生產人胰島素的製作方法

2023-06-04 03:04:41

專利名稱：：生產人胰島素的製作方法這是美國系列申請08/175298，1993年12月29日申請的接續申請。
背景技術：
：在本發明說明書中，用括號內的阿拉伯數字列出了各種文獻。在說明書後，權利要求前可以找到這些參考文獻的所有引述。將這些文獻公開的所有內容均引入本說明書作為參考以便更全面地描述本發明所涉及的現有技術的狀態。胰島素是控制葡萄糖代謝所必需的多肽激素，每天施用給患糖尿病的患者，糖尿病是胰島素供應不足而引起的代謝紊亂。體內，首先將該激素合成成長前體分子，隨後加工成由A和B鏈組成的其生物活性形式。更詳細地說，在內分泌胰腺的β細胞內，將前原胰島素的基因轉錄成mRNA前體，然後剪接生產成熟mRNA。將所述mRNA翻譯成前原胰島素(NH2-前區-B鏈-C肽-A鏈-COOH)，接著再加工成胰島素原並最終加工成胰島素。該過程的第一步就是蛋白水解除去前區，該區是通過內質網的微粒體膜來轉移新鏈的疏水信號序列。在人前原胰島素中，前區的長度是24個胺基酸。在胰島素原中，將變成成熟胰島素的多肽鏈的兩個區，B-和A鏈通過C肽(或C-鏈)彼此相連，所述C肽在N和C末端含有兩對鹼性胺基酸。在大多數C肽中，這些配對是Arg-Arg和Lys-Arg。人C肽，包括兩個側對的鹼性胺基酸，含有35個胺基酸。C肽與所述多肽的兩個部分相連以便有助於在B和A片段之間形成二硫鍵。因此，C肽的作用很大程度上不依賴其結構。事實上，用較短的合成橋鍵代替仍能適當地摺疊胰島素原分子(1，2)。胰島素原摺疊，同時發生兩個鏈間二硫鍵和一個A鏈二硫鍵的氧化。在成熟化的最後階段，蛋白水解酶在鹼性胺基酸處裂解以釋放C肽並形成成熟胰島素(3)。在人胰島素中，A鏈有21個胺基酸，B鏈有30個胺基酸。世界上每年胰島素的需求超過數噸，而且嚴重供不應求。傳統上，胰島素是從有限的動物源中生產的，主要是牛和豬胰腺製品，它們不同於人胰島素，因此會引發有害的免疫反應。在六十年代完成的研究表明，可以體外生產胰島素。通過用其S-磺化形式(4)將A和B鏈結合或通過自發再氧化還原的胰島素原(5)來合成胰島素。後一種方法由於在氧化混合物中蛋白質濃度很低，不能用於大規模生產胰島素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B處理後(6)，可以回收胰島素。最近半合成和生物合成的(重組)人胰島素也可以得到。半合成的人胰島素是通過胰蛋白酶催化B鏈30位的Ala換成Thr(是豬胰島素和人胰島素之間的唯一不同)而從豬胰島素生產的。在大腸桿菌或酵母中生產的重組人胰島素最終將取代所有其它生產途徑。現在通過兩種途徑製備半合成重組人胰島素在大腸桿菌中分開生產A和B鏈，然後將其結合在一起(7，8)，或酶促轉變在大腸桿菌(1，8)或酵母(2，9)中表達的胰島素原等多肽。在大多數情況下，胰島素原是作為雜種蛋白質而生產的，以細胞內沉澱蛋白質的形式積累。正常純化所述雜交物，然後用CNBr裂解以釋放胰島素原多肽。後者再通過氧化亞硫酸水解(sulfitolysis)修飾得到胰島素原S-磺酸鹽。然後在還原條件下純化並摺疊胰島素原S-磺酸鹽，得到胰島素原(8)。通過胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的聯合作用將胰島素原轉變成胰島素。專利公開EP195691(NovoNordiskA/B)描述了分子式為B-Lys-Arg-A的胰島素原以及其用於在酵母中製備胰島素的用途。專利公開EP196056B1(ChironCorp.，)描述了用酵母生產的hSOD-胰島素原蛋白質。在摺疊前，使hSOD-胰島素原蛋白質經溴化氰裂解和亞硫酸水解。Hoechst在EPO379162中描述了可以將』胰島素前體的錯重組體「(即，有不正確或部分不正確分子間二硫鍵的重組胰島素產物)不通過亞硫酸水解，而是在有機氧化還原系統的存在的條件下，在含水介質中通過將錯重組體與過量硫醇反應而轉變成正確的胰島素產物。在胺基酸或肽基從融合多肽裂解後(化學或酶促)(發生在宿主細胞溶解後)進行源(original)亞硫酸水解(sulfitolysis)步驟，因為然後要將胰島素前體的6個半胱氨酸轉變成其S-磺酸鹽。在隨後的復性步驟中，通過形成三個正確的二硫鍵而從所述胰島素原S-磺酸鹽生產天然胰島素原。在該復性步驟，產生了所謂「錯重組體」。Hoechst在PCTWO91/03550中還公開了製備含所需蛋白質(如胰島素原)和「平衡組分」的方法。亞硫酸水解在摺疊前完成，而在摺疊後，與胰島素原的C-鏈同時裂解掉「平衡組分」。另外，Hoechst在EP347781B1中描述了「小胰島素原」(B-Arg-A)和其用於致病單-Arg胰島素和胰島素的用途。他們還描述了含有B-Arg-A和「平衡組分」的融合蛋白質。在摺疊多肽前，用溴化氰裂解「平衡組分」並完成亞硫酸水解。本發明公開了用改進並有效的方法生產重組人胰島素。在大腸桿菌中合成含有前導序列的重組胰島素原雜種多肽。部分純化後，在可以進行之前摺疊的條件下，將其摺疊，但仍連接著前導肽。然後通過用胰蛋白酶和羧肽酶B結合處理而產生有生物活性的人胰島素，其中這些酶同時裂解掉了前導肽和C鏈。因此生產的純化人胰島素與天然產生的人胰島素相同。在雜種多肽的CNBr裂解和用於保護豐富SH基團的亞硫酸水解中所涉及的有害和麻煩的過程在所述新方法中除去了，因為可以將完整的胰島素原雜種多肽有效摺疊成其天然結構，甚至是在存在前導肽和未保護的半胱氨酸的情況下。通過酶促裂解釋放活性重組人胰島素，然後將其純化。附圖的簡要描述在附圖3-5中所列三個質粒的限制圖譜中，並未鑑定出在這些質粒上的所有限制位點。但是，列出了完全理解本發明所必需的那些限制位點。圖1通過酶促裂解表達質粒pBAST-R而產生的摺疊的、二硫鍵結合的胰島素原雜種多肽，從而得到人胰島素。只表明了部分SOD前導序列。圖2通過酶促裂解表達質粒pBAST-LAT或質粒pλBAST-LAT而產生的摺疊的、二硫鍵結合的胰島素原雜種多肽，從而得到人胰島素。只表明了部分SOD前導序列。圖3質粒pBAST-R的結構，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達質粒，保藏號為ATCC69362。圖4質粒pDBAST-LAT的結構，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達質粒，保藏號為ATCC69361。圖5質粒pλBAST-LAT的結構，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達質粒，保藏號為ATCC69363。圖6用質粒pBAST-R表達的SOD-胰島素原雜種多肽的胺基酸序列和相應的DNA核苷酸序列。圖7用質粒pDBAST-LAT和pλBAST-LAT表達的SOD-胰島素原雜種多肽的胺基酸序列和相應的DNA核苷酸序列。圖8人胰島素生產，來自用質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽，作為摺疊混合物pH的函數。在4℃，經16小時，用1mg/ml或0.5mg/ml雜種多肽，在100mM甘油中，於不同pH完成胰島素原雜種多肽的摺疊(按實施例2所述生產的)。37℃，pH9用(胰蛋白酶1∶500w/w)(Sigma)和羧肽酶B(CPB，Sigma，1∶200w/w)將摺疊材料處理30分鐘，然後通過利用1251-胰島素(Amersham)和人重組胰島素(Calbiochem)為標準的放射性免疫檢測法檢測免疫反應性(IR)。圖9用質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產人胰島素將胰島素原雜種多肽(按實施例2所述生產的)溶解在8M脲，濃度為約30mg/ml的5mMHCl，然後用100mM甘油-NaOH稀釋到1mg/ml，pH11.0中。在22℃(室溫)摺疊20小時。然後用HCl將pH調到8.8。加入羧肽酶B(1∶1000w/w，Sigma)和胰蛋白酶(1∶2000w/w，Sigma)在37℃將反應混合物保溫60分鐘。在用10mMHCl稀釋前，將消化混合物酸化到pH3。在250×4mm，5μLichrosphere100RP-8柱(Merch)上，通過反相高壓液體層析(RP-HPLC)分析150μl的樣品，所述柱用含31.5％(v/v)乙腈的50mM磷酸四乙胺，162mMNacl4，pH3平衡。用31.5％-40.5％乙腈的現象梯度，在75分鐘內，以1ml/分的流速使該柱展開。檢測在220nm的吸收值。A5ug標準胰島素(Boehringer-Mannheim)；B酶促處理後產生的重組人胰島素；C摺疊的SOD-胰島素原雜種多肽。圖10質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產人胰島素作為摺疊混合物中pH的函數將胰島素原雜種多肽(按實施例2中所述生產的)用有標明pH值的100mM甘油-NaOH緩衝液稀釋到1mg/ml，然後在22℃摺疊16小時。按圖9所述完成酶處理和RP-HPLC分析。根據與標準胰島素有相同滯留時間的峰的面積計算從雜種多肽產生的重組人胰島素的量。圖11質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產人胰島素作為摺疊混合物中抗壞血酸濃度的函數存在標明抗壞血酸濃度的條件下，在100mM甘油-NaOH，pH11.2中，於22℃以1mg/ml摺疊SOD-胰島素原雜種多肽(按實施例2所述生產的)。在5和25小時的摺疊過程後，用胰蛋白酶和羧肽酶B(按圖9)處理樣品。在RP-HPLC(按圖9)上分析重組人胰島素產品。圖12從質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產的人胰島素的可靠性22℃，，在100mM甘油-NaOH，pH11.2和1.2mM抗壞血酸中，22℃以1mg/ml摺疊SOD-胰島素原雜種多肽16小時。酶處理後(按圖9)，在用20mMTris-HCl，pH8平衡的DEAE-Sepharose柱上層析分析所述混合物。用在20mMTris-HCl，pH8中0-0.4M的NaCl現象梯度洗脫重組人胰島素。收集峰部分，然後用HCl酸化到pH3。再按圖9所述，用RP-HPLC從胰島素樣分子進一步純化重組人胰島素。收集主峰，用0.25M乙酸在SephadexG-25柱上脫鹽，然後凍幹。用製備於10mMHCl中的樣品(5ug重組人胰島素)，在相同的條件下用RP-HPLC分析。A標準胰島素；BHPLC純化的重組人胰島素；CHPLC純化的重組人胰島素和標準胰島素的組合樣品。圖13從質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產的人胰島素作為蛋白質濃度的函數在100mM甘油-NaOH，pH11.2中，按標明的0.5mg/ml-10mg/ml的終蛋白質濃度，摺疊SOD-胰島素原雜種多肽(按照實施例2所述生產的)。用每molSH基2.5mol抗壞血酸補充各摺疊混合物。24℃(室溫)摺疊16小時。按照圖9中的描述完成酶促處理和RP-HPLC分析。圖14用質粒pDBAST-LAT表達的，來自粗細胞內沉澱的胰島素原雜種多肽生產的人胰島素，作為摺疊時間的函數以每ml約2.6A280的濃度，將細胞內沉澱溶解在20mM甘油-NaOH，33uMEDTA，pH11.2中。用10N氫氧化鈉將pH調到12。將溶液放置並攪拌10分鐘。用濃縮的鹽酸將pH滴到11.2。加入活化的活性炭(酸洗滌的，Sigma)到0.1％w/v的終濃度，然後將混合物攪拌30分鐘。澄清上清液的A280為約2.15。補充抗壞血酸達到3mM終濃度。在室溫(22-23℃)劇烈攪拌，按所示摺疊胰島素原雜種多肽。在試驗的不同時間點(從溶解開始)，依次取10ml樣品，滴到pH8.8，然後存在50uMZnCl2的條件下，用羧肽酶B(1∶1000w/w)和胰蛋白酶(1∶2000w/w)消化。按圖9所述，用RP-HPLC分析確定各消化樣品中的胰島素含量。根據胰島素的增加(消化後)，游離SH基降低的水平確定摺疊反應的進展，用Ellman反應(16)檢測後者。本發明概述本發明提供了生產人胰島素的方法，包括在允許正確二硫鍵形成的條件下，摺疊含胰島素原的雜種多肽，使摺疊的，二硫鍵結合的雜種多肽經酶促裂解產生活性人胰島素，然後純化活性人胰島素。本發明還提供了含胰島素原以及與所述胰島素原N-末端相連的前導肽的多肽，其中所述多肽被摺疊，並含有正確的二硫鍵。本發明的詳細描述按照並符合布達佩斯條約對用於質粒目的的微生物保藏之國際承認的要求，將在大腸桿菌中的質粒pBAST-R，pDBAST-LAT，pλBAST-LAT於1993年7月26日保藏在美國典型培養物收集中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rochville，Maryland20852)保藏號分別為69362，69361和69363。如本文所用的，雜種多肽含有與所需多肽共價相連的前導肽。本發明的雜種多肽含有胰島素原，優選含有作為前導肽的SOD。如本文所用的，摺疊包括摺疊雜種多肽，所述雜種多肽含有在摺疊前，未用CNBr裂解，而且在摺疊前未進行亞硫酸水解以保護SH基團的胰島素原，其中摺疊可以使得在所述雜種多肽中形成正確的二硫鍵。如本文所用的，雜種多肽形成正確的二硫鍵包括在胰島素的CysB7-CysA20，CysB19-CysA20和CysA6-CysA11之間形成三個二硫鍵(按照成熟胰島素中的編號標註Cys殘基)。如本文所用的，胰島素原含有包括胰島素B，C和A鏈，從N-末端到C-末端的多肽。如本文所用的，胰島素的C-鏈肽含有天然產生的C-肽和任何其它可以通過胰蛋白酶和羧肽酶B裂解的寡肽，二肽或單胺基酸。如本文所用的，前導肽含有與胰島素B鏈共價相連的任何肽或多肽，所述前導肽使得可以進行摺疊並形成二硫鍵，而且可以用胰蛋白酶裂解。前導肽優選是SOD。如本文所用的，SOD包括任何實質部分的CuZnSOD或MnSOD的胺基酸序列，而且所述部分不必有SOD的生物學活性，與天然產生的SOD的胺基酸序列相比，所述部分也不必有相同的胺基酸序列。用本領域已知的方法，如Bauer等人(1985)，Gene，3773-81可以突變編碼SOD的DNA。前導肽除SOD外，可包括任何其它肽，多肽或蛋白質或任何所述肽，多肽或蛋白質之任何實質部分的胺基酸序列，其中所述部分既不必有是肽，多肽或蛋白質的生物學活性，與天然產生的肽，多肽或蛋白質相比，所述部分也不必有相同的胺基酸序列；然而，前導肽必須允許雜種多肽摺疊並形成正確的二硫鍵。如本文所用的，胰島素可以包括天然胰島素的同系物。如本文所用的，胰島素原可以包括天然胰島素原的同系物。如本文所用的，與用本發明方法生產的胰島素多肽有關的術語「同系物」指與胰島素有基本上相同的胺基酸序列和基本上相同的生物學活性的多肽。因此，同系物可以因一個或多個非必需胺基酸殘基的增加，缺失或取代而不同於用本發明方法生產的胰島素多肽，只要所得的多肽保留了胰島素的生物學活性。本領域技術人員用熟知的方法，包括，例如用於設計製備DNA序列的常規方法，所述DNA序列用於細菌表達多肽之多肽同系物，通過定點誘變技術修飾cDNA和基因組序列，構建重組蛋白質和表達載體，細菌表達多肽以及用常規生物化學方法檢測多肽的生物化學活性，很容易確定可以增加，缺失或取代哪個胺基酸(包括可以用哪個胺基酸進行取代)。胰島素同系物的上述定義等同用於胰島素原的同系物。用本發明方法生產的胰島素同系物的實例是含有少於天然胰島素之所有殘基的缺失同系物，其中一個或多個特定殘基由其它殘基取代的取代同系物以及其中一個或多個胺基酸殘基增加到所述胰島素多肽末端或中間部分的增加同系物，所有這些均有胰島素的生物學活性。同系物的實例是在EPO專利申請EP384472中公開的類似物以及在「EliLillyandCompanyReporttoShareholder1992」中公開的EliLilly的胰島素類似物「Humalog」。本文將基本上相同的胺基酸序列定義為包括胺基酸序列中的取代和/或缺失和/或增加，而且根據例如由AlbertL.Lehninger，Biochemistry，第二版，WorthPublishersInc.(1975)，第4章；Creighton，蛋白質結構，實踐方法，IPLPressatOxfordUniversityPress，Oxford，England(1989)；和MargaretO.Dayhoff，AtlasofProteinSequenceandStructure，Vol.5，TheNationalBiomedicalResearchFoundation(1972)，Chapter9描述的同源或等同基團，可包括最多達10個殘基。所述取代是本領域專業人員熟知的。用本領域專業人員熟知的方法，例如Baueretal.，(1985)，Gene3773-81可以突變編碼胰島素多肽的DNA。胺本文所述，可以將突變序列插入到適宜的表達載體中，再將所述載體導入到然後再處理的細胞中，以便突變的DNA表達多肽同系物。含有編碼含胰島素原之雜種多肽的序列的本發明質粒可以在細菌，酵母，真菌或哺乳動物細胞如CHO，雞胚胎，成纖維母細胞或其它已知的細胞系中表達，它們通常還含有在細菌，酵母，真菌或哺乳動物細胞中表達克隆基因所必需的調節元件，隨編碼雜種多肽的核酸這樣定位，以便使其進行表達。表達所需的調節元件包括與RAN聚合酶結合的啟動子序列和與核糖體結合的核糖體結合位點。本發明的質粒表達含胰島素原的雜種多肽。本發明的專業人員可以理解用已知技術(如通過定點誘變或插入接頭)可以很容易改變與本申請有關的保藏的質粒以表達同源多肽。在例如SambrookJ.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)分子克隆實驗室操作手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社中描述了所述技術。適宜的調節元件位於與編碼含胰島素原之多肽的DNA有關的質粒內，以便在適宜的宿主細胞中影響所述雜種多肽的表達。在本發明優選的實施方案中，調節元件位於編碼雜種多肽之DNA的附近和上遊。本發明還包括各種核糖體結合位點(RBS)，用於提供從編碼含胰島素原之雜種多肽的DNA轉錄的mRNA，以便結合宿主細胞內的核糖體，如deoRBS。本發明的質粒還含有ATG起始密碼子。編碼含胰島素原之雜種多肽的DNA與ATG起始密碼子同相。本發明的質粒還包括含複製源點的DNA序列，它們來自細菌質粒，能夠在宿主細胞中自主複製。可以從各種來源得到適宜的複製源點，如從質粒pBR322(ATCCNo.37016)中得到。本發明質粒含包括含與可選擇或可鑑定表型特徵相關之基因的DNA序列，如藥物抗性基因，如氨苄青黴素抗性，氯黴素或青黴素抗性，當質粒存在於宿主中時，所述表型特徵就會顯出。可用於表達編碼雜種多肽(含胰島素原)的載體的實例是病毒，如細菌病毒，如噬菌體(如λ噬菌體)，粘粒，質粒和其它載體。用本領域熟知的方法，將編碼含胰島素原之雜種多肽的基因插入到適宜的載體中。例如用常規的限制核酸內切酶位點，可以裂解插入片段和載體DNA以產生剪接配對的互補末端，然後用DNA連接酶連在一起。另外，可以將含與載體DNA中的限制位點互補之鹼基序列的合成接頭與插入DNA相連，然後用在給位點切割的限制酶消化。也可以施用其它方法。優選的細菌宿主細胞是大腸桿菌細胞。適宜大腸桿菌細胞的適宜是菌株Sφ733(cytRstrA)或4300，但也可以用其它大腸桿菌菌株和其它細菌作為質粒的宿主。作為宿主的細菌可以是任何菌株，包括營養缺陷型(如A1645)，原養型(如A4255)和裂解菌株；F+和F-菌株；含λ原噬菌體之cI857阻遏物序列的菌株(如A1645和A4255)以及沒有deo阻遏物和/或deo基因的菌株(參見歐洲專利申請公開030972，1989年2月22日公開)。已經將大腸桿菌菌株φ733和大腸桿菌菌株4300保藏在ATCC，保藏號分別為69361和69363。用本領域熟知的方法，如R.PNovick(Bacteriol.Review33,210(1969))所述的，所有上述大腸桿菌宿主菌株都可能是它們所攜帶質粒的「cured」。本發明提供了生產胰島素的方法，包括在允許形成正確二硫鍵的條件下摺疊含胰島素原的雜種多肽，使(處理)摺疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽經酶促裂解以產生胰島素，然後純化胰島素。所述胰島素具有市售人胰島素的活性和特性。在優選的實施方案中，摺疊包括在4-37℃，將雜種多肽在約pH8.5-12.0保溫約1-30小時。在另一優選的實施方案中，摺疊包括在存在抗壞血酸的條件下，在4-37℃，將雜種多肽在約pH8.5-12.0保溫約1-30小時。在特別優選的實施方案中，摺疊期間的pH為11.0-11.25。在另一特別優選的實施方案中，摺疊混合物中抗壞血酸的濃度為約每摩爾SH基團約2摩爾抗壞血酸。在另一實施方案中，保溫時間為約5小時。在另一實施方案中，處理包括將pH調整到約8.8-9.0，然後在16-37℃，用胰蛋白酶和羧肽酶B將雜種多肽裂解約30分鐘到16小時。在另一實施方案中，純化包括DEAE-Sepharose層析和RP-HPLC。在另一實施方案中，純化還包括超濾和CM-Sepharose層析。在一特別優選的實施方案中，純化還包括DEAE-Sepharose層析和Phenyl-Sepharose層析。在一特別優選的實施方案中，用保藏於ATCC，保藏號為69361的質粒pDBAST-LAT表達雜種多肽。在一優選的實施方案中，用保藏於ATCC，保藏號為69363的質粒pλDBAST-LAT表達雜種多肽。在一優選的實施方案中，用保藏於ATCC，保藏號為69362的質粒pBAST-LAT表達雜種多肽。在一優選的實施方案中，通過處理含編碼雜種多肽之DNA的細菌細胞以便DNA指導其表達然後從所述細胞中回收雜種多肽，從而得到雜種多肽。設想處理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的條件下發酵。進一步設想從細胞中回收雜種多肽，包括破壞細菌細胞的細胞壁或其片段以產生溶胞產物，通過離心從溶胞產物中分離細胞內沉澱，溶解沉澱，可選的用層折或超濾純化雜種多肽。本發明還提供含胰島素原和連於所述胰島素原N-末端之前導肽的多肽，其中所述多肽被摺疊並含有正確的二硫鍵。在優選的實施方案中，前導肽衍生於CuZnSOD的N-末端。在特別優選的實施方案中，前導肽含62個胺基酸，其前為Met，其後為Arg殘基。在優選的實施方案中，胰島素原含通過單個Arg殘基，與胰島素A鏈相連的胰島素B-鏈。在另一實施方案中，胰島素原含通過二肽Lys-Arg與胰島素A鏈相連的胰島素B鏈。將所述兩種胰島素原分子作為雜種蛋白質生產，否則表達水平極低而且沒有商業顯著性。在所有優選的實施方案中，用Ser殘基取代前導肽的Cys殘基。實施例下列實施例是為了有助於理解本發明，但不打算也不應當以任何方式限制其範圍。實施例不包括構建載體，將編碼所述多肽之基因插入所述載體或將所得質粒導入宿主中所用常規方法的詳細描述。所述實施例也不包括檢測用所述宿主載體系統生產之多肽所用的常規方法詳細描述。所述方法是本領域專業人員熟知的，而且在包括下列實例的大量文獻中作了描述Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress.實施例1構建表達SOD-胰島素原雜種多肽的生產質粒pBAST-R，pBAST-LAT和pλBAST-LAT構建在deoP1P2或λPL啟動子控制下的細菌表達載體，它們在大腸桿菌中過是生產雜種蛋白質。將胰島素原生產成雜種蛋白質，因為發現含編碼胰島素B-鏈-Lys-Arg-胰島素A-鏈之表達載體的細菌生產不出可檢測的多肽。雜種蛋白質含有一個衍生於CuZnSOD(11)的N-末端的62個胺基酸長的前導肽，在該前導肽N-末端前為Met殘基，C-末端後為Arg殘基，該Arg殘基使其與胰島素B鏈相連。胰島素B鏈通過由Lys-Arg或Arg組成的短C鏈肽與胰島素A鏈相連。原存於SOD的兩個Cys由Ser殘基取代。A質粒pBAST-R構建一系列的質粒得到pBAST-R，在轉化了適當的大腸桿菌宿主細胞後，能夠指導有效表達用於人胰島素生產的胰島素原雜種多肽。在圖3中列出了質粒pBAST-R的結構，該質粒編碼SOD-胰島素B-鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽；圖6中列出了所述雜種多肽的DNA序列和相應的胺基酸序列。質粒pBAST-R約4380bp長，含有下列元件(以逆時針方向)11521bp長的DNA片段，跨pBR322上的AatII-MscI位點，包括四環素抗性基因。21497bp長的DNA片段，跨pBR322上的scaI-HaeII位點，包括截斷的氨苄青黴素抗性基因和DNA複製源。3930bp長的DNA片段，跨大腸桿菌上的AvaII-PpuMI位點，包括deoP1P2啟動子和核糖體結合位點(RBS)(13)。4188bp長的DNA片段，跨人CuAnSODcDNA的NdrI-PpuMI位點。通過寡核苷酸定點誘變(12)用Ser參見取代成熟SOD6位和57位的Cys。5172bp長的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。該區編碼Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈。6合成的36bp的多克隆位點多接頭，有BamHI和HindIII末端。7合成的44bp寡核苷酸，含TrpA轉錄終止子，有HindIII和AatII末端(10)。將賦予四環素抗性並編碼SOD-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質粒pBAST-R導入到大腸桿菌菌株Sφ733(cytRstrA)中，然後於1993年7月26日保藏在ATCC，保藏號為ATCC69362。B質粒pDBAST-LAT構建另一系列的質粒，得到質粒pDBAST-LAT，在轉化適當的大腸桿菌宿主細胞後，能夠指導有效高水平表達用於人胰島素生產的胰島素原雜種多肽。圖4中列出了編碼SOD-胰島素B鏈-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質粒pDBAST-LAT的結構；圖7中列出了所述雜種多肽的DNA序列和相應的胺基酸序列。質粒pDBAST-LAT約4377bp長，含下列元件(以逆時針方向)1.1521bp長的DNA片段，跨pBR322上的AatII-MscI位點，包括四環素抗性基因。2.1497bp長的DNA片段，跨pBR322上的ScaI-HaeII位點，包括截斷的氨苄青黴素抗性基因和DNA複製源。3.930bp長的DNA片段，跨大腸桿菌上的AvaII-PpuMI位點，包括deoP1P2啟動子和核糖體結合位點(RBS)(13)。4.188bp長的DNA片段，跨人CuAnSODeDNA的NdrI-PpuMI位點。通過寡核苷酸定點誘變(12)用Ser參見取代成熟SOD6位和57位的Cys，該片段的GC含量降到38％。5.169bp長的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。該區編碼Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈。6.合成的36bp的多克隆位點多接頭，有BamHI和HindIII末端。7.合成的44bp寡核苷酸，含TrpA轉錄終止子，有HindIII和AatII末端(10)。將賦予四環素抗性並編碼SOD-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質粒pDBAST-LAT導入到大腸桿菌菌株Sφ733(cytRstrA)中，然後於1993年7月26日保藏在ATCC，保藏號為ATCC69361。C質粒pλBAST-LAT構建另一系列的質粒，得到質粒pλBAST-LAT，在轉化適當的大腸桿菌宿主細胞(含cI1857阻遏物)後，能夠指導有效高水平表達用於人胰島素生產的胰島素原雜種多肽。圖5中列出了編碼SOD-胰島素B鏈-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質粒pλBAST-LAT的結構。圖7中列出了所述雜種多肽的DNA序列和相應的胺基酸序列。質粒pλBAST-LAT約3777bp長，含下列元件(以逆時針方向)1.1521bp長的DNA片段，跨pBR322上的AatII-MscI位點，包括四環素抗性基因。2.1497bp長的DNA片段，跨pBR322上的ScaI-HaeII位點，包括截斷的氨苄青黴素抗性基因和DNA複製源。3.330bp長的DNA片段，跨質粒pSOFα13(14)上的BamHI-EcoRI位點，包括λPL啟動子和和一AvrII-NdeI30個鹼基對長的deo核糖體結合位點。4.188bp長的DNA片段，跨人CuAnSODcDNA的NdrI-PpuMI位點。通過寡核苷酸定點誘變(12)用Ser參見取代成熟SOD6位和57位的Cys，該片段的GC含量降到38％。5.169bp長的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。該區編碼Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈。6.合成的36bp的多克隆位點多接頭，有BamHI和HindIII末端。7.合成的44bp寡核苷酸，含TrpA轉錄終止子，有HindIII和AatII末端(10)。將賦予四環素抗性並編碼SOD-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質粒pλBAST-LAT導入到大腸桿菌菌株4300(F-，bio，cI857)中，然後於1993年7月26日保藏在ATCC，保藏號為ATCC69363。30℃繁殖細菌細胞。在溫度升高到42℃後，誘導雜種多肽的生產。實施例2SOD-胰島素原雜種多肽的發酵，生長條件和純化I原種培養物使含質粒pDBAST-LAT(或pBAST-R)的大腸桿菌菌株Sφ733的原培養物在用時速(10mg/ml)補充的酪蛋白培養基(20gr/L酪蛋白水解產物，10gr/酵母提取物和5gr/LNaCl)中生長。然後用冷凍培養基將培養物稀釋兩倍，然後於-80℃貯存。冷凍培養基K2HPO46.3grKH2PO41.8gr檸檬酸鈉0.45grMgSO4·7H2O0.09gr(NH4)2SO40.9gr甘油44gr每500mlII接種物使接種物在生產培養基(見下文)中生長。從原培養物中接種在振蕩燒瓶中的滅菌培養基，然後37℃，200rpm保溫15小時。如果需要，在攪拌的通氣發酵罐中完成接種物繁殖的隨後階段。用2-10％燒瓶培養物接種滅菌培養基，然後37℃，pH7±0.5，同時攪拌並通氣的條件下培養15小時以保持溶解氧的水平在20％的空氣飽和度以上。III生產生產培養基K2HPO48gr/LKH2PO42gr/L檸檬酸鈉2gr/LNH4Cl3gr/LK2SO40.6gr/LFeSO4·7H2O0.04gr/LMgSO4·7H2O0.4gr/LCaCl2·2H2O0.02gr/L痕量元素溶液3ml/L四環素0.01gr/L葡萄糖2gr/L甘油1ml/L痕量元素溶液MnSO4·H2O1gr/LZnSO4·7H2O2.78gr/LCoCl2·7H2O2gr/LNa2MoO4·2H2O2gr/LCaCl2·2H2O3gr/LCuSO4·5H2O1.85gr/LH3BO30.5gr/LHCl(32％)100ml/L用0.5-10％接種培養物接種生產培養基，然後在37℃培養。設定攪拌-通氣率以使溶解氧的水平保持了約20％的空氣飽和度上。用NH3將pH保持在7±0.2。輸入50％葡萄糖和30％甘油的滅菌溶液以補充能量和碳源。在細胞濃度達到OD660為25時，輸入10％葡萄糖和30％甘油的滅菌溶液，然後繼續生長約5小時，直到細胞濃度達到約OD660為60。然後猝冷培養物，並通過離心回收細胞。存在葡萄糖，甘油，半乳糖中的任何一種或其組合作為碳源的條件下，反擊大腸桿菌，有利於表達SOD-胰島素原雜種多肽。IV純化由質粒pBAST-R和pDBAST-LAT表達的SOD-胰島素原雜種多肽在細胞內沉澱物中積累，用下列方法分離所述沉澱物將1gr(淨重)的細菌餅懸浮在10ml含50mMTris-HCl，pH8，10mMEDTA的緩衝液中，37℃用溶菌酶(Merck，2500u/ml)處理2小時。然後聲處理該混合物，加入Nonidet-P-40(Sigma)或TritonX100達到2％的終濃度，然後在室溫攪拌2小時。通過離心沉澱沉澱物，然後用水洗滌。按如下用陰離子交換層析純化雜種多肽至接近均一。將沉澱物溶解在8M脲，20mMTris-HCl，200mMβ-巰基乙醇，pH8.2中。離心澄清溶液，然後在用8M脲Tris-HCl，200mMβ-巰基乙醇，pH8.2中預平衡的20DEAE-SepharoseFast-Flow柱(PharmaciaLKB)上層析。收集流出物，用40％飽和度的(NH4)SO4沉澱所述雜種蛋白質，或通過在10K膜上超濾，然後用100mMGlycine-HCl，pH3.1透濾來濃縮。另外，通過溶解在8M脲，20mM二硫蘇糖醇，50mM醋酸鈉，pH5中，然後通過100kD和50kD膜(Filtron)系列膜而將質粒pBAST-R表達的SOD-胰島素原雜種多肽純化至均一。在10kD膜上濃縮雜種多肽，然後用40％飽和度的(NH4)SO4沉澱。實施例3SOD-胰島素原雜種多肽的摺疊和酶促裂解將通過(NH4)SO4沉澱或通過超濾(實施例2)得到的胰島素原雜種多肽溶解在8M脲，5mMHcl中，然後稀釋到100mM甘油緩衝液，pH8.5-12.0中，終濃度為約1mg/ml。A在約4-37℃，約1-24小時的時間內摺疊質粒pBAST-R表達的SOD-胰島素原雜種多肽以便形成正確的二硫鍵。將含摺疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽之溶液的pH用HCl調到約8.8-9.0，在16-37℃用胰蛋白酶和羧肽酶B將所述蛋白質處理30-120分鐘。在許多試驗後，發現最佳條件如下將質粒pBAST-R表達的雜種多肽溶解在8M脲，5mMHCl中，然後稀釋到100mM甘油緩衝液，pH11.0(圖8)，終濃度為約1mg/ml，此後，在25℃將雜種多肽摺疊6-16小時，其後，在37℃，用胰蛋白酶(1∶500w/w)和羧肽酶B(1∶200w/w)將摺疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽裂解30-60分鐘。圖1中圖示說明了酶促裂解質粒pBAST-R表達的，摺疊的二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽，從而產生胰島素。B在約7-31℃，約5-30小時的時間內摺疊質粒pBAST-LAT表達的SOD-胰島素原雜種多肽以便形成正確的二硫鍵。將含摺疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽之溶液的pH用HCl調到約8.8-9.0，在22-37℃用胰蛋白酶和羧肽酶B將所述蛋白質處理16小時。在許多試驗後，發現最佳條件如下將質粒pBAST-LAT表達的雜種多肽溶解在8M脲，5mMHCl中，然後稀釋到100mM甘油緩衝液，pH11.0-11.25(圖8)，終濃度為約1mg/ml，此後，在25將雜種多肽摺疊6-16小時，其後，在25℃，用胰蛋白酶(1∶15.00w/w)和羧肽酶B(1∶10.00w/w)將摺疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽裂解16小時。圖2中圖示說明了酶促裂解質粒pBAST-LAT表達的，摺疊的二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽，從而產生胰島素。在圖8-14的圖注中詳細說明了上述A和B的特定條件。實施例4對從質粒pBAST-R表達的SOD-胰島素原雜種多肽得到的人胰島素進行蛋白質分析和純化用市售的人胰島素為標準(Calbiochem)，用放射性免疫檢測和RP-HPLC確定從質粒pBAST-R表達的SOD-胰島素原雜種多肽得到的人胰島素。根據胰島素原的胺基酸序列計算的重組人胰島素的理論產率為45.6％。從圖8看出，最佳摺疊在pH11。在該pH，胰島素的生產達理論產率的約80％(相當於輸入雜種多肽的約40％)。用RP-HPLC檢測從質粒pBAST-R表達的胰島素原雜種多肽生產的胰島素。室溫使用Vydac218TP54,250×4.6mmI.D(Separationgroup)，5um，300A孔大小柱，流速為1ml/分鐘。用0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液作為洗脫劑A。用在乙腈中的0.08％TFA作為洗脫劑B。用平衡緩衝液(25％洗脫劑B)將柱洗滌5分鐘，然後在37.5分鐘內用洗脫劑B25-50％的線性梯度。檢測在220nm或280nm的吸收值。用反相高壓液體層析分析酶促消化摺疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽後的人胰島素表明主峰與標準人胰島素有相同的滯留時間。製備兩小批次，分別得到26mgh和13mg人胰島素。在3K或5K膜(Filtron)上通過超濾，然後用CM-Sepharose層析(檸檬酸鹽緩衝液，pH3)從酶處理的溶液(pH9)中純化人胰島素。將峰餾分脫鹽，凍幹，然後進行N-末端測序和胺基酸分析。這兩批次的重組人胰島素的胺基酸組成與天然人胰島素的基本相同(參見表1，製劑1)。用Edamn降解法確定胰島素製劑氨基末端5個胺基酸的序列。發現與人胰島素A和B鏈的NH2-末端的相同，這確定了體外產物的可靠性。然而，測序結果表明約25％的分子在第一個位置有一額外的Arg。該結果與在Lys和Arg(在接頭序列Lys-Arg內)之間的胰蛋白酶裂解相符，裂解後在A鏈的氨基末端剩下Arg殘基。發現在pH11完成反應可以用在胰蛋白酶在Arg的C-末端進行特異性水解。在該升高的pH，大部分Lys的ε-氨基不帶電(pK＝10.3)，因此能夠進行選擇性裂解。通過在pH11完成胰蛋白酶步驟(參見表1，製劑2)，然後在pH8.5用羧肽酶B消化，這兩批次分別得到1mg和6.5mg純化的胰島素。N-末端測序表明含額外Arg的胰島素的量降低到約5％。表1重組人胰島素的胺基酸組成製劑1和2表示從質粒pBAST-R表達的胰島素原雜種多肽生產的重組人胰島素的胺基酸組成。在pH9(製劑1)或pH11(製劑2)完成胰蛋白酶裂解。過甲酸氧化和氣相水解純化的胰島素製劑後，進行胺基酸分析。實施例5肽分析從質粒pBAST-R表達之SOD-胰島素原雜種多肽生產的純化人胰島素用內蛋白酶Glu-C(Sigma)(該酶水解在穀氨醯基羧基側的肽鍵)使按上述實施例生產的純化人胰島素經肽分析。更詳細地說，在37℃，100ul0.1MTris-Hcl，pH7.8中，用5ugGlu-C將胰島素樣品消化6小時，所述樣品是通過裂解質粒pBAST-R表達的摺疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽而生產的。完成HPLC分析將市售(對照)胰島素和通過裂解質粒pBAST-R表達的摺疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽而生產的胰島素樣品酸化到約pH3，然後用RP-HPLC分離。使用Vydac218TP54,250×4.6mmI.D(Separationgroup)，5um，300A孔大小柱。用含31.5％(v/v)乙腈的50mM磷酸四乙胺，162mMNaClO4，pH3平衡該柱，然後在75分鐘內，以1ml/分鐘的流速，用35-45％乙腈的線性梯度顯色。在220nm測量吸收值。按照對照反應產生了所有預期的肽，甚至在峰後相當於片段之一的小肩可能相當於des-Thr(B30)胰島素樣分子(15)。實施例4和5表明質粒pBAST-R表達的重組多肽含有天然人胰島素序列。生產的小部分重組蛋白質包括Arg(Ao)，desamido-或des-Thr(B30)胰島素樣分子形式。用層析方法，如上述的RP-HPLC可以除去這些不想要的副產物。實施例6對從質粒pBAST-R表達的SOD-胰島素原雜種多肽得到的人胰島素進行蛋白質分析和純化為了避免產生Arg(Ao)胰島素副產物(實施例4和5)，修飾表達質粒pBAST-R以得到只含有編碼胰島素原雜種多肽AB鏈之間的Arg殘基的DNA，這與編碼Lys-Arg的DNA，Lys-Arg位於質粒pBAST-R表達的胰島素原雜種多肽AB鏈之間。得到表達質粒pDBAST-LAT(實施例1B)和pλBAST-LAT(實施例1C)。摺疊並用胰蛋白酶和CPB酶促處理由新表達質粒pDBAST-LAT表達的摺疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽後，有效生產胰島素。存在的胰島素樣汙染物少(圖9)。最佳摺疊在pH11.25(圖10)，在反應混合物中，每摩爾SH基團存在約2摩爾抗壞血酸的條件下，摺疊顯著增加(圖11)。在其它最佳摺疊條件下，用系列反應確定蛋白質濃度對從胰島素原雜種多肽生產的胰島素的影響。蛋白質濃度不超過1.5mg/ml時，產率最佳(圖13)。用DEAE-Sepharose層析，然後用RP-HPLC(如圖9所述)純化胰島素。正如從圖12中所看到的，生產的重組人胰島素與標準(市售)人胰島素有相同的滯留時間。純化的重組人胰島素製劑的胺基酸組成與標準胰島素的相同(參見表2)。表2表明從質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產的胰島素沒有如實施例4所述的，粘附於胰島素A鏈的額外Arg(Arg(Ao)胰島素)。因此生產胰島素的優選質粒是質粒pDBAST-LAT，圖7中列出了胰島素原雜種多肽的優選序列。表2重組人胰島素的胺基酸組成表明了標準人胰島素和從質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產的重組人胰島素的胺基酸組成。在過甲酸氧化和氣相水解純化的胰島素製劑後，完成胺基酸分析。實施例7從粗細胞內沉澱物生產來自質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽的人胰島素使用粗細胞內沉澱物，刪去實施例2中的起始純化步驟，部分IV，可以完成摺疊並將胰島素原雜種多肽轉變成胰島素的改進後的方法。胰島素的有效生產是在用胰蛋白酶和羧肽酶B(圖14和表3)酶促裂解摺疊的，二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽後。將胰島素產率計算為在pH12，沉澱物溶解步驟確定的起始蛋白質濃度(A280)(圖14)。表明從粗細胞內沉澱物摺疊SOD-胰島素原雜種多肽是在從開始試驗的約4.5小時(圖14)。表3總結了從質粒pBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽部分純化胰島素的情況，所述多肽來自從O.D.660＝45的一升發酵培養物質粒的粗細胞內沉澱物。按圖14所述完成溶解和摺疊。在開始後的4.5小時，用濃縮的鹽酸將含摺疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽的摺疊的堆積溶解滴定到pH8.8。加入znCl2(到50uM的終濃度)，羧肽酶B(1∶4000w/w)和胰蛋白酶(1∶6000w/w)。37℃消化3小時，然後通過加入苯基甲基磺基氟化物(PMSF)到0.5mM的終濃度而終止消化。用HPLC分析(如圖9所述)表明，胰島素的產率為169mg。通過連續的陰離子交換和疏水層析步驟純化胰島素。以約每ml樹脂50A280單位將消化的摺疊混合物負載到用20mMTris-HCl，10mMNaClpH8緩衝液預平衡的DEAESepharoseFastFlow(Pharmacia)柱上。用20mMTris-HCl，100mMNaClpH8緩衝液洗滌結合的物質，然後用在相同的緩衝液中的250mMNaCl洗脫。含胰島素的池餾分代表20％的負載蛋白質，純度為37.1％。將硫酸銨加到DEAE洗脫池中達到410mM的濃度，然後以約每ml樹脂12A280單位負載到用20mMTrisHCl，540mM硫酸銨預平衡的苯基-SepharoseFastFlow柱上。用平衡緩衝液洗滌結合的物質，用20mMTrisHCl，220mM硫酸銨，pH8緩衝液洗脫胰島素。含胰島素的餾分表示負載蛋白質的42.3％，純度為74.1％。該部分純化步驟的結果是生產的120mg(等於標準胰島素)，胰島素的產率為5.16％。用本領域已知的方法，如凝膠過濾，RP-HPLC和結晶(17)可以進行進一步純化。表3溶解粗細胞內沉澱物，摺疊並用胰蛋白酶和羧肽酶B酶促處理後，純化從質粒pDBAST-LAT表達的胰島素原雜種多肽生產的重組人胰島素A280表示各純化步驟，在280nm的總吸收值。按照圖9所述，參照標準胰島素，用HPLC確定胰島素的存在，並對應於標準胰島素的主胰島素峰。參考文獻Cousens，L.S.，Shuster，J.R.，Gallegos，C.，Ku，L.，Stempien，M.M.，Urdea，M.S.，Sanchez-Pescador，R.，Taylor，A.andTeKamp0Olson，P.，基因61265-275，1987。Davidson，H.W.，Rhodes，C.J.andHutton，J.C.，自然33393-96，1988。Ellman，G.L.，Arch.Biochem.Biophys.8270-77，1959。Fischer，M.，Fytlovitch，S.，Amit，B.，Wortzel，A.andBeck，Y.，應用微生物生物技術(Appl.Microbio.Biotechnol.)33424-428，1990。Frank，B.H.andChance，R.E.(1985)，Frank，B.H.andChance，R.E.(1985)，製備並表徵人胰島素的重組DNA源，用於通過遺傳工程生產的治療藥物(ThepreparationandcharacterizationofhumaninsulinofrecombinantDNAorigin，inTherapeuticagentsproducedbygeneticengineering，)，QuoVadissymposium，sanofigroup，1985年5月29-30，Toulouse-Labege，法國，pp137-146。Goeddel，D.V.，Kleid，D.G.，Bolivar，F.，Heyneker，H.L.，Yansura，D.G.，Crea，R.，Hirose，T.，Kraszewski，a.，Itakura，K.andRiggs，A.D.，Proc.Natl.，Acad.Sci.76106-110.1979.Grau，U.，糖尿病(Diabetes)341174-1180，1985.Hartman等人，美國專利5143836，1992年9月1日。Kemmler，W.，Peterson，J.D.andSteiner，D.f.，生物化學期刊(J.Biol.Chem)2466786-6791，1971.Morinaga，Y.，Franceschini，T.，Inouye，S.andInouye，M.，生物技術2636-639，1984。Panayotis，G.，Katsoyannis，G.andTometsko，A.，Proc.Natl.，Acad.Sci.U.S.A.551554-1561.1966.Schlichtkrull，J.，ActaChem.Scand.101459-1464，1956.Sherman，L.，Dafni，L.，Liehman-Hurwitz，J.andGroner，Y.，Proc.Natl.，Acad.Sci.805465-5469，1983.Steiner，D.F.andClark，J.L.，Proc.Natl.，Acad.Sci.60622-629，1968.Thim，L.，Hansen，M.T.，Norris，K.，Hoegh，I.，Boel，E.，Forstrom，J.，ammerer，G.andFiil，N.P.，Proc.Natl.，Acad.Sci.美國，836766-6770，1986.Wetzel，R.，Kleid，D.G.，Crea，R.，Heyneker，H.L.，Yansura，D.G.，Hirose，T.，Kraszewski，A.，Riggs，A.D.，Itakura，K.andGoeddel，D.V.，基因1663-71，1981.Yanofsky，C.，Platt，T.，Crawford，I.P.，Nichols，B.P.，Christie，G.E.，Horowitz，H.，VanCleemput，M.andWu，A.M.，核酸研究.96647-6668，1981.權利要求1.生產胰島素的方法包括(a)在允許形成正確二硫鍵的條件下，摺疊含胰島素原的雜種多肽；(b)使摺疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽經酶促裂解以產生胰島素；(c)純化胰島素。2.根據權利要求1的方法，其中步驟(a)還包括在約pH8.5-12.0，約4-37℃將雜種多肽保溫約1-30小時。3.根據權利要求2的方法，其中在存在抗壞血酸的條件下進行保溫。4.根據權利要求2的方法，其中pH為11.0-11.25。5.根據權利要求3的方法，其中pH為11.0-11.25。6.根據權利要求3的方法，其中在摺疊混合物中，抗壞血酸的濃度為每摩爾SH基約2摩爾抗壞血酸。7.根據權利要求2的方法，其中所述保溫時間為約5小時。8.根據權利要求3的方法，其中所述保溫時間為約5小時。9.根據權利要求1的方法，其中步驟(b)還包括(I)將pH調到約8.8-9.0；和(ii)在16-37℃用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解雜種多肽30分鐘-16小時。10.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)還包括用DEAE-Sepharose層析和RP-HPLC純化。11.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)還包括用超濾和CM-Sepharose層析純化。12.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)還包括用DEAE-Sepharose層析和苯基-Sepharose層析。13.根據權利要求1的方法，其中用ATCC保藏號為69361的質粒pDBAST-LAT表達胰島素原雜種多肽。14.根據權利要求1的方法，其中用ATCC保藏號為69363的質粒pλBAST-LAT表達胰島素原雜種多肽。15.根據權利要求1的方法，其中用ATCC保藏號為69362的質粒pBAST-LAT表達胰島素原雜種多肽。16.根據權利要求1的方法，其中通過處理含編碼雜種多肽之DNA的細菌細胞，以便DNA指導所述多肽的表達，從而得到步驟(a)的雜種多肽。17.根據權利要求16的方法，其中從所述細胞中回收雜種多肽。18.根據權利要求16的方法，其中所述處理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的條件下發酵。19.根據權利要求17的方法，其中所述回收包括(I)破壞所述細菌細胞的細胞壁或其片段以產生溶胞產物；(ii)通過離心從溶胞產物中分離細胞內沉澱物；和(iii)增溶所述沉澱物。20.含有胰島素原和與所述胰島素原的N-末端相連的前導肽的多肽，其中所述多肽被摺疊並含有正確的二硫鍵。21.根據權利要求20的多肽，其中所述前導肽衍生於CuZnSOD的N-末端。22.根據權利要求21的多肽，其中所述前導肽含有62個胺基酸，其前為胺基酸Met，其後為Arg殘基。23.根據權利要求20的多肽，其中所述胰島素原含有通過單Arg殘基與胰島素A鏈共價相連的胰島素B鏈。24.根據權利要求20的多肽，其中所述胰島素原含有通過二肽Lys-Arg殘基與胰島素A鏈共價相連的胰島素B鏈。25.根據權利要求20的多肽，其中前導肽的Cys殘基已經被Ser殘基所取代。全文摘要提供了改進且有效的通過摺疊胰島素原雜交多肽來生產重組人胰島素的方法。文檔編號C12N15/16GK1177928SQ94195231公開日1998年4月1日申請日期1994年12月29日優先權日1994年12月29日發明者J·R·哈特曼,S·門德羅維茨,M·戈雷基申請人:生物技術通用公司