一種發酵生產漆酶的方法
2023-06-04 16:31:46 1
專利名稱：一種發酵生產漆酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物製造領域，更具體涉及一種利用一色齒毛菌發酵生產漆酶的方法。
背景技術：
木質素、纖維素和半纖維素為自然界中最豐富的三大可再生資源，分別佔植物乾重的209Γ35%，45%和20%。木質素是一種天然高分子化合物，廣泛存在於高等植物細胞壁中，是儲量僅次於纖維素的生物多聚體，而且每年以50億噸以上的速度再生。自然界中木質素的完全降解主要是通過白腐真菌的分解作用來完成的。其機理是通過白腐菌分泌的胞外氧化酶——木質素降解酶來實現的，其中漆酶(Lacca·^)、錳過氧化物酶(MnP)和木素過氧化物酶、LiP~)是白腐菌木質素降解酶系的主要組成部分，其中漆酶在木質素降解過程中扮演著重要角色，對木質素的氧化、脫甲基和解聚等發揮著重要作用。漆酶不僅存在於高等植物中，而且一些多孔菌和腐生菌以及昆蟲和細菌等也能產漆酶，且大多數由真菌分泌。在大多數真菌中，白腐菌是目前公認的最強、最主要的木質素降解者，能使木質素最終礦化為(X)2和H2O。漆酶能催化氧化多種有機物，包括苯酚、甲氧基酚、氨基酚等難以降解的芳香族化合物，同時分子氧被還原成水。最近研究表明，漆酶在造紙工業中有著重要作用，可以降解木漿中的木質素，並能夠脫除造紙工業汙水中的大量汙染物。由於漆酶在催化木質素、木質素前體物質分子及其結構相似物等許多環境汙染物的降解中具有特殊的作用，近年來，有關漆酶的研究受到國內外的廣泛關注，顯示出了較大的研究價值和應用潛力。儘管漆酶具有如此重要的用途，但其在生產實踐中的應用仍十分有限，主要原因是多數生產菌株合成漆酶的效率低，造成漆酶產量不足。因此，高產漆酶菌株的獲得對生態農業、環境和生物質資源轉化等方面有著非常重要的經濟和生態效益，在提高農副產品利用效率方面具有廣闊的應用前景，特別是在農作物廢棄物的利用、環境保護、我國生態農業的可持續發展上具有重要意義。
發明內容
本發明提供了一種發酵生產漆酶的方法，該方法可提高漆酶的產量和質量。本發明的一種發酵生產漆酶的方法，包括真菌分泌漆酶培養基的配製和產酶發酵，所述真菌分泌漆酶培養基為每IOOmL的液體培養基中含有葡萄糖l_4g，酒石酸銨 1-2. 5g，ABTS 0. 05-0. 25mmol/L, VB1 0. 6mg/L,大量元素，微量元素，餘量為水，用 NaOH 或 HCl 調節初始 pH=5. 0-6. 0。所述真菌分泌漆酶培養基為每IOOmL的液體培養基中含有葡萄糖2g，酒石酸銨 1. 5g，ABTS 0. 05mmol/L, VB1O. 6mg/L，大量元素，微量元素，餘量為水，調節初始pH=5. 0 ；其中大量元素包括KH2PO4 20. Og/L, MgSO4^H2O 13. 8g/L, CaCl2 1.0g/L 和 NaCl 0. 6g/L ；微量元素包括MnSO4- H2O 0. 35g/L, FeSO4- 7H20 60mg/L，CoCl2。6H20 llOmg/L, ZnSO4" 7H20 60mg/L, CuSO4- 5H20 95 mg/L, AlK (SO4) 2。12H20 6mg/L, H3BO3 6mg/L 禾口 NaMo04。2H20 6mg/L。所述真菌為一色齒毛菌、Cerrena unicolor)。發酵工藝條件為接種量8-12%，發酵溫度20-30°C，轉速150-250r/min，裝液量 50-70mL/250mLo發酵工藝條件為接種量8%，發酵溫度25°C，轉速200r/min，裝液量60mL/250mL。接種的種子液的製備方法為將在PDA平板上活化好的菌種用打孔器製成 10-12mm菌塊，將得到的菌塊接入PDA液體培養基中，所述PDA液體培養基的配製為馬鈴薯 200g,葡萄糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水IOOOmL(先將馬鈴薯洗淨去皮，切成小塊，稱取200g， 加水IOOOmL煮沸約20min，紗布過濾去渣，再加入葡萄糖20g和瓊脂15_20g，加熱使之全部溶解，補充蒸餾水至lOOOmL，121°C滅菌30min) ；PDA液體培養基裝液量為100mL/250mL三角瓶，每瓶接種3個菌塊，然後在轉速200r/min，溫度30°C搖床中恆溫振蕩培養4d，製成種子液。本發明的發酵生產漆酶的方法，最高漆酶活力可達58888. 59U/L，約為優化前的 10. 8倍；經過5L發酵罐試驗，最高漆酶活力可達79733U/L，約為實驗室搖瓶條件下的1. 35倍。本發明的顯著優點
隨著研究的不斷深入，漆酶的應用已經滲透到工業、農業和醫療等領域，然而在漆酶的大規模工業化生產方面，以及探索適宜的發酵條件等方面報導較少，仍然是今後研究的熱點。本發明建立了發酵生產漆酶的工藝條件，為實現漆酶的工業化生產打下基礎。
具體實施例方式1漆酶活力的測定方法
漆酶活力測定方法採用ABTS法。4. OmL反應體系中含1. 95mL 0. lmol/L NaAc-HAc緩衝液(pH3. 0)、2. OOmL 0. 5mmol/L 2，2，-連氮-二(3-乙基苯並噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液和50 μ L稀釋好的酶液，30°C啟動反應並測定反應前5min內反應液在420nm處吸光度的增加值Δ OD42tl，以滅活的酶液作為空白。定義該條件下，每min催化lymol ABTS氧化所需酶量為1個酶活力單位(U)，並按下式計算漆酶活力 酶活力 U(/L) =NX Δ OD420 X IO6/(36000 Xt)
其中，N為稀釋倍數；Δ OD420為5min內反應液在420nm處吸光度的增加值；36000為 ABTS氧化態的摩爾吸光係數(Lmor1CnT1)，t為反應時間5min。2產酶培養基的優化
2. 1碳源及其添加量對產酶的影響
分別以麩皮、玉米澱粉、葡萄糖、酒糟、桔皮、可溶性澱粉、稻草、蔗渣為碳源，添加量均為l%(w/v)，考察它們對產漆酶的影響，結果見表1。以葡萄糖為碳源時，產酶效果最好，酶活力最高，且漆酶產率也最高。在發酵第6d，酶活力達到最高56355. 56U/L，產酶效率達到 9392. 59 U/L · cf1。表1碳源對一色齒毛菌產漆酶的影響
權利要求
1.一種發酵生產漆酶的方法，包括真菌分泌漆酶培養基的配製和產酶發酵，其特徵在於所述真菌分泌漆酶培養基為每IOOmL的液體培養基中含有葡萄糖l-4g，酒石酸銨 1-2. 5g，ABTS 0. 05-0. 25mmol/L, VB1 0. 6mg/L,大量元素，微量元素，餘量為水，用 NaOH 或 HCl 調節初始 pH=5. 0-6. 0。
2.根據權利要求1所述的發酵生產漆酶的方法，其特徵在於所述真菌分泌漆酶培養基為每IOOmL的液體培養基中含有葡萄糖2g，酒石酸銨1. 5g，ABTS 0. 05mmol/L, VB1O. 6mg/L，大量元素，微量元素，餘量為水，調節初始pH=5.0 ；其中大量元素包括=KH2PO4 20. Og/L, MgSO4- 7H20 13. 8g/L, CaCl2 1. Og/L 和 NaCl 0. 6g/L ；微量元素包括MnSO4" H2O 0. 35g/L, FeSO4- 7H20 60mg/L，CoCl2。6H20 llOmg/L, ZnSO4" 7H20 60mg/L，CuS04。5H20 95 mg/ L, AlK(SO4)2- 12H20 6mg/L, H3BO3 6mg/L 和 NaMo04。2H20 6mg/L。
3.根據權利要求1所述的發酵生產漆酶的方法，其特徵在於所述真菌為一色齒毛菌 (Cerrena unicolor)。
4.根據權利要求1所述的發酵生產漆酶的方法，其特徵在於發酵工藝條件為接種量 8-12%，發酵溫度 20-30°C，轉速 150-250r/min，裝液量 50_70mL/250mL。
5.根據權利要求3所述的發酵生產漆酶的方法，其特徵在於發酵工藝條件為接種量 8%，發酵溫度 25 °C，轉速 200r/min，裝液量 60mL/250mL。
6.根據權利要求3所述的發酵生產漆酶的方法，其特徵在於接種的種子液的製備方法為將在PDA平板上活化好的菌種用打孔器製成10-12mm菌塊，將得到的菌塊接入PDA 液體培養基中，所述PDA液體培養基的配製為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水IOOOmL ；PDA液體培養基裝液量為IOOmLASOmL三角瓶，每瓶接種3個菌塊，然後在轉速 200r/min，溫度30°C搖床中恆溫振蕩培養4d，製成種子液。
全文摘要
本發明提供了一種發酵生產漆酶的方法，該方法包括真菌分泌漆酶培養基的配製和產酶發酵，所述真菌分泌漆酶培養基為每100mL的液體培養基中含有葡萄糖1-4g，酒石酸銨1-2.5g，ABTS0.05-0.25mmol/L，VB10.6mg/L，大量元素，微量元素，餘量為水，用NaOH或HCl調節初始pH=5.0-6.0。隨著研究的不斷深入，漆酶的應用已經滲透到工業、農業和醫療等領域，然而在漆酶的大規模工業化生產方面，以及探索適宜的發酵條件等方面報導較少，仍然是今後研究的熱點。本發明建立了發酵生產漆酶的工藝條件，為實現漆酶的工業化生產打下基礎。該方法可提高漆酶的產量和質量。
文檔編號C12R1/645GK102181410SQ20111012192
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者嚴芬, 葉秀雲, 李仁寬, 楊捷, 林娟, 胡佑彪 申請人:福州大學