225rpm，培養1 h 。
(9) 取100 u L菌液塗布於50 P g/ral Km抗性平feh，溫箱37°C過夜±咅養，24小時後即可觀察結 果。
(10) 腿夜培養的篩選平肚挑取數個菌落，分別接種到1 ral的L一broth中，37。C， 200卬m 振蕩培養16_18 h。
(11) 取2ul菌漸射鎌，以AIMu轉座子上的特異序列Mul (5， -GCAACTGTCCATACTCTGA-3，) 和Mu2 (5， - CGCTGGGTTTATCGTCGA-3')做引物，用PCR方法擴增Mu轉座子片段。同時分別以 銅綠假單胞離株M粒pHTH2做陰'股陽'斷照。擴增^f牛為，先在94。C職性15min，然後， 94。C變性l min， 55。C退火1 min， 72。C延伸1 min，共30個循環，翻72。C延伸10 min。
(12) PCR產鵬0. 8%瓊脂撒鵬中電泳檢測，EB染船紫外燈下觀察結果並留照片，具有700bp 卡那黴素抗性基因的轉化子即為Mu轉座復，轉化子。
實施例2:突變子的蹭動能力的檢測
(1) 在無菌塑料培養皿內鋪上一層蹭動能力檢測培養基[10g/L胰蛋白腖，5g/L酵職，5g/LNaCl， 1% (W/V)顆粒狀瓊月識]。
(2) 從Mu轉座子突變文庫中活化突變菌株。
(3) 用滅菌的牙^t兆取皿，乎UtS曾動培養基，將細菌接種到培養基下面的塑料平皿上，37'C1咅養
24小時。
(4) 細菌就會 IV型菌毛的收縮和伸展在培養基TM的塑料表面以接種點為圓心，向周圍蔓延生
長，產生圓形的菌暈。
(5) 將培養難輕揭去，用考馬司爛她液(10%乙酸，0.06%#馬司賠)她塑料平皿20分 沐倒掉染液，用自彩K衝,皿lmin，觀察細菌因蹭動而產生的環，篩淑曾動能力喪失或減弱 的突變子(圖1)。
實施例3:銅綠假單胞菌生物^ 自皿因的克隆 1 Mu轉座復』轉化子基因組DNA的提取
(1) 將銅綠假單胞菌Mu轉座復激轉化子接於5mL LB液體i歸基中，30°C 200r/min過夜培養。
(2) 4°C 5000r/min離心10射中，棄上清，菌體重懸於200^翻早緩衝液。
(3) 加入4tiL 10 mg/ml的RNase， 37。C7JC浴30射中。
(4) 加入8pL 20 mg/mL的蛋白酶K， 20% SDS 5&，於56。C7JC浴30射中。
(5) 分另傭等#^只苯酚，苯酚:氯仿(1:1)和氯仿# 提1次，12000r/min離心10 5Ht。
(6) 加入2倍^f只冷凍的^7jC乙醇，於-20'C放置30射中。
(7) 挑出DNA， 70%乙瞎先滌2次，真空千燥。
(8) 溶於50mL TE， -20°(:保存。 2大量提取大腸桿菌質粒pUC18
(1) 25mL液體LB培養基，接入攜帶質粒pUQ8的 [桿菌單皿，3CTC、 200r/min培養過夜。
(2) 菌液的OD6oo歡於1.0後，4。C 6000r/min離心10倂中，棄上清。
(3) 加STE溶液(100mMNaCl， 10 mMTris. Cl pH8. 0, lrnMEDTA) 12.5mL洗細胞，4°C 6000r/min 離心10恤棄上清。
(4) 加溶液I (50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25mM Tris.Cl， pH8.0) 0. 5mL再向各管中加入溶 菌酶(反應濃度20^ig/mL)，輕微混，37。C7]C浴15-30min。
(5) 加溶液II (0.2 M NaOH, 1% SDS) lmL輕輕混勻至透明，冰浴10射中。
(6) 加入溶液in (3 M KAc， 5 M乙酸，pH4.8) 0.75mL劇烈振蕩後，冰浴30射中。
(7) 4°C 12000r/min離心5併中，肚清。
(8) 力口入0. 7 ^f只的異丙醇，室^fi 15溯。
(9) 4'C 12000r/min離心10辦中，棄上清。
(10) 力口入100^L TE溶液溶解核酸。
(11) 力口入RNase (反應濃度為100^ig/rnL) 37。C7JC浴30 ^H中。
(12) ^^P凍酚:氯仿(1:1)，抽提，振蕩均勻，4°C 12000r/min離心15射中，社清。
(13) 加入2 ft^f只的^7K乙醇和1/10 #|只的3mol/LNaAc (pH4.8)， -20。C體20倂t沉澱DNA。
(14) 4'C 12000r/min離心10溯，棄上清。
(15) 加入lmL70。/。的冷乙^ 先DNA沉澱兩次，乾燥。
(16) 加入50nLTE溶解質粒，-2(TC保存。
3基因組DNA和質粒pUC18的酶切(50^L體系) 10 X buffer 5uL
fern HI 2 ia
DNA 10 PL
ddH20 33 y L
混勻，30。C水浴過夜。 4酶的滅活與純化
(1) 酶切體系置於65。C7K浴15艦之後降鼓溫。
(2) TE補^400&，等^f只的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(3) 加入2倍^f只的^7K乙醇和1/10 ^R的3mol/LNaAc (pH4. 8)， -20。C方j[K 20辦t沉澱DNA。
(4) 4°C 12000r/min離心10併中，棄上清。
(5) 加入lmL7W。的冷乙IMDNA沉澱兩次，真空千燥。
(6) pUC18溶於88nL lm mol/L Tris~Cl，基因組DNA溶於l^iL TE。 5 pUC18去磷酸化
pUC18 88|oL
lOXbuffer lO^L CIAP (鹼性磷酸酶) 2pL 置於37。C7K浴30^H中。 6去磷酸化酶的除去-
(1) TE補^200^iL，加入2pL 0.5 mol/L EDTA。
(2) 75。CtR浴10倂中，使酶失活，並降S^溫。
(3) 等^f只的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(4) 加入2倍^f只的5^JC乙醇和1/10 #|只的3mol/L NaAc (pH4. 8)， -2CTC方爐20倂t沉澱DNA。
(5) 4°C 12000r/min離心10倂中，棄上清。
(6) 加入lmL7(^的冷乙il^DNA沉澱兩次，真空千燥。
(7) 繊溶於5|A ddH20中。 ， 7基因組DNA和質粒pUC18的連接(15^1體系)
DNA 1mL ddH20 IO^iL pUC18 W
混勻，45。C7]C浴5粥中後，ffiil冰浴，再加T4連接酶1.5pL， 10Xbuffer 1.5^iL， 14-16。C 水浴過夜。
8連接產物的處理
(1) TE補^200^iL。
(2) 加入2倍^f只的^7]C乙醇和1/10 ^fR的3raol/L NaAc (pH4. 8)， -20。C方JCS 20併t沉澱DNA。
(3) 4°C 12000r/min離心10 ^!中，棄上清。
(4) 加入lraL7(F。的冷乙醇洗DNA沉澱兩次，真空乾燥。
(5) 沉澱溶於5pL ddH20中。
9 ;yg桿菌DH5a感受態細胞的製備
(1)將;^桿菌單鵬接種於5mLLB液體培養基中，37°C、 200轉/併中過夜培養。
(2) 過夜培養的菌液按l: lOO接種於lOOmL LB液體培養基中，37°C、 220 r/min振蕩培養。
(3) 菌液OD柳在0.5-0.6之間時終止培養並置於冰上。
(4) 轉移至250mL離心中，4°C、 6000r/min離心10min，雌菌體。
(5) 100mL預冷的ddH2O懸浮洗滌細胞，4°C 6000r/min離心10併中，收集菌體。
(6) 50mL預冷的l(F。甘油懸浮洗滌細胞，4°C 6000r/min離心10併中，收集菌體。
(7) 用2mL予敬令的lTO甘油懸浮洗滌細胞，4'C 6000r/min離心10溯，棄上清，儘量吸乾管壁 上的殘留液體。
(8) 用200mL預冷的10T。甘油培養基S1;細胞。
(9) 100倍稀釋後測菌液OD6Go，用預冷的10%甘油培養液將菌液稀釋至濃度為2xl0""-3xl(^個 細BS/mL (100600約相當於2>101個細11/1111)。
(10) 將菌液，，每管95pL。用於電轉4fc^-7(TC保存。
大腸桿菌DH5a的電轉化方法
(1) 5^ DNA連接產物與95pL大腸桿菌感受態細胞混勻，冰浴5-10射中。
(2) 混^tl轉移至預冷的0.2cm電轉化杯中(陰',照不加混合物，只加感受態細胞)，在Bio-Rad 電轉化處設置2.50kv，進行電擊。
(3) 從電轉化杯中吸出電轉化體系，並用lmL37X:預熱的S0C液體培養基(20^胰蛋白腖，5g/L 酵^ih 0.5g/LNaC120mM葡萄糖，10mM氯化鎂)稀釋後，37°C， 150轉/併中培養1小時。
(4) 菌液，塗布於含20咖ol/L MgS04 50pg/mL卡那黴素和IOO嗎/mL氨節青黴素的LB固體 培養基上，37。C倒置過夜培養。
克隆子的篩選、鑑定
(1) /Aa夜培養的艦平feJ:挑取轉化子，小量提M粒，用限制性內切酶MI酶切，並以 pUC185a/ H I酶切產物為對照。
(2) 以DL15000為DNA標準，在O. 8%瓊脂撒 中電泳檢測鑑定，釤隨同時具有pUC18載體帶 和外源目的基因帶的克隆子(圖2)。
(3) 同時以從轉化子中提取的質粒為糹鎌，用Mu轉座子DNA片段的Mu轉座子檢測弓卿Mu-kam Pl和Mu-kara P2進行PCR (具^^"法同實施例1中皿)。電泳檢測PCR產物，以DL2000為DNA標準， 以質粒pHTH2為頓照，若能擴增出700bp的特異性帶，貝i脫明轉化子質粒中含有AXMu轉座子 DNA片段，克隆^i力(圖3)。 (4)對成功克隆的轉化子質^ffl行測序。 12克隆子質粒的DNA測序
將用15%甘油管保存的轉化子菌液，用以Mii轉座子兩端的反向序列為依據設計的AM42P2作為 引ttiS行測序。^Lt海英俊公司進行DNA測序，測定轉座子插入位點側翼的核苷,列。
13.基因推斷
測序結果在銅綠假單胞菌的基因組資料庫(http〃www. pseudomonas.com)或GenBank (http:〃麗.ncbi. nlm. nih.印v/)的BLAST中進行序列t瀏最終發5^f需基因。
序列表
南開大學
<120〉銅綠假單胞菌生物W^細錢因何^Zffl
<160〉 1
〈10>1
<211〉1689
〈12>DNA
<213〉銅綠假單胞菌(ftm/cww)way am/^ ay") 1
atggtcacag gagccacgtc cctcagtctg gtgcgcgacg agttgttcgc caccatggaa 60 c郷ccgaac agggtcttga gcagttcatt gccgagcggc agaatggcag cctactgcag 120 cacgccgtcg aatgcctgca acagatccgc ggcaccctca acctgatcga gctggccggc 180 gccgagctgc tggcccagga agccctgcag ctggcgaccg acattcccac cggcgtcagc 240 gaggagcgcg acggccagct ggcagccctg ggcaacgccc tgtacgtgct gcgccgctac 300 ctggagaacg tcgaggccaa tcgccaggag atccccgaac tgctcttgcc ggcgatcaac 360 gaagtgcgct gtgccgcagg gcagccggcg ctgccggaaa gtttcttctt cagcgcccga 420 ctggatatcc cgcggccgcc gagcaccgcc atcgaccacc tgccttccga agccgaactg 480 ggcgaggaaa gccggcggat gcgccacatg taxxagatcg gcctgctcgg gctgatccgc 540 gaacagaacc tctatcccag cctcaagttg atgggccgcg cgctggcgcg cctcgacagc 600 ctgcacggcg gggtggcccg ttcgcggctg tgctggatcg gcgccgcggc gatcgagtcg 660 atcgtcgatg gccaactgtt gccacgcaag tcgcgtaagc aactgttctc gcgcatcgac 720 cgcgagctca agcaattgct gatcggccct gcctacgagg cgccgcgcca tctgctcaag 780 gaactgcttt acctggtggc gctgtccgat ggccagggcc cgcgttcgcg cgaggtccgc 840 gaactgcttg ggctggcgcc gctgccgttc accgaccact tgctggaaga ggaatcgcag ■ cgcttgtccg gtcccggcca gtcggtgatg cgttcgctgt ccacggcgat ccgcgaggaa 960 ctcgccgggg tcaaggacat gctcgacctg atcgagcgcg gcgtggccca gccggacagc 1020 ctgaccaacc tgcatgcgca actgggcaag aactcggccg gcaccgccct gcagacccag ggcgtcgccg attcgccgcc ggcgttgctg agcatggtcg gcaacctcga gcgcggcgag cccgggcagg aagccgatgc attcgccgtg atcg鄉鄉ccaaggccgg cctggccctg tccaatggcg acaagctcaa cctggccaac ggtctctggt tcctcggtca ggagcgcgcc atccagcagc gcatgatcga gaccgcgcag gccgacgccc tgaccagtct cgaatactat ggccagccgg acgtcctcga cctcgccagc gccgcctga
ctgagcaaga ccctcggcat ggtcggcctg 1080 ctacccaccg tggccgcctg ggctgccagc 1140 cgcctggccg atgcggtgct ctacgtggaa 1200 cgccgcatca tccggccgac tccggcggag 1260 caccagttgg ccgaggcgcg catcgtggtg 1320 gccaagcgtg cgatcaccgc gtacctggaa 1380 gtcccggcca gcctgcaggc ggtccggggt 1440 gcgctgctgg tcggcggctg cgccgactac 1500 已tgccgtcgg aacagatgct ggaaaccctc 1560 ctcgagggcg gtgccgtgct gcgtccgcag 1620 gccagcgtca aggcgctcgg actgccggtg 1680
1689
權利要求
1、一種銅綠假單胞菌鞭毛運動相關基因fimL，其核苷酸序列如序列表所示，其基因長度為1689bp，位於銅綠假單胞菌基因組169節10946-10950。
2、 權利要求l戶脫的銅綠假單胞繊秘動相錢因7 m/:的應用，用於以該基因為新艦 點設計並制紘鵬物。
全文摘要
本發明公開了銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因fimL。屬於微生物生物技術領域。本發明與銅綠假單胞菌致病性的研究息息相關，此基因大小為1689bp，國際上對該基因的功能沒有報導。實驗發現該基因的缺失能夠使IV型菌毛介導的蹭動能力喪失。IV型菌毛及它所介導的蹭動在銅綠假單胞菌生物被膜形成的早期起著必不可少的作用。生物被膜的形成提高了銅綠假單胞菌的耐藥性，常在臨床上引起頑固性、難治性感染，成為臨床治療的棘手問題。用銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因fimL為新藥靶點研製抗菌藥物，為臨床治療和耐藥防治服務。
文檔編號C12N15/31GK101195826SQ20071006018
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月26日 優先權日2007年12月26日
發明者喬明強, 單志英, 張秀明, 徐海津, 芳 白, 白豔玲 申請人:南開大學