一種甘薯胚性愈傷長期增殖保存的方法
2023-06-04 13:02:11 1
專利名稱：一種甘薯胚性愈傷長期增殖保存的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養方法，具體涉及一種甘薯胚性愈傷組織通過植物組織培養和顯微監控技術達到增殖和長期繼代保存的方法。
背景技術：
甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)是世界上重要的糧食、飼料、工業原料和新型能源作物，在亞洲、非洲和拉丁美洲等熱帶、亞熱帶、溫帶地區廣為栽培。甘薯在世界糧食生產中，總產排列第7位。在我國糧食生產中，僅次於水稻、小麥和玉米，居第4位，具有重要的經濟價值和戰略地位。目前我國甘薯常年種植面積在5-6X 106hm2，佔世界總面積的60%以上，年總產量佔世界總產量的80%以上。由於甘薯遺傳上的高度雜合性和種間、種內廣泛存在的雜交不親和性，限制了其育種中親本的自由選配。加之，甘薯遺傳資源匱乏，遺傳基礎狹窄，優異近緣野生種利用困難和病蟲、病毒病危害嚴重，極大地制約了甘薯的生產和發展。利用植物基因工程技術能有效克服常規育種中存在的物種隔離和基因連鎖等障礙，對甘薯品種選育和生產無疑具有潛在的推動意義。甘薯的遺傳轉化研究起步較晚，雖然取得了一些進展，但仍存在著受體材料製備困難，嵌合體和轉化效率低等問題，缺乏一個高效的遺傳轉化體系，因而限制了甘薯基因工程的發展。甘薯胚性愈傷組織可以由體細胞胚胎發生途徑再生植株，是甘薯轉基因利用的主要受體材料。劉慶昌(1996)在生物技術學報發表文章對甘薯胚性懸浮培養的研究表明 周內懸浮培養甘薯品種慄子香可保持100%植株再生能力，37周即降為45.8%。目前甘薯胚性愈傷組織培養中存在的主要問題是(1)利用目前的胚型愈傷懸浮液體增殖技術，甘薯胚性愈傷的胚性保持時間短。(2)胚性愈傷與非胚性愈傷共存，易被增值能力快的非胚型愈傷競爭而失去生存能力和空間，喪失再生能力。(3)胚性愈傷易分化形成胚狀體，失去增殖能力，喪失胚性。(4)外植體取材受甘薯生育期限制，需每年在春季進行莖尖誘導製備胚性愈傷，生產成本高，胚性愈傷擴繁數量少，無法滿足高效遺傳轉化體系受體材料長期提供的需要。針對以上問題，本發明開發一種甘薯胚性愈傷長期繼代增殖的組培方法，為組培苗生產和轉基因實驗長期提供材料。
發明內容
本發明的目的是提供一種甘薯胚性愈傷長期繼代增殖的組培方法，它是利用莖尖分生組織培養過程中誘導形成的胚性愈傷進行形態篩選繼代，達到長期保存和擴增胚性愈傷，以用於生產和實驗的方法。本發明所設計的甘薯胚性愈傷長期繼代增殖方法通過以下技術方案實現，具體如下(1)、繼代胚性愈傷的選擇處理在莖尖分生組織脫分化誘導出愈傷後，在體視鏡下篩選可保持胚性的結構緻密、近球形的胚性愈傷，剔除魚雷胚、子葉胚和結構鬆散的非胚性愈傷，移入含有l-:3mg/L 2,4-D的MS固體培養基中培養，所用培養基體積為25mL，培養皿直徑直徑為9cm，每培養皿放置20-30塊直徑2_3mm的胚性愈傷，培養條件為22士 1°C，黑暗；O)、胚性愈傷的繼代增殖過程按步驟(1)培養每45天後，胚性愈傷長至5_8mm， 在體視鏡下剔除魚雷胚、子葉胚和非胚性愈傷，選擇顆粒緻密的心形和球形胚性愈傷部分， 用尖頭鑷子夾取並按照步驟(1)所述方法培養，1塊愈傷可切取為2-3塊，實現幾何級數增長，3年後理論上可增至224-3m個保持胚性的胚性愈傷；(3)、胚性愈傷經體細胞胚胎發生途徑再生將按照步驟( 增殖的胚性愈傷組織轉移到含1.0mg/L ABA的MS固體培養基中J8±1°C，每日13h，3000Lx光照下培養3_4周， 體細胞胚發育並成小植株，再將獲得的小植株轉移到MS固體培養基中，在^±rC，每日 13h,3000Lx光照下培養3-4周，即可獲得完整植株。本發明的優點1)胚誘導率低是甘薯組培中存在的主要問題，也是制約甘薯轉基因、體細胞植株工廠化生產的瓶頸，通過胚性愈傷繼代增殖，可大量提供轉基因受體材料，解決胚誘導率低的問題。2)以往利用胚性懸浮系增殖方式，增殖速度快，雖短時間可獲得大量胚性愈傷， 但因其繼代頻繁，胚性愈傷在繼代10次後，出現愈傷老化，胚性喪失，再生率下降等問題， 使得此方法獲得的胚性愈傷只能使用6個月；又因其幾何增殖，大量愈傷獲得時間集中，加大了遺傳轉化的工作量；經常剝取莖尖誘導胚性愈傷，費工、費錢，還受生育期及氣候等自然條件的極大限制；由於缺乏長期足量的胚性愈傷作為受體材料而影響了轉基因工作的進程。本發明方法可以彌補以上不足，長期保存胚性愈傷，實現轉基因材料的長期大量提供。3)利用體視鏡下的愈傷形態篩選，繼代時僅挑取結構緻密，近圓形的胚性愈傷，剔除非胚性、魚雷胚等成熟胚，減少了非胚性愈傷對胚性愈傷的競爭，保持了胚性愈傷的良好胚性。胚性愈傷增殖率高，保存時間長，具有很大的應用價值。4)組織培養的適宜溫度為^±1°C，本發明採用22士 1°C，既有效減緩了胚性愈傷的快速生長，又保證了胚性愈傷的大量增殖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明。1)誘導胚性愈傷將甘薯品種徐55-2的莖尖，用70%酒精表面消毒30s，立即轉入0. 1 %的HgCl2溶液中消毒3分鐘，用無菌水洗滌4-5次。在解剖鏡下切取長約0. 5mm的莖尖組織(可帶1-2片葉原基)，將莖尖組織培養在2. Omg/L的2，4-D的MS固體培養基上， 培養條件為^°C，黑暗。誘導胚性愈傷。2)將誘導得到的胚性愈傷組織切成小塊，移入2. 0mg/L2,4-D的MS固體培養基， 培養條件為22°C，黑暗。45天後，在Leica EZ4D型顯微攝像系統下選擇顏色亮黃，緻密顆粒部分的球形胚和心形胚，移入新鮮2. 0mg/L2，4-D的MS固體培養基，培養條件為22°C，黑暗。3)每45天，按照步驟2)的方法進行選擇繼代培養，此條件下培養的胚性愈傷可實現幾何級數增長，累計獲得3萬塊胚性愈傷組織，並且可保持3年體細胞胚胎發生途徑的完全再生能力，即將增殖的胚性愈傷組織轉移到含1. Omg/LABA的MS固體培養基中，在^°C， 每日13h，3000Lx光照下培養3-4周，體細胞胚發育並成小植株，再將獲得的小植株轉移到 MS固體培養基中，在^°C，每日13h，3000Lx光照下培養3-4周，即可獲得完整植株。
權利要求
1.一種甘薯胚性愈傷長期增殖保存的方法，其特徵在於它是利用莖尖分生組織培養過程中誘導形成的胚性愈傷進行形態篩選繼代，達到長期保存和擴增胚性愈傷，具體步驟如下(1)、胚性愈傷的選擇處理將甘薯莖尖分生組織誘導獲得的胚性愈傷，在體視鏡下選擇顆粒緻密、心形和球形的胚性愈傷，切成直徑2-3mm小塊後移入含有l_:3mg/L2，4-D的MS 固體培養基中培養，培養條件為22士 1°C，黑暗；(2)、胚性愈傷繼代增殖培養每45天後，胚性愈傷長至5-8mm；在體視鏡下剔除魚雷胚、子葉胚和非胚性愈傷，選擇顆粒緻密的心形和球形胚性愈傷部分，用尖頭鑷子夾取並按照步驟(1)所述方法培養，1塊胚性愈傷能夠切取為2-3塊，實現幾何級數增長；(3)、胚性愈傷經體細胞胚胎發生途徑再生將按照步驟( 增殖的胚性愈傷組織轉移到含1. Omg/L ABA的MS固體培養基中，觀士 1 °C，每日13h，3000Lx光照下培養3_4周，體細胞胚發育並成小植株，再將獲得的小植株轉移到MS固體培養基中，在^±rC，每日13h， 3000Lx光照下培養3-4周，即可獲得完整植株。
2.根據權利要求1所述的一種甘薯胚性愈傷長期增殖保存的方法，其特徵在於步驟1 所用培養基體積為25mL，培養皿直徑為9cm，每培養皿放置20-30塊直徑2_3mm的胚性愈傷。
全文摘要
本發明公開了一種甘薯胚性愈傷長期增殖保存的方法。其過程包括繼代胚性愈傷的選取、胚性愈傷的繼代增殖、胚性愈傷誘導成成熟胚再生。本發明的有益效果是工藝流程簡單，胚性愈傷增殖率高，可繼代時間長，彌補了甘薯組織培養過程中取材受季節限制、胚性保持時間短等限制胚性愈傷長期利用的技術難題，為甘薯的轉基因技術提供了良好的受體材料，也為周年生產甘薯組培苗提供了大量的高效再生材料。
文檔編號A01H4/00GK102217546SQ20111014669
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月24日 優先權日2011年5月24日
發明者李強, 李秀英, 王欣, 謝逸萍, 馬代夫 申請人:江蘇徐州甘薯研究中心