一種產accd的植物內生細菌及其土壤修復菌劑和應用的製作方法

2023-06-04 17:18:36 1

專利名稱：一種產accd的植物內生細菌及其土壤修復菌劑和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業和環境汙染治理技術領域，涉及一種產AC⑶的植物內生細菌及其土壤修復菌劑和應用。
背景技術：
礦產資源開採和礦山開發引起的環境問題是全球普遍關注的問題，越來越受到人們的重視，主要由於其中鎘、鉛、錳、鋅等重金屬有毒元素向環境的釋放。重金屬汙染土壤的植物修復技術因其成本低廉、環境友好而成為世界各國關注的熱點，成為礦區環境恢復的最佳策略。但其在實施過程中也存在不少問題，如土壤重金屬的生物有效性低，不利於植物對重金屬的吸收和清除；超積累植物通常生長緩慢、生物量小等，這些缺點嚴重影響了植物修復的效率。如何促進超積累植物生長、提高重金屬吸收是植物修復技術中的關鍵。重金屬汙染等多種脅迫環境均能導致植物體內乙烯的大量積累，而內源乙烯的過量產生將導致植物根部生長發育受阻或死亡。高等植物體內乙烯的合成前體物質為 ACCd-氨基環丙烷-1-羧酸)。研究發現，多種植物促生細菌可分泌ACC脫氨酶(ACXD)， 將植物乙烯前體ACC分解成為α - 丁酮酸和氨，這樣可大大減少植物有害乙烯的產生，促進植物的生長發育。研究已證明接種ACCD產生細菌的植物會增大根部的長度及根密度。 Belimov等首次報導了細菌ACXD活性與促進植物組織中Cd的積累量的增多呈正相關。 Rajkumar和Freitas、Jiang等和Rodriguez等的研究都已表明產ACCD的菌株能夠通過促進植物生長，來增強植物-微生物聯合修復土壤重金屬汙染，在植物修復重金屬汙染土壤中具有應用潛力。

發明內容
本發明的目的就是提供一種高產ACXD的植物內生細菌。本發明的另一目的是提供由該高產ACCD的植物內生細菌製備的土壤修復菌劑。本發明的又一目的是提供該細菌的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種高產1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶的植物內生細菌Jp3_3，分類命名為 Pantoea agglomerans Jp3_3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2011年7月 13 日，菌種保藏號為 CCTCC NO :M 2011250。Jp3_3 (CCTCC NO :M 2011250)是從中國江西省某銅尾礦區生長的小飛蓬(Comnyza canadensis)莖中分離得到，經鑑定為Pantoea agglomerans。主要生物學特性為G_，菌體為短杆狀；乙醯甲基甲醇(V. P.)、檸檬酸鹽、精氨酸脫羧酶反應陽性，澱粉水解、過氧化氫酶反應陰性；能在以ACC為唯一氮源的培養基上生長良好，ACXD酶活性最高達402 μ M α-KB h—rng—1。LB培養基上生長良好，單個菌落圓形， 邊緣整齊，直徑1 3mm，白色，不透明。一種含有所述的保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株的生物修複製劑。所述的生物修複製劑優選為液體製劑，其中含有保藏號為CCTCC NO =M 2011250
3的JP3-3菌株有效活菌數為10億個/毫升以上。其中，所述的液體製劑是通過常規的液體深層發酵方法發酵JP3-3菌株製備得到。所述的生物修複製劑還可優選為固體製劑，其中含有保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3-3菌株有效活菌數為2億個/克以上。所述的固體製劑是使用草炭、蛭石或其他載體吸附保藏號為CCTCC NO =M 2011250 的JP3-3菌株發酵液配製成顆粒劑或粉劑。所述的保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株在土壤重金屬汙染的植物修
復中的應用。所述的含Jp3_3菌株的生物修複製劑在土壤重金屬汙染的植物修復中的應用。一種所述的含Jp3_3菌株的生物修複製劑用於土壤重金屬汙染的植物修複方法 在含重金屬的溼潤土壤中播種植物種子，每千克土壤接種IO8個細菌/mL的菌液10 20mL， 分1-2次接種。有益效果本發明所述的植物內生細菌Jp3_3菌株(CCTCC NO =M 2011250)能耐受多種重金屬(Cu、Pb、Cd、Ni的最小抑制濃度分別為3. 1,4. 8,4. 5,0. 9mM)。本發明所述的高產ACCD的植物內生細菌Jp3-3菌株(CCTCC NO =M 2011250)及其強化植物土壤重金屬汙染修復的方法與現有技術相比有如下優點(1)本發明所述的Jp3-3菌株(CCTCC NO =M 2011250)具有ACC脫氨酶( 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid deaminase) 舌 f生，Sl 舌 t生最 1 可達 402 μ Ma-KB · IT1 · mg—1，在重金屬汙染土壤中定殖於植物體內的具ACC脫氨酶活性的內生細菌通過將乙烯的前體ACC轉換為α-丁酮酸和氨，可以直接調控植物體內乙烯的含量，抑制乙烯的生物合成，促進植物生長；高產鐵載體，有助於提高植物抗逆性(抗旱、抗澇、抗鹽鹼、抗病蟲害)；該菌株能產生吲哚乙酸，IAA最高產量可達Hmg ·廠1 ；具有溶磷特性，有助於促進植物生長。(2)利用本發明植物內生細菌Jp3-3菌株(CCTCC NO =M 2011250)促進植物生長， 提高植物提取修復效率。(3)可以回收重金屬，無二次汙染。生物樣品保藏信息高產1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶的植物內生細菌Jp3_3，分類命名為Pantoea agglomerans Jp3_3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址是中國武漢武漢大學，保藏日期為2011年7月13日，菌種保藏號為CCTCC NO =M 2011250。
具體實施例方式實施例1本發明中高產ACXD的植物內生細菌Jp3_3菌株是從中國江西省某銅尾礦區生長的小飛蓬(Comnyza canadensis)莖中分離純化得到，分離方法如下先用自來水將小飛蓬莖表面清洗乾淨，然後用無菌水再清洗一遍，接著用75% 乙醇浸泡消毒5min，無菌水衝洗後再浸入2. 5%次氯酸鈉溶液中消毒5min，無菌水衝洗數遍。將表面消毒的莖置於研缽內研磨至勻漿，取0.1ml勻漿液塗布於LB平板(蛋白腖 10g，酵母膏 5g，NaCl 10g,7jC lOOOmL，瓊脂 20g，pH 7. 0)，培養 3d，挑取單菌落在 LB 平板上劃線純化後保存。將菌株接種於LB培養液中，30°C搖床振蕩培養18h，取1. OmL菌液於Eppendorf離心管中，IOOOOrpm離心5min收集菌體，按常規方法提取細菌總DNA，PCR 擴增細菌16SrDNA，擴增產物經測序後與GenBank中已知16S rDNA序列進行比對分析，與 Pantoeaagglomerans的16S rDNA序列相似性達到99%，將其鑑定為這個種。實施例2將Jp3-3(CCTCC NO =M 2011250)劃線接種於含不同重金屬濃度的LB培養基，30°C 培養3d，觀察其能否生長及生長情況。結果見表1。Jp3-3菌株能耐受多種重金屬(Cu、Pb、 Cd、Ni的最小抑制濃度分別為3. 1、4. 8、4. 5、0. 9mM)。表1菌株在含不同重金屬濃度的LB培養基上的生長情況
權利要求
1.一種高產1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶的植物內生細菌JP3-3，分類命名為 Pantoea agglomerans Jp3_3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2011年7月13 日，菌種保藏號為CCTCC NO =M 2011250。
2.一種含有權利要求1所述的保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株的生物修複製劑。
3.根據權利要求2所述的生物修複製劑，其特徵在於該生物修複製劑為液體製劑，其中含有保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株有效活菌數為10億個/毫升以上。
4.根據權利要求3所述的生物修複製劑，其特徵在於所述的液體製劑是通過常規的液體深層發酵方法發酵JP3-3菌株製備得到。
5.根據權利要求2所述的生物修複製劑，其特徵在於該生物修複製劑為固體製劑，其中含有保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株有效活菌數為2億個/克以上。
6.根據權利要求5所述的生物修複製劑，其特徵在於所述的固體製劑是使用草炭、蛭石或其他載體吸附保藏號為CCTCC NO =M 2011250的Jp3-3菌株發酵液配製成顆粒劑或粉劑。
7.權利要求1所述的保藏號為CCTCCNO =M 2011250的Jp3_3菌株在土壤重金屬汙染的植物修復中的應用。
8.權利要求2所述的含Jp3-3菌株的生物修複製劑在土壤重金屬汙染的植物修復中的應用。
9.一種權利要求2所述的含Jp3-3菌株的生物修複製劑用於土壤重金屬汙染的植物修複方法，其特徵在於在含重金屬的溼潤土壤中播種植物種子，接種JP3-3菌株生物修複製劑，每千克土壤接種IO8個細菌/mL的生物修複製劑10 20mL，分1_2次接種。
全文摘要
本發明屬於農業和環境汙染治理技術領域，涉及一種產ACCD的植物內生細菌及其土壤修復菌劑和應用。植物內生細菌Jp3-3，分類命名為Pantoea agglomerans Jp3-3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2011年7月13日菌種保藏號為CCTCC NOM 2011250。該細菌的ACCD酶活性最高可達402μM α-KB·h-1·mg-1；液體製劑含有有效活菌數為10億個以上/毫升，固體製劑含有效活菌數2億個以上/克。土壤修復菌劑直接施用可促進植物生長並吸收重金屬，強化植物修復重金屬汙染土壤的效率。
文檔編號C12N11/14GK102391974SQ20111037773
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者何琳燕, 張文輝, 張豔峰, 盛下放, 黃智 申請人:南京農業大學