一種提高丁醇發酵總溶劑產量的方法與流程

2023-06-04 11:19:21

本發明屬於生物發酵技術領域，具體涉及一種提高丁醇發酵總溶劑產量的方法。

背景技術：

隨著汽油和化石燃料存儲的消耗，生物丁醇作為一種新的可再生資源越來越受到人們的關注。丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，蒸汽壓低，可與汽油任意比混溶，使用安全性能高；不會腐蝕管道、不易吸水、便於管道運輸，是一種非常理想的能源替代品。此外，丁醇也是一種重要的化工原料，廣泛用於各種塑料和橡膠製品的製造和丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化學品的合成。近年來，隨著下遊產業的發展，丁醇的市場需求直線上升，2011年我國丁醇的進口量在49萬噸左右，成為世界最大的丁醇進口國。

現階段，微生物發酵生產丁醇作為重要的生物轉化技術極具發展和產業化的潛力。微生物發酵生產工藝主要包括批次發酵工藝，連續發酵工藝及批次補料發酵工藝。其中，批次補料發酵工藝是指在微生物批次發酵過程中，以某種方式向發酵系統中補加一定物料，但並不連續地向外放出發酵液的發酵技術，發酵液的體積隨時間逐漸增加，是介於批次發酵和連續發酵之間的一種發酵技術。

目前提到的丁醇發酵批次補料工藝中，發酵培養基的補加均採用恆流速補加方式或者多批次直接補加方式，無法最大限度滿足菌種生長發酵的需要，發酵產物的產量受到一定的限制。

CN200510122181.6公開了一種補料發酵生產D-核糖的方法，在發酵培養期間採用間歇遞減流加方式和間歇定量流加的方式流加葡萄糖補料液和硫酸銨補料液，其中葡萄糖補料是在發酵培養進行到25-45小時時開始採用間歇遞減流加方式，每隔5小時流加濃度為400-1000g/L的葡萄糖補料液，共流加3次，每次分別為50mL、40mL和30mL， 硫酸銨補料是在發酵培養進行到30-40小時，在葡萄糖補料的同時，採用間歇定量流加的方式，開始每隔5小時流加濃度為200-300g/L的硫酸銨補料液，共流加 2次，每次流加12mL補料液，最終得到D-核糖產物。該方法採用補料法發酵生產D-核糖，發酵結束時葡萄糖基本被耗盡，與不補料相比，D-核糖產量提高了95.9%。

CN200810162759.4公開了一種補料發酵法生產輔酶Q10，採用紅色酵母菌HY-05用於發酵生長輔酶Q10，從發酵第24h開始，在減速流加蔗糖的同時以7.5mL/(L·h)的速度流加玉米漿，CoQ10的積累可達到最大為156.2mg/L，與不補料相比產量提高了58.1%。採用補料分批發酵方式不僅可減少底物的反饋抑制，而且可增大發酵過程中的溶氧，進一步提高CoQ10的合成量。

Xue等（Xue C, Zhao J B, Lu C C, et al. BioetchBioeng, 2012, 109, 2746-2756.）。將批次補料的工藝方法應用在在丁醇發酵中，從而得到了相對於分批發酵更高的丁醇產量和產率。

上述批次補料工藝都是根據不同發酵菌株、發酵底物和發酵產物的特性研究出的相關補料工藝過程，在用於丁醇發酵時，總溶劑產量提高並不顯著。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種提高丁醇發酵總溶劑產量的方法。本發明在丁醇發酵菌的生長對數期，通過勻減速補加高pH值培養基的方式，促進菌種的二次生長，延長了產酸期的時間，在碳源用量相同的條件下，提高了發酵周期內溶劑的產率，增加了發酵的總溶劑產量。

為了達到上述的目的，本發明採用以下技術方案。

一種提高丁醇發酵總溶劑產量的方法，包括以下步驟：

（1）將丁醇發酵菌的孢子液接種到RCM培養基中，得到發酵菌種子液；

（2）製備P2發酵培養基，其中初始發酵培養基中的總糖濃度為30-60g/L，pH自然；補料發酵培養基中的總糖濃度為70-100g/L，pH為7.0-9.0；

（3）在發酵罐中，預先裝入1/4-1/2發酵罐有效體積（可加入發酵培養基的總體積，V）的初始發酵培養基，按照體積比2%-5%的接種量接入發酵菌種子液，當發酵菌生長至對數期，按照流加時間16-24h勻減速流加3/4-1/2發酵罐有效體積（V）的補料發酵培養基，流加結束後繼續發酵60-72h。

本發明步驟（1）所述的丁醇發酵菌為丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），優選丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824，購於美國模式菌種收集中心；或者採用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌CM20，其分類命名為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已於2014年06月17日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.9354。本發明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。本發明優選使用拜氏梭菌CM20，該菌株由於自身的特異性，在該發酵體系中適應性更好，總溶劑產量更高。

本發明步驟（1）所述的RCM培養基的具體配方，以g/L計為：蛋白腖10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖5，可溶性澱粉 1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉 3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，瓊脂 0.5，以純水配置，115℃滅菌20min。

本發明步驟（1）所述的發酵菌種子液是在RCM培養基中接入丁醇發酵菌的孢子液，厭氧環境下於36-38℃下培養16-24h獲得的。

本發明步驟（2）所述的P2培養基為本領域人員所熟知的用於丁醇發酵的發酵培養基，培養基配方以g/L計為：總糖60-80，酵母1.0，CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4 0.01，對氨基苯甲酸 0.001，維生素B1 0.001，生物素0.001e-3。

本發明步驟（2）所述的糖可以為葡萄糖、蔗糖、木糖等中的一種或幾種，也可以使用纖維素、半纖維素等的水解糖液，優選葡萄糖或含葡萄糖的水解糖液。

本發明步驟（2）所述的發酵培養基製備好後，初始發酵培養基的pH為自然，通常為6.0左右；補料發酵培養基的pH為7.0-9.0，優選為7.0-8.0。調節pH可以採用無機鹼或有機鹼調節pH，如無機鹼可以採用氫氧化鈉等，優選採用有機鹼三羥甲基氨基甲烷（Tris），不僅能夠調節pH，而且有助於增強發酵體系的緩衝能力，有助於延長產酸期的時間，提高糖轉化率。

本發明步驟（3）所述的初始發酵液在攪拌條件下，36-38℃厭氧培養18-24h後進入對數生長期。本發明首先根據加入的補料發酵培養基體積（1/4V-1/2V）以及補料所需流加時間（16-24h），確定培養基流加的加速度k，然後根據流速v=v0-kt的方式設定泵的流加速度，使其以勻減速方式流加，其中v0為初始流加速度，t為流加時間，流加完畢後，繼續培養發酵60-72h結束。發酵過程中攪拌轉速為100-200rpm。

本發明步驟（3）的發酵過程中，發酵培養基中總糖的投放量不因批次補料的工藝的不同而產生變化，即使初始發酵培養基和補料發酵培養基的體積及糖濃度不同，但是總糖量為固定量，優選為60V-80V(g)，也就是說在總糖量相同的條件下進行發酵過程的調控，從而可以增加了發酵的總溶劑產量。

本發明在丁醇發酵菌的生長對數期，通過勻減速一次性補加高pH值培養基的方式，最大限度地滿足菌種生長發酵的需要，從而更好地解決了批次發酵中發酵底物抑制及菌種代謝產物阻遏等問題，促進菌種的二次生長，延長了產酸期的時間，在總糖量相同的條件下，提高了糖轉化率，顯著增加了發酵的總溶劑產量。本領域技術人員知道，通常丁醇發酵中溶劑生成比例為：丁醇:丙酮:乙醇=6:3:1，經本發明處理後，在提升丁醇和丙酮產量的同時，大大提高了乙醇的產量，乙醇與丙酮的比例從1:3提高為接近1:1。本發明方法提高了發酵周期內總溶劑產量，降低了發酵工藝的成本。

生物材料保藏說明

本發明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。

具體實施方式

以下參照具體的實施例來說明本發明。實施例中所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不以任何方式限制本發明的範圍。

以下各實施例中的RCM培養基（g/L）組成如下：蛋白腖10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖 5，可溶性澱粉 1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉 3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，瓊脂 0.5，以純水配置，115℃滅菌20min。

以下各實施例中所採用的P2發酵培養基（g/L）組成如下：總糖（根據不同實施例具體確定），酵母1.0，CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4 0.01，對氨基苯甲酸 0.001，維生素B1 0.001，生物素0.001e-3，以純水配置，其中糖和酵母粉115℃滅菌30min，其他物質用0.22μm的濾膜過濾添加。

以下各實施例中採用的發酵罐有效體積為4L，雖然丁醇發酵菌的發酵工藝不同，但發酵所投放的總糖量控制為65×V =65×4 =260(g)。

實施例1

（1）將丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接種到RCM培養基中，厭氧環境下於37℃下培養20h獲得發酵菌種子液。

（2）製備初始發酵培養基，採用葡萄糖，糖濃度為30g/L；製備補料發酵培養基，糖濃度為100g/L，採用氫氧化鈉調節pH為7.5。

（3）採用發酵罐有效體積4L的發酵罐，預先裝入2L的初始發酵培養基，按照體積比4%的接種量接入發酵菌種子液，發酵溫度37℃，攪拌速率100rpm，在發酵20h後，發酵菌進入對數期。開始流加補料發酵培養基，體積為2L，流加時間為24h，計算得到k=1.93×10-3ml•(min)-2，初始流加速度v0=2.78mL/min，勻減速流加完畢後，繼續培養發酵72h。

發酵液中的糖含量及丁醇含量通過高效液相色譜法分析測定，丙酮含量通過氣相色譜法分析測定，乙醇含量通過生物傳感分析儀（乙醇酶膜）測定，總溶劑含量為乙醇、丙酮、丁醇三者含量的總和。經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為11.041g/L、5.021g/L及4.9g/L，總溶劑產量為20.962g/L，溶劑轉化率（糖轉化溶劑量與糖加入量的比例，下同）為32.25%。

實施例2

（1）將丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接種到RCM培養基中，厭氧環境下於37℃下培養20h獲得發酵菌種子液。

（2）製備初始發酵培養基，採用葡萄糖，糖濃度為30g/L；製備補料發酵培養基，糖濃度為100g/L，採用氫氧化鈉調節pH為7.0。

（3）採用發酵罐有效體積4L的發酵罐，預先裝入2.0L的初始發酵培養基，按照體積比4%的接種量接入發酵菌種子液，發酵溫度37℃，攪拌速率100rpm，在發酵20h後，發酵菌進入對數期。開始流加補料發酵培養基，體積為2.0L，流加時間為20h，計算得到k=2.78×10-3ml•(min)-2，初始流加速度v0=3.33mL/min，勻減速流加完畢後，繼續培養發酵60h。

發酵液中的糖含量及丁醇含量通過高效液相色譜法分析測定，丙酮含量通過氣相色譜法分析測定，乙醇含量通過生物傳感分析儀（乙醇酶膜）測定，總溶劑含量為乙醇、丙酮、丁醇三者含量的總和。經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為11.224 g/L、5.031g/L及4.5g/L，溶劑總產量為20.755g/L，溶劑轉化率為31.9%。

實施例3

（1）將丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接種到RCM培養基中，厭氧環境下於37℃下培養20h獲得發酵菌種子液。

（2）製備初始發酵培養基，採用葡萄糖，糖濃度為40g/L；製備補料發酵培養基，糖濃度為80g/L，採用氫氧化鈉調節pH為8.0。

（3）採用發酵罐有效體積4L的發酵罐，預先裝入1.5L的初始發酵培養基，按照體積比3%的接種量接入發酵菌種子液，發酵溫度37℃，攪拌速率100rpm，在發酵20h後，發酵菌進入對數期。開始流加補料發酵培養基，體積為2.5L，流加時間為24h，計算得到k=2.41×10-3ml•(min)-2，初始流加速度v0=3.47mL/min，勻減速流加完畢後，繼續培養發酵72h。

發酵液中的糖含量及丁醇含量通過高效液相色譜法分析測定，丙酮含量通過氣相色譜法分析測定，乙醇含量通過生物傳感分析儀（乙醇酶膜）測定，總溶劑含量為乙醇、丙酮、丁醇三者含量的總和。經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為11.388g/L、5.161g/L及4.7/L，溶劑總產量為21.199g/L，溶劑轉化率為32.6%。

實施例4

處理流程及操作條件同實施例1，不同之處在於：採用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20。發酵結束後，經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為11.579 g/L、5.267g/L及5.0g/L，溶劑總產量為21.846g/L，溶劑轉化率為33.6%。

實施例5

處理流程及操作條件同實施例1，不同之處在於：採用有機鹼三羥甲基氨基甲烷（Tris）調節pH。發酵結束後，經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為11.885 g/L、5.324g/L及5.1g/L，溶劑總產量為22.309g/L，溶劑轉化率為34.3%。

實施例6

處理流程及操作條件同實施例4，不同之處在於：採用有機鹼三羥甲基氨基甲烷（Tris）調節pH。發酵結束後，經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為12.127g/L、5.504g/L及5.2g/L，溶劑總產量為22.831g/L，溶劑轉化率為35.1%。

比較例1

處理流程及操作條件同實施例1，不同之處在於：採用恆流速流加葡萄糖濃度為100g/L的發酵培養基，流速始終為1.39mL/min，流加時間24h，流加完畢後，繼續培養發酵72 h。經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為10.896 g/L、3.925g/L及3.4g/L，溶劑總產量為18.221g/L，溶劑轉化率為28.0%。

比較例2

處理流程及操作條件同實施例1，不同之處在於：補料發酵培養基的pH為自然的6.2，不進行調節。經檢測，發酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產量分別為10.871g/L、3.911g/L及2.9g/L，溶劑總產量為17.682g/L，溶劑轉化率為27.2%。