一種篩選具有保護或改善腎功能活性化合物的方法
2023-06-04 11:51:36
一種篩選具有保護或改善腎功能活性化合物的方法
【專利摘要】本發明涉及一種篩選保護或改善腎功能活性化合物的方法，該方法將能造成腎臟損傷的化合物與待測化合物共同作用於斑馬魚胚胎，或者先用腎毒性化合物作用於斑馬魚胚胎造成腎臟損傷然後再用待測化合物處理損傷後的胚胎，利用胚胎組織中的肌酐含量變化作為檢測腎臟功能的指標，分析待測化合物是否具有保護或改善腎功能活性，建立一種具有快速、可靠、高通量特點的活性化合物的篩選方法，為腎臟疾病治療藥物的研究開發提供先導化合物。
【專利說明】一種篩選具有保護或改善腎功能活性化合物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種篩選保護或改善腎功能活性化合物的方法，屬於醫藥生物技術領 域。
[0002] 研究背景
[0003] 隨著社會發展，生活節奏加快，加上人們不良的飲食習慣和生活方式，導致糖尿 病、高血壓、心臟病等慢性疾病發病率明顯增加，這些疾病通常需要常年服藥，容易對腎臟 功能造成損傷，同時，經濟快速發展帶來的日益嚴重的環境汙染，進一步加劇了腎臟損傷的 發生。臨床上，腎臟病變具有起病隱匿、治療難、死亡率高的特點，臨床可用的治療方法和治 療藥物非常有限，發展至後期患者只能依靠透析甚至換腎以維持生命，給患者及其家庭帶 來巨大的痛苦和沉重的經濟負擔。因此，確立快速、有效的篩選方法，加快創新藥物的研發， 對腎臟疾病的預防和治療具有重大意義。
[0004] 利用整體動物模型開展的體內實驗，將受試樣品置於複雜的機體內環境下，能客 觀反映樣品在體內的代謝規律和作用機制，及體內各器官相互作用下機體的反應，所獲得 的結果可靠性高，參考價值大。但這些模型動物飼養成本高、繁殖周期長，很難實現化合物 活性的快速、高通量篩選。斑馬魚作為一種理想的脊椎模式生物，已在發育生物學、疾病模 型及藥物研發等領域得到廣泛應用。與其他哺乳動物模型比，斑馬魚產卵量高，發育周期 短，藥物用量少，可重複性強，更適用於大規模化合物篩選研究。
[0005] 腎臟在進化中具有三種形式：前腎、中腎和後腎，在斑馬魚物種，腎臟分為幼魚期 的前腎和成魚期的中腎。在胚胎受精後14h(14hpf，14hours post-fertilization)斑馬魚 腎臟開始發育，72hpf時腎臟發育完成。斑馬魚前腎由一對腎單位組成，前腎的解剖結構比 成魚的中腎及哺乳動物的後腎簡單，但在細胞組成及分子水平上與哺乳動物的腎臟相似， 並已具備同樣複雜的生物功能。而且，許多化合物引起的斑馬魚胚胎腎臟反應與人類的腎 髒反應非常相似。另外，斑馬魚發育第一周內，由於鰓還未發育完全，主要依賴腎臟排出體 內多餘的水分和代謝廢物，加之此階段仔魚不必餵食即可存活，幹擾因素少，非常有利於開 展腎臟相關方面的研究。
[0006] 疾病導致機體病理生理發生變化，必然引起組織中代謝組分含量的變化，對這些 組分，尤其是一些與器官功能狀態密切相關的生物標誌物的檢測，是診斷疾病發生、發展的 重要依據。肌酐是肌肉的代謝產物，由前體化合物磷酸肌酸轉化而成，主要由腎臟排出體 夕卜。腎功能受損時，肌酐在體內蓄積成為有害毒素。臨床上，血肌酐值是了解腎臟功能的 重要指標，在以嚙齒類動物模型開展的腎臟相關實驗中，血、尿肌酐值是必不可少的檢測項 目。對斑馬魚胚胎，由於體積小，難以獲取足夠的血液或尿液樣本，目前，針對斑馬魚胚胎肌 酐方面的檢測資料尚無報導，但已有研究表明，自胚胎受精之後的一段發育時期內，胚胎組 織中的肌酐含量呈逐步上升趨勢，這與胚胎活動能力逐漸增強有關，也說明組織中的肌酐 水平與機體的功能狀態息息相關。而作為腎臟功能標誌物，了解斑馬魚組織中肌酐含量的 變化對掌握腎臟功能狀態具有重要指示意義。
【發明內容】
[0007] 本發明針對現有方法的不足，提供一種篩選具有保護或改善腎功能活性化合物的 方法。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明將能造成腎臟損傷的化合物與待測化合物共同作用於斑馬魚胚胎，或者先 用腎毒性化合物作用於斑馬魚胚胎造成腎臟損傷然後再用待測化合物處理損傷後的胚胎， 利用胚胎組織中的的肌酐含量變化作為檢測腎臟功能的指標，分析待測化合物是否具有保 護或改善腎功能活性，建立一種具有快速、可靠、高通量特點的活性化合物的篩選方法，為 腎臟疾病治療藥物的研究開發提供先導化合物。
[0010] 發明詳述
[0011] 本發明的技術方案如下：
[0012] 一種篩選具有保護或改善腎功能活性化合物的方法，包括以下步驟：
[0013] (1)將發育3?6天的斑馬魚胚胎放入含已知腎毒性化合物的培養水溶液中，培 養20?28h，然後去除死亡胚胎，用純水洗淨胚胎表面殘留液，製得損傷組胚胎；同時採用 未加已知腎毒性化合物的培養水在相同條件下培養，製得正常組胚胎；將發育3?6天的斑 馬魚胚胎放入含同一已知腎毒性化合物和待測化合物的培養水溶液中，培養20?28h，然 後去除死亡胚胎，用純水洗淨胚胎表面殘留液，製得治療組胚胎；
[0014] 或者：
[0015] 將發育3?6天的斑馬魚胚胎放入含已知腎毒性化合物的培養水溶液中，培養 20?28h，用純水洗淨胚胎表面殘留液，然後將胚胎分為兩組，一組移入培養水中，另一組 移入含有待測化合物的培養水溶液中，將兩組胚胎繼續培養24h，去除死亡胚胎，用純水洗 淨胚胎表面殘留液，培養水培養的一組記為損傷組胚胎，含有待測化合物的培養水溶液培 養的一組記為治療組胚胎；採用培養水培養44?52h h，製得正常組胚胎；
[0016] (2)向步驟（1)製得的每組胚胎加入同等體積的內標溶液，經勻漿、分層提取其 中的極性組分，提取樣品經氮吹乾後，加入純水溶解，然後過〇. 45 μ m聚醚碸水相濾膜，將 濾液注入LC-MS/MS，進行分離分析；然後分別將肌酐標準品溶液及內標標準品溶液注入 LC-MS/MS，在相同條件下進行檢測；
[0017] (3)根據如下公式：
[0018] C待測樣品=C標準品X AA待測樣品/AA標準品
[0019] 式中：C為提取樣品濃度，AA為色譜峰面積；
[0020] 計算待測樣品中的肌酐及內標含量，再根據內標提取率計算各組胚胎樣品中的肌 酐含量；
[0021] (4)各組胚胎組織中肌酐含量以均值土標準差表示，採用獨立樣本t檢驗法分析 比較組間差異的顯著性；
[0022] 當損傷組胚胎組織中的肌酐含量高於正常組胚胎組織中的肌酐含量，且達到統計 學上的顯著性水平（P〈〇. 05)，則成功造成胚胎腎臟功能損傷；
[0023] 在胚胎腎臟功能發生損傷前提下，當治療組胚胎組織中肌酐含量低於損傷組胚胎 組織中的肌酐含量，且達到統計學上的顯著性水平（P〈〇. 05)，則待測化合物具有保護或改 善腎臟功能的活性。
[0024] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中斑馬魚胚胎培養條件為：28°C、14h光照/10h 黑暗條件下培養。
[0025] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中腎毒性化合物為馬兜鈴酸，濃度為0.5? 4 μ g/mL〇
[0026] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，製得的各組胚胎距受精時間不超過7天。發 明人通過大量實驗發現，受精時間超過7天後的胚胎，由於受到多種幹擾因素影響，會導致 肌酐檢測準確率降低。
[0027] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，所述的斑馬魚胚胎為野生型或AB系斑馬魚 胚胎。
[0028] 根據本發明進一步優選的，上述斑馬魚胚胎為受精3天以上，腎臟已完成發育的 野生型或AB系斑馬魚胚胎。
[0029] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，含有待測化合物的培養水為在培養水中加 入待測化合物或待測化合物與助溶劑的混合。
[0030] 上述助溶劑的目的是促進待測化合物的溶解，助溶劑在所用的濃度範圍內應不對 胚胎產生腎臟毒性作用。
[0031] 上述待測化合物的濃度根據不同的待測化合物產生的毒性不同而不相同，本領域 技術人員可以根據實驗情況自行調整選擇。
[0032] 根據本發明進一步優選的，上述培養水組分為：
[0033] NaCl 5mmol/L, KC1 0. 17mmol/L, CaCl2 0. 4mmol/L, MgS04 0· 16mmol/L，去離子水 配製。
[0034] 所述胚胎組織中的肌酐含量為每一定數目的胚胎組織中所含的肌酐的質量。肌酐 結構式如下：
[0035]
【權利要求】
1. 一種篩選具有保護或改善腎功能活性化合物的方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 將發育3?6天的斑馬魚胚胎放入含已知腎毒性化合物的培養水溶液中，培養 20?28h，然後去除死亡胚胎，用純水洗淨胚胎表面殘留液，製得損傷組胚胎；同時採用未 加已知腎毒性化合物的培養水在相同條件下培養，製得正常組胚胎；將發育3?6天的斑馬 魚胚胎放入含同一已知腎毒性化合物和待測化合物的培養水溶液中，培養20?28h，然後 去除死亡胚胎，用純水洗淨胚胎表面殘留液，製得治療組胚胎； 或者： 將發育3?6天的斑馬魚胚胎放入含已知腎毒性化合物的培養水溶液中，培養20? 28h，用純水洗淨胚胎表面殘留液，然後將胚胎分為兩組，一組移入培養水中，另一組移入含 有待測化合物的培養水溶液中，將兩組胚胎繼續培養24h，去除死亡胚胎，用純水洗淨胚胎 表面殘留液，培養水培養的一組記為損傷組胚胎，含有待測化合物的培養水溶液培養的一 組記為治療組胚胎；採用培養水培養44?52h h，製得正常組胚胎； (2) 向步驟（1)製得的每組胚胎加入同等體積的內標溶液，經勻漿、分層提取其中的 極性組分，提取樣品經氮吹乾後，加入純水溶解，然後過〇. 45 μ m聚醚碸水相濾膜，將濾液 注入LC-MS/MS，進行分離分析；然後分別將肌酐標準品溶液及內標標準品溶液注入LC-MS/ MS，在相同條件下進行檢測； (3) 根據如下公式： C待測樣品=C標準品XAA待測樣品/AA標準品 式中：C為提取樣品濃度，AA為色譜峰面積； 計算待測樣品中的肌酐及內標含量，再根據內標提取率計算各組胚胎樣品中的肌酐含 量； (4) 各組胚胎組織中肌酐含量以均值土標準差表示，採用獨立樣本t檢驗法分析比較 組間差異的顯著性； 當損傷組胚胎組織中的肌酐含量高於正常組胚胎組織中的肌酐含量，且達到統計學上 的顯著性水平，則成功造成胚胎腎臟功能損傷； 在胚胎腎臟功能發生損傷前提下，當治療組胚胎組織中肌酐含量低於損傷組胚胎組織 中的肌酐含量，且達到統計學上的顯著性水平，則待測化合物具有保護或改善腎臟功能的 活性。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中斑馬魚胚胎培養條件為： 28°C、14h光照/10h黑暗條件下培養。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中腎毒性化合物為馬兜鈴酸， 濃度為〇· 5?4 μ g/mL。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中，製得的各組胚胎距受精時 間不超過7天。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中，所述的斑馬魚胚胎為野生 型或AB系斑馬魚胚胎。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的斑馬魚胚胎為受精3天以上且腎臟已 完成發育的野生型或AB系斑馬魚胚胎。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中，含有待測化合物的培養水 為在培養水中加入待測化合物或待測化合物與助溶劑的混合。
8. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述培養水組分為： NaCl 5mmol/L, KC1 0· 17mmol/L，CaCl2 0· 4mmol/L，MgS04 0· 16mmol/L，去離子水配製。
9. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟⑴中，每組胚胎總數不低於30 枚；進一步優選的，每組胚胎總數為50?150枚。
10. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟⑵中，胚胎樣品中加入的內標物 質為西咪替丁標準品溶液；根據本發明進一步優選的，上述西咪替丁標準品的加入量為每 50個胚胎加入3?10ng ; 根據本發明優選的，所述步驟（2)中，提取極性組分為用水：甲醇：氯仿按體積比 (60?70) : (75?85) : (75?85)混合的混合液進行萃取。
【文檔編號】G01N33/15GK104142384SQ201410377736
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】王雪, 劉可春, 韓利文, 孫晨, 楚傑, 彭維兵, 陳錫強, 何秋霞, 張雲, 王希敏, 侯海榮 申請人:山東省科學院生物研究所