人源化抗cd20抗體及使用方法

2023-06-19 22:03:46 3

專利名稱：人源化抗cd20抗體及使用方法
技術領域：
本發明涉及人源化抗CD20抗體及其在治療各種疾病和病症中的用途。本發明還涉及編碼此類抗體的核酸、製備此類抗體的方法和包含此類抗體的組合物。
背景技術：
人⑶20 (也稱為人B淋巴細胞限制分化抗原以及Bp35)是位於前B淋巴細胞和成熟B淋巴細胞上的分子量約35千道爾頓的疏水性跨膜蛋白。造血幹細胞、祖B細胞、正常漿細胞或其他正常組織上未發現⑶20。人⑶20是免疫治療B細胞瘤的良好靶標，因為它在超過90%的惡性B細胞表面表達，而不在造血幹細胞、正常漿細胞、骨髓、T譜系、內皮或其他非淋巴樣細胞上表達。人 CD20還是免疫治療自身免疫疾病的良好靶標，因為已經顯示B細胞清除是治療自身免疫疾病的有效策略。例如，作為嵌合抗⑶20抗體C2B8的利妥昔單抗(作為RITUXAN 可商業途徑獲得，由Biogen Idec Inc. ^P Genentech, Inc.銷售)被批准用於各種適應症，包括非霍奇金淋巴瘤和類風溼性關節炎。結合抗體時，⑶20不顯著改變，也不脫落。已經顯示抗⑶20抗體具有許多抗體效應功能，包括通過單核效應細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、補體依賴性溶胞作用、啟動胞間信號例如鈣流、抑制細胞生長、和誘導細胞分化。還已經顯示抗CD20抗體誘導惡性B細胞系的凋亡，特別是在密集交聯之後，例如通過表達IgG的Fc結構域受體 (FCYR)的細胞。抗⑶20單克隆抗體利妥昔單抗、抗Bl和1F5對B細胞系具有類似的凋亡作用。目前鼠抗體和嵌合抗體的限制包括人抗鼠抗體(HAMA)應答和人抗嵌合抗體 (HACA)應答。發明概述一方面，提供了人源化抗體，包括(a)包括輕鏈可變區的輕鏈，所述輕鏈可變區包括選自由以下組成的組的胺基酸序列(I)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln TrpSer Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys(SEQ ID NO :1)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；並且Xaa86 是 Tyr 或 Phe ；禾口(2)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp SerSer Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys(SEQ ID NO :2)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；並且Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；禾口(b)包括重鏈可變區的重鏈，所述重鏈可變區包括以下胺基酸序列Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser ValLys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn GlyAsp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 AspXaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO :3)其中Xaa68 是 Val 或 Ala ;Xaa70 是 Val 或 Leu ；Xaa72 是 Arg 或 Ala ；並且Xaa74 ^ Thr Lys ；其中所述人源化抗體結合人⑶-20。另一方面，提供了一種人源化抗體，包括輕鏈，所述輕鏈包括包含以下胺基酸序列的輕鏈可變區Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ArgVal Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala SerGly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu ThrIle Ser SerLeu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Trp SerSerAsn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys(SEQ ID NO :1)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；並且Xaa86 是 Tyr 或 Phe ；其中所述人源化抗體結合人⑶-20。在另一方面，提供了一種人源化抗體，包括輕鏈，所述輕鏈包括包含以下胺基酸序列的輕鏈可變區Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu ArgAla Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala SerGly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu ThrIle Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser SerAsn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys(SEQ ID NO :2)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 iTrp 或 Leu ；並且Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；其中所述人源化抗體結合人⑶-20。另一方面，提供了一種人源化抗體，包括重鏈，所述重鏈包括包含以下胺基酸序列的重鏈可變區Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser ValLys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn GlyAsp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 AspXaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO :3)其中Xaa68 ^ Val Ala ；Xaa70 是 Val 或 Leu ；Xaa72 是 Arg 或 Ala ；並且Xaa74 是 Thr 或 Lys ；其中所述人源化抗體能夠結合人⑶-20。而另一方面，提供了一種治療受試者的B細胞疾患的方法。所述方法包括給有相應需要的受試者施用治療有效量的本文公開的人源化抗體的任何一種。另一方面，提供了一種預防受試者的B細胞疾患的方法，包括給受試者施用預防有效量的本文公開的人源化抗體的任何一種。另一方面，一種人源化抗⑶20抗體組合物，包括本文公開的人源化抗體的任何一種，其中所述組合物中存在的N-聚糖的至少90%是GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO)。另一方面，提供了藥物組合物，包括本文公開的人源化抗體的任何一種和藥學上可接受的賦形劑。而另一方面，提供了分離的核酸，包括編碼本文公開的人源化抗體的任何一種的核酸序列。還提供了包括前述分離的核酸的任何一種的宿主細胞。附圖簡述圖IA提供了用於產生1F5RHASS核酸分子的各種核酸分子(包括)(62109信號肽、 U00570構架(FR)序列和1F5VH互補決定區(⑶R))的核酸序列的一個實施方案。圖IB描繪了被移植入U00570(從左到右分別為SEQ ID NO :80-83)以產生1F5RHA的來自1F5VH的 CDRU2和3(從左到右分別為SEQ ID NO :77-79)。圖2提供了優化的1F5RHA核酸構建體的核酸(SEQ ID NO 15)和胺基酸序列(SEQ ID NO: 16)，在構架區(FR)中不含突變。圖3提供了優化的1F5RHB核酸構建體的核酸(SEQ ID NO 17)和胺基酸序列(SEQ ID NO 18)，在如下4個非保守遊標殘基(vernier residue)處含有回覆突變:V67A ；V69L ； R71A ；和 T73K (Kabat 編號)。圖4A提供了用於產生人源化抗⑶20抗體一個實例1F5RKA11SS的構架區(FR)和互補決定區(⑶R)的序列。圖4B描繪了用於產生1F5RKA11的FR(從左到右分別為SEQ ID NO 87-90)和CDR(從左到右分別為SEQ ID NO 84-86)的胺基酸序列。圖5提供了基於產生1F5RKA11構建體的1F5RKA11ss的優化抗體的一個實例的核酸序列(SEQ ID NO 30)和胺基酸序列(SEQ ID NO :31)。該構建體不含FR突變。圖6提供了基於1F5RKA11的人源化抗體的一個實例1F5RKB11的核酸(SEQ ID NO 32)和胺基酸序列(SEQ ID NO :33)，在如下3個非保守遊標殘基處和VH/VK界面殘基 Y87F(Kabat編號)處含有回覆突變:L46P ；L47W ；和F7IY(Kabat編號)。圖7A提供了用於產生人源化抗⑶20抗體的一個實例1F5RKA12SS的構架區(FR) 和互補決定區(⑶幻的序列。圖7B描繪了被移植入人AY^53415的受體FR(從左到右分別為SEQ ID NO 94-97)以產生1F5RKA12的來自1F5VK的CDRU2和3(從左到右分別為SEQ ID NO 91-93)。圖8提供了基於產生1F5RKA12構建體的lF5RKA12ss的優化抗體的一個實例的核酸序列(SEQ ID NO 44)和胺基酸序列(SEQ ID NO :45)。該構建體不含FR突變。圖9提供了基於1F5RKA12的人源化抗⑶20抗體的一個實例1F5RKB12的核酸序列(SEQ ID NO 46)和胺基酸序列(SEQ ID NO :47)，在如下3個非保守遊標殘基含有回覆突變:L46P ；L47W ；和 F7IY (Kabat 編號)。圖IOA提供了 1F5RHA變體實例的胺基酸序列比對。圖IOB提供了 1F5RKA11變體實例的胺基酸序列比對。圖IOC提供了 1F5RKA12變體實例的胺基酸序列比對。CDR胺基酸殘基由標記「CDR1」、「CDR2」和「CDR3」的框指示；加下劃線的胺基酸指示被引入人源化序列的小鼠FW殘基。
圖 IlA-E 提供了來自 1F5RKG11、1F5RKB11、1F5RKF12、1F5RKB12 和 1F5RHA 蛋白的成熟可變區和恆定區的胺基酸序列。圖IlA提供了 1F5RKG11(SEQ ID NO :60)的成熟可變區和恆定區(加下劃線)的胺基酸序列。圖IlB提供了 1F5RKB11(SEQ ID NO :61)的成熟可變區和恆定區(加下劃線)的胺基酸序列。圖IlC提供了 1F5RKF12(SEQ ID NO :62)的成熟可變區和恆定區(加下劃線)的胺基酸序列。圖IlD提供了 1F5RKB12(SEQ ID NO :63) 的成熟可變區和恆定區(加下劃線)的胺基酸序列。圖IlE提供了 1F5RHA(SEQ ID NO :64) 的成熟可變區和恆定區(加下劃線)的胺基酸序列。胺基酸序列的恆定區加下劃線。

圖12A提供了與嵌合clF5抗體(嵌合的)相比，嵌合VK χ 1F5RHA(RHA)和VH x(1F5RKA11、1F5RKA12 或 1F5RKB11)的 Raji 結合測定的結果。圖 12B 提供了與 Rituxan 相比，與嵌合VK結合的人源化1F5RHA(RHA)或1F5RHB (RHB)的Raji結合測定的結果。圖 12C和12D提供了與嵌合抗體clF5相比，與嵌合VH結合的人源化1F5VK形式(KB11等)的 Raji結合測定的結果。圖13A和1 提供了與嵌合形式的1F5相比，與所示人源化1F5 κ鏈結合的人源化1F5RHA編碼的抗體的Raji細胞結合的實例。測量值是兩個重複孔的平均值。圖14提供了與嵌合形式的1F5相比，與所示人源化1F5 κ鏈結合的人源化1F5RHA 編碼的抗體的Raji細胞結合的實例。測量值是四個重複孔的平均值。誤差棒指示四個重複之間的標準偏差。圖15提供了人源化抗CD20抗體的一些實施方案的熱穩定性結果的實例。每個抗體在培養基/PBS中被稀釋至lyg/ml，在所示溫度下加熱10分鐘，然後冷卻至4°C，然後在室溫Raji細胞結合ELISA。人源化抗體(除了 Rituxan外)與所示輕鏈構建體一起被 1F5RHA 編碼。圖16提供了人源化抗CD20抗體的幾個實施方案對Raji細胞的螢光抗體結合測定中平均螢光強度的實例。圖17提供了優化前的嵌合C1F5VK核酸(SEQ ID NO 65)和相應胺基酸序列(SEQ ID NO 66)的實例。圖18提供了優化的嵌合C1F5VK核酸(SEQ ID NO 67)和相應胺基酸序列(SEQ ID NO 68)的實例。圖19提供了優化前的嵌合C1F5VH核酸(SEQ ID NO 69)和相應胺基酸序列(SEQ ID NO 70)的實例。圖20提供了優化的嵌合C1F5VH核酸(SEQ ID NO 71)和相應胺基酸序列(SEQ ID NO 72)的實例。圖21顯示GO聚糖結構。圖22提供了嵌合C1F5VH蛋白序列(成熟可變區和恆定區)(SEQ ID NO 73)的實例。胺基酸序列的恆定區加下劃線。圖23提供了嵌合C1F5VK蛋白序列(成熟可變區和恆定區)(SEQ ID NO 74)的實例。胺基酸序列的恆定區加下劃線。圖M顯示實施例5所解釋的各種濃度的測試抗⑶20抗體的⑶C測定結果。圖25顯示實施例5所解釋的測量抗⑶20抗體與Raji細胞解離(即，解離速率) 的測定結果。
圖沈顯示實施例5中解釋的從針對抗CD20抗體的一個解離速率研究獲得的半衰期的條線圖。圖27顯示使用各種濃度的抗CD20抗體進行B細胞清除測定的結果。圖觀顯示使用各種濃度的抗⑶20抗體在抗⑶16抗體存在下進行B細胞清除測定的結果。發明詳述本發明涉及結合或能夠結合CD20的人源化1F5抗體，以及包含那些抗體的組合物。本發明還涉及編碼人源化1F5抗體的核酸分子。即，提供了人源化抗CD20抗體和編碼此類抗CD20抗體的核酸分子。本文提供的抗體及其組合物用於治療與表達CD20的細胞(例如B細胞)相關的疾病和病症的方法，所述疾病和病症包括淋巴瘤、自身免疫疾病和移植排斥。所述組合物包括人源化抗CD20抗體、人源化抗CD20抗體的抗原結合片段、和此類抗體的藥物組合物。所述組合物還包括編碼本文討論的人源化抗CD20抗體的分離的核酸分子，包含編碼人源化抗 CD20抗體的核酸分子的載體，經所述載體轉化或加入表達人源化抗體的核酸分子的宿主細胞(包括轉染瘤和雜交瘤)，抗CD20人源化抗體的藥物製劑，和製備和使用它們的方法。還提供了治療或預防與表達CD20的細胞相關的疾病或疾患(例如B細胞疾患)的方法。在更詳細描述本發明之前，首先定義下述術語。除非另外指明，所有核酸序列以 5'至3'方向從左到右書寫，並且所有胺基酸序列以氨基末端至羧基末端方向從左到右書寫。定義術語「抗體」和「免疫球蛋白」在本文可互換使用並且以其最廣泛含義使用。具體說，該術語包括單克隆抗體、多特異性抗體、抗體片段和其他抗體和免疫球蛋白，只要它們表現出期望的生物活性和功能。「抗體片段」和「抗體片段」包括全長抗體的一部分，並且一般包括其可變區。本文使用的「⑶20」或「人⑶20」(還稱為人B淋巴細胞限制分化抗原，Bp35)指在正常和惡性B細胞上表達的分子量約35千道爾頓的跨膜磷蛋白。本文使用的「抗⑶20抗體」表示特異性結合人⑶20的抗體。本文使用的「嵌合抗體」指其中免疫反應性或結合區或位點獲自或源自第一物種並且恆定區(它可以是完整的、部分的或修飾的)獲自第二物種的任何抗體。例如，靶結合區或位點源自非人來源(例如，小鼠或靈長類)，並且恆定區源自人抗體。「人源化抗體」指包括至少一部分人抗體的修飾可變區的多肽，其中所述可變區的一部分，優選明顯少於完整人可變結構域的部分已經被來自非人物種的相應序列所取代， 並且其中修飾的可變區連接至另一蛋白的至少另一部分，優選人抗體的恆定區。措辭「人源化抗體」包括其中一個或多個互補決定區(「CDR」)胺基酸殘基和/或一個或多個構架區 (「FW」或「FR」)胺基酸殘基被來自能夠結合CD20的嚙齒類動物或其他非人抗體中類似位點的胺基酸殘基所取代的人抗體。措辭「人源化抗體」還包括能夠結合CD20並且包括基本具有人免疫球蛋白的胺基酸序列的FR和基本具有非人免疫球蛋白的胺基酸序列的CDR的免疫球蛋白胺基酸序列變體或其片段。免疫球蛋白重鏈可以被分類為gamma(Y)、mu(l·!)、alpha(a)、delta(S)或印sil0n(O，它們中具有一些亞類(例如，Y1-Y4)。抗體分別分類(或「類別」)為IgG、 IgM、IgA、IgD或IgE是由賦予免疫球蛋白功能屬性的重鏈性質決定的。免疫球蛋白可以被分成亞類(或「同種型」)，例如IgG1UgG2UgGp IgG4UgA1等。此類同種型是良好表徵的， 並且賦予免疫球蛋白額外的功能屬性。對IgG而言，標準的免疫球蛋白分子包括兩個相同的輕鏈多肽和兩個相同的重鏈多肽。四個鏈通常由二硫鍵連接為「Y」構型，其中輕鏈從「Y」 的開口開始持續經可變區來包裹重鏈。有兩種輕鏈類型kappa( κ )或IambdaU )。每個重鏈類別可以與κ或λ輕鏈結合。通常，輕鏈和重鏈彼此共價結合，並且當免疫球蛋白由B細胞淋巴瘤、B細胞或基因工程宿主細胞產生時，兩個重鏈的「尾」部分通過共價二硫鍵和非共價鍵彼此結合。重鏈中， 胺基酸序列從Y構型的分叉端的氨基末端運行至每條鏈底部的羧基末端。輕鏈和重鏈都被分成結構和功能同源性的區域，稱為「恆定區」和「可變區」。術語 「恆定」和「可變」在功能上使用。輕鏈部分久或VL)和重鏈部分％或￥!1)的可變結構域決定抗原識別和特異性。相反，輕鏈(CJ和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恆定結構域賦予重要的生物性質，例如分泌、經胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合等。按照慣例，恆定區結構域的編號隨著它們遠離抗體的抗原結合位點或氨基末端而增加。可變區在氨基末端，而恆定區在羧基末端；C03和Q結構域實際上分別包括重鏈和輕鏈的羧基末端。措辭「互補決定區」、「高變區」和「⑶R」指抗體輕鏈或重鏈的可變區中存在的高變區或互補決定區(CDR)的一個或多個(參見，Kabat, Ε. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda,Md. , (1987))。 這些措辭包括Kabat等人定義的高變區(「kquences of Proteins of Immunological Interest，，，Kabat E.,等人，US Dept. of Health and Human Services, 1983)或抗體三維結構中的高變環(Chothia 和 Lesk，J Mol. Biol. 196 901-917(1987))。每條鏈中的 CDR 通過構架區保持緊密靠近，並且與來自其他鏈的CDR —起促進抗原結合位點的形成。措辭「構架區」和「FR」指抗體輕鏈和重鏈的可變區內構架區的一個或多個(參見，Kabat, Ε. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health，Bethesda，Md.，(1987))。這些措辭包括抗體輕鏈和重鏈中位於氨基末端和第一 CDR之間的那些胺基酸序列，介於CDR之間的那些，以及第三CDR和恆定區起點之間的那些。CDR和FR殘基可以根據標準序列定義(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987))禾口結構定義(Chothia 和 Lesk, J. Mot. Biol. 196 :901-217 (1987))來確定。在本文指出時，參考Kabat，Ε. Α.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)禾口 (1991)的編號方案。Kabat利用為所列序列中每個胺基酸分配殘基編號的方法，並且分配殘基編號的該方法已經成為本領域的標準。當指出時，本說明書遵循Kabat編號方案。當未指出Kabat編號時，使用順序胺基酸序列編號(即，序列中的胺基酸使用順序整數(1、2、 3等)以氨基末端到羧基末端的方向從左到右編號。抗體的「抗原結合片段」指基本上與全長1F5抗體相同地作用以結合CD20的本文公開抗體的生物活性片段。此類片段包括全長抗體的一部分，一般是其抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。「Fv」是含有完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該片段由緊密非共價結合的一個重鏈可變區結構域和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。這兩個結構域摺疊產生六個高變環(從H鏈和L鏈各自3個環)，促進抗原結合的胺基酸殘基並賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或僅包含針對抗原的三個CDR的Fv的一半)具有識別和結合抗原的能力，但是比完整結合位點親和力低。術語「利妥昔單抗」或「RITUXAN 」指針對⑶20的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體，具有美國專利第5，736，137號中稱為「C2B8」的抗體的胺基酸序列。「抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用」和「ADCC」指其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體並隨後引起靶細胞溶胞的細胞介導的反應。用於介導ADCC的原代細胞NK細胞僅表達!7C γ RIII，而單核細胞表達 Fc γ RI、Fc γ RII 和 Fc γ RIII。抗體對抗原或表位的「親和力」是本領域很好理解的術語，並且表示抗體對表位結合的程度或強度。親和力可以本領域已知的多種方式測量和/或表達，包括但不限於平衡解離常數(Kd或Kd，它可以被定義為抗體的解離速率與結合速率的比率，即，K。ff/K。n)、表觀平衡解離常數OV或Kd,)和IC50(實現競爭測定中50%抑制所需的量)；人源化抗體的相對親和力也可以通過與例如相關的鼠或嵌合抗體比較來確定。要理解，對於本發明目的而言，親和力是結合抗原或表位的給定抗體群體的平均親和力。本文所述人源化抗CD20抗體的親和力(或相對親和力)可以使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)或螢光激活的細胞分選 (FACS)測定來測量，如本文實施例所述。「解離速率」表示抗體從抗體/抗原複合物的解離速率常數(K。ff)。因此，具有低解離速率的抗體比較高解離速率的抗體保持與抗體結合更長時間。「結合速率」表示抗體與抗原形成抗體/抗原複合物的結合速率常數(KJ。「有效量」指有效實現預期治療或預防結果所必需的量，劑量和持續時間。抗體的「治療有效量」可以根據諸如以下因素而改變疾病狀態、個體的年齡、性別和體重、以及抗體引發個體預期應答的能力。治療有效量也是其中抗體的治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。「預防有效量」指有效實現預期治療結果所必需的量，劑量和持續時間。通常但不一定，因為預防劑量在疾病之前或疾病早期用於受試者，所以預防有效量可能小於治療有效量。「B細胞疾患」包括多種疾患，包括但不限於B細胞惡性病、自身免疫疾患、B細胞淋巴瘤、B細胞白血病和其他疾患。本文使用的「自身免疫疾患」或「自身免疫疾病」指源自並針對個體自身組織的非惡性疾病或疾患。自身免疫疾病或疾患的實例包括但不限於炎症反應，例如炎性皮膚疾病， 包括銀屑病和皮膚炎(例如，特異性皮炎)；系統性硬皮病和硬化症；與炎性腸病相關的反應(例如，Crohn病和潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫症候群(包括成人呼吸窘迫症候群；ARDS)； 皮膚炎；腦脊膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；血管球性腎炎；過敏性病症，例如溼疹和哮喘和其他涉及T細胞侵潤和慢性炎症反應的病症；粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風溼性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬CN 102439163 A
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化；Raynaud症候群；自身免疫性甲狀腺炎；變應性腦脊髓炎；^0gren症候群；青少年型糖
尿病；和由細胞因子和T淋巴細胞介導的與急性和延遲型超敏反應相關的免疫應答，通常存在於結核病、結節病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎；惡性貧血病(Addison疾病)；涉及白細胞血細胞滲出的疾病；中樞神經系統(CNS)炎性疾患；多器官損傷症候群；溶血性貧血(包括但不限於冷球蛋白血症或Coombs陽性貧血)；重症肌無力；抗原-抗複合物介導的疾病； 抗腎小球基底膜疾病；抗磷脂症候群；過敏性神經炎；Graves疾病；Lambert-Eaton肌無力症候群；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內分泌腺疾病；Reiter疾病；僵體症候群；Behcet疾病；巨細胞動脈炎；免疫複合物腎炎；IgA腎病；IgM多發性神經病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少症等。人源化1F5抗體本發明提供了能夠結合人CD20的人源化1F5抗體及其抗原結合片段(即，人源化抗CD20抗體)。在一個實施方案中，提供了人源化抗體(包括其抗原結合片段)，包括輕鏈，所述輕鏈包括包含選自由以下組成的組的胺基酸序列的輕鏈可變區(I)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln TrpSer Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys(SEQ ID NO :1)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；並且Xaa86 是 Tyr 或 Phe ；和(2)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp SerSer Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys(SEQ ID NO :2)其中 Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；並且Xaa70 是 Tyr 或 Phe。在另一個實施方案中，提供了包括重鏈的人源化抗體(包括其抗原結合片段)，所述重鏈包括包含下述胺基酸序列的重鏈可變區Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser ValLys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp ValArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn GlyAsp Thr S er Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 AspXaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO :3)其中Xaa68 ^ Val Ala ；Xaa70 是 Val 或 Leu ；Xaa72 是 Arg 或 Ala ；並且Xaa74 是 Thr 或 Lys。因此，抗⑶20抗體的輕鏈可變區可以具有各種胺基酸序列，包括圖IOB和IOC中所示的以下胺基酸序列SEQ ID NO :28、49、50、51、52、53、54、42、55、56、57、58 和 59。在一個實例中，抗⑶20抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO :49的胺基酸序列。在另一個實例中， 抗⑶20抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO力4的胺基酸序列。在另一個實例中，抗⑶20抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO :59的胺基酸序列。在另一個實例中，抗⑶20抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO 55的胺基酸序列。抗⑶20抗體的重鏈可變區可以具有各種胺基酸序列，包括圖IOA中所示的以下胺基酸序列:SEQ ID NO :13 禾口 SEQ ID NO :48。在一個實施方案中，提供了人源化抗體(包括其抗原結合片段)，包括(a)輕鏈，包括包含選自由以下組成的組的胺基酸序列的輕鏈可變區(I)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln TrpSer Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys(SEQ ID NO :1)其中Xaa45 ^ Pro Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ;Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；並且Xaa86 是 Tyr 或 Phe ；和(2)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp SerSer Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys(SEQ ID NO :2)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；
Xaa46 是 Trp 或 Leu ；並且Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；和(b)重鏈，包括包含以下胺基酸序列的重鏈可變區Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser ValLys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn GlyAsp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 AspXaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO :3)其中Xaa68 ^ Val Ala ；Xaa70 是 Val 或 Leu ；Xaa72 是 Arg 或 Ala ；並且Xaa7JThi^Lys0在一個實施方案中，抗⑶20抗體可以包括(1)包括具有SEQ ID NO: 13所示胺基酸序列的重鏈可變區的重鏈和( 包括具有SEQ ID NO :49所示胺基酸序列的輕鏈可變區的輕鏈。在另一個實施方案中，抗⑶20抗體可以包括(1)包括具有SEQ ID N0:13所示胺基酸序列的重鏈可變區的重鏈和( 包括具有SEQ ID NO力4所示胺基酸序列的輕鏈可變區的輕鏈。在另一實施方案中，抗⑶20抗體可以包括(1)包括具有SEQ ID N0:13所示胺基酸序列的重鏈可變區的重鏈和( 包括具有SEQ ID NO :55所示胺基酸序列的輕鏈可變區的輕鏈。在另一實施方案中，人源化抗⑶20抗體可以包括(1)包括具有SEQ ID N0:13所示胺基酸序列的重鏈可變區的重鏈和( 包括具有SEQ ID NO :59所示胺基酸序列的輕鏈可變區的輕鏈。本文的人源化抗⑶20抗體能夠結合人⑶20。在一些實施方案中，人源化抗⑶20 抗體以類似於抗體1F5的親和力(S卩，以類似於抗體1F5對人CD20的親和力的親和力)結合⑶20。在其他實施方案中，人源化抗⑶20抗體以至少與1F5 —樣大的親和力結合⑶20。 在另一實施方案中，人源化抗CD20抗體以大於抗體1F5的親和力結合CD20。本文使用的 「類似於抗體1F5的親和力」意思是與抗體1F5的親和力足夠高度相似的親和力，使得本領域技術人員將認為親和力差異很小或沒有生物學意義。在一些實施方案中，人源化抗CD20抗體以類似於本文實施例所述嵌合抗體clF5 的親和力(即，以類似於嵌合抗體clF5對人CD20的親和力的親和力)結合人CD20。在其他實施方案中，人源化抗CD20抗體以至少與嵌合抗體clF5 —樣大的親和力結合CD20。在另一實施方案中，人源化抗CD20抗體以大於嵌合抗體clF5的親和力結合人CD20。本文使用的「類似於嵌合抗體clF5的親和力」意思是與嵌合抗體clF5的親和力足夠高度相似的親和力，使得本領域技術人員將認為親和力差異很小或沒有生物學意義。
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在一些實施方案中，人源化抗CD20抗體以小於嵌合抗體clF5的解離速率結合人 CD20。在其他實施方案中，人源化抗CD20抗體不小於嵌合抗體clF5的解離速率。在其他實施方案中，人源化抗CD20抗體以大於利妥昔單抗的親和力結合CD20。在其他實施方案中，人源化抗CD20抗體以小於利妥昔單抗的解離速率結合CD20。抗⑶20抗體可以包括任何同種型、同種異型和獨特型的重鏈恆定區(或其部分) 和/或輕鏈恆定區(或其部分)。此類重鏈和輕鏈恆定區可以是天然存在的，或者可以含有缺失、取代或添加突變。人恆定區DNA序列是已知的，並且可以從多種人細胞分離。當存在於重鏈和/或輕鏈上時，恆定區可以連接至重鏈和/或輕鏈的可變區的羧基末端。抗體片段在一些實施方案中，提供了本文描述的人源化抗CD20抗體的片段，而非完整抗體。任何可用的方法可用於產生此類抗體片段。傳統上，這些片段通過蛋白水解消化完整抗體而衍生。然而，這些片段目前可以通過重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv和kFv抗體片段可以全部在大腸桿菌中表達並分泌，因此允許容易生產大量的這些片段。抗體片段可以從抗體噬菌體文庫分離。可選地，Fab' -SH片段可以直接從大腸桿菌回收，並且化學偶聯以形成F(ab' )2片段。根據另一方法，F(ab' )2片段可以從重組宿主細胞培養物直接分離。在其他實施方案中，抗體片段是單鏈Fv片段(scFv)。抗體片段可以是本文描述的人源化抗CD20抗體的抗原結合片段。可以使用完整抗體的任何片段，只要該片段結合CD20。雙特異性抗體人源化抗⑶20抗體還可以用於生產雙特異性抗體。雙特異性抗體是對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可以結合CD20蛋白的兩種不同表位。其他此類抗體可以將CD20結合位點與另一蛋白的結合位點組合。可選地，抗CD20結合位點可以與結合淋巴細胞上的觸發分子結合的結構域或臂組合，所述觸發分子例如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG(Fe y R)的Fc受體，例如Fc y RI (CD64), FcyRII (CD32)和 FcyRIII (⑶16)，或NKG2D或其他NK細胞激活配體，以使細胞防禦機制集中和定位於⑶20 表達細胞。雙特異性抗體還可以用於將細胞毒性劑定位於表達⑶20的細胞。這些抗體具有CD20結合臂和結合細胞毒性劑(例如，皂草素、抗幹擾素_a、長春花生物鹼、蓖麻毒蛋白 A鏈、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以被製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab『 )2雙特異性抗體)。多價抗體人源化抗⑶20抗體還可以用於產生多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快地被表達抗體結合的抗原的細胞內化(和/或分解代謝)。人源化抗CD20抗體可以是具有三個或多個抗原結合位點的多價抗體(它不同於IgM類)(例如四價抗體)，它可以通過重組表達編碼抗體多肽鏈的核酸而被容易地產生。多價抗體可以包括二聚結構域和三個或多個抗原結合位點。優選的二聚結構域包括(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況下，抗體將包括Fc區和在Fc區氨基末端的三個或多個抗原結合位點。本文優選的多價抗體包括 (或由其組成)3至約8個、但優選4個抗原結合位點。多價抗體包括至少一個多肽鏈(並且可以包括兩個多肽鏈)，其中所述多肽鏈包括兩個或多個可變結構域。
重組牛產方法 人源化抗⑶20抗體可以通過任何可用的方法生產，例如重組表達技術。編碼與恆定區可操作連接的輕鏈和重鏈可變區的核酸可以被插入表達載體。輕鏈和重鏈可以在相同或不同表達載體中克隆。編碼免疫球蛋白鏈的DNA區段可以被可操作連接至確保免疫球蛋白多肽表達的表達載體的控制序列。表達控制序列包括但不限於啟動子(例如，天然結合的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件和轉錄終止序列。在一個實施方案中，表達控制序列是能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的原核啟動子系統。一旦載體被引入適當的宿主，宿主被保持在適合高水平表達核苷酸序列和收集並純化抗體的條件下。表達載體可以是在任何宿主生物體中可複製的，作為附加體或作為宿主染色體 DNA的整合部分。在一個實施方案中，表達載體含有選擇標記(例如，氨苄西林抗性、潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗性)以允許檢測經預期DNA序列轉化的那些細胞。表達載體可用於從任何宿主細胞表達人源化抗⑶20抗體，包括原核宿主細胞(例如大腸桿菌)、酵母宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞和昆蟲宿主細胞。在一個實施方案中，使用大腸桿菌生產人源化抗體。適合這種應用的其他原核宿主包括桿菌，例如芽孢桿菌和其他腸桿菌科，例如沙門氏菌屬、賽氏桿菌屬和各種假單胞桿菌種。在這些原核宿主中，還可以製備表達載體，該表達載體通常含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。此外，將存在任何數目的多種公知啟動子，例如乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自λ噬菌體的啟動子系統。 啟動子通常任選地與操縱子序列一起控制表達，並且具有核糖體結合位點序列等，用於起始和完成轉錄和翻譯。其他微生物例如酵母也用於表達人源化抗體。例如，酵母菌屬可用作酵母宿主，具有含有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列及所需其他序列的適合啟動子。 用於酵母表達技術的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。可誘導的酵母啟動子包括但不限於來自醇脫氫酶、異細胞色素C和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。在另一個實施方案中，哺乳動物組織細胞培養物可用於表達和生產人源化抗⑶20 抗體(例如，編碼免疫球蛋白及其片段的多核苷酸)。任何哺乳動物組織細胞可以用於此類方法，並且本領域已經開發了能夠分泌異源蛋白(例如完整免疫球蛋白)的許多適合的宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞系、優選骨髓瘤細胞系或轉化的B細胞或雜交瘤。在一個實施方案中，細胞是非人的。哺乳動物細胞的表達載體可以包括表達控制序列，例如複製起點、啟動子和增強子，以及必要的加工信息位點，例如核糖體結合位點、 RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。在一個實施方案中，表達控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等的啟動子。含有感興趣的多核苷酸序列(例如重鏈和輕鏈編碼序列和表達控制序列)的載體可以通過公知方法轉移至宿主細胞，所述方法根據細胞宿主類型而改變。例如，氯化鈣轉染常用於原核細胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質轉染、生物彈道術或病毒轉染可以用於其它細胞宿主。用於轉化哺乳動物細胞的其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射。為了生產轉基因動物，轉基因可以被顯微注射入受精卵，或者可以被引入胚胎幹細胞基因組，此類細胞的核被轉移入去核卵母細胞。當編碼人源化重鏈和輕鏈的核酸分子被克隆入單獨表達載體時，該載體可以被共轉染以獲得表達並組裝完整免疫球蛋白。一經表達，完整抗體、其二聚體、個體輕鏈和重鏈、 或抗體的其他免疫球蛋白形式可以根據本領域的標準方法純化，包括硫酸銨沉澱、親和柱、 柱色譜、HPLC純化、凝膠電泳等。至少約90至95%同質性的基本上純的免疫球蛋白可以被製備用於藥物用途。在另一個實施方案中，至少約98至99%或更高同質性的基本上純的人源化抗體可以被生產用於藥物配製和方法。因此，還提供了表達人源化抗⑶20抗體的方法，包括(a)用編碼本文所述人源化抗CD20抗體的核酸分子轉化宿主細胞，和(b)在允許表達人源化抗CD20抗體的條件下培養轉化的宿主細胞。可以使用在載體上包括選擇標記的已知技術，使得表達人源化和嵌合抗體以及所述標記的宿主細胞可以容易被選擇。在生產本文所述人源化抗CD20抗體的一個優選實施方案中，轉化的浮萍植物或浮萍結節培養物用於表達和分泌抗體。用於轉化浮萍和優化編碼抗體的表達盒的核苷酸序列的遺傳技術描述於美國專利第6，815，184號，其完整內容在此通過引用併入本文。糖基化本文描述的抗CD20抗體可以是糖基化的或非糖基化的。當抗CD20抗體被糖基化時，存在的聚糖結構可以根據需要而改變。例如，使用不同的宿主細胞來重組生產人源化抗 CD20抗體將改變抗體的聚糖結構。抗體的聚糖結構可以使用已知技術在宿主細胞系中優化，所述技術RNA幹擾技術、反義技術和敲除技術等。例如，當植物細胞和/或植物被用來生產抗CD20抗體時，可以通過使用抑制α 1，3_巖藻糖基轉移酶和β1，2-木糖基轉移酶(例如，使用RNA幹擾構建體)的方法來改變。此類技術和植物的實例描述於國際公布號WO 2007/084926，其全部內容併入本文。因此，在一個實施方案中，抗CD20抗體可以在植物中製備，使得N-糖基化模式與不使用抑制α 1，3-巖藻糖基轉移酶和β 1，2-木糖基轉移酶表達的方法在植物中生產此類抗體相比具有減少的α 1，3-巖藻糖和β 1，2-木糖。在另一個實施方案中，抗CD20抗體可以具有缺乏巖藻糖和木糖的糖基化模式。在另一實施方案中，抗⑶20抗體可以具有主要是GO聚糖的N-糖基化模式。「GO 聚糖」表示具有結構GlcNAc2Man3GlcNAc2的複合N連接聚糖，如圖21所示，其中GIcNAc是乙醯葡萄糖胺，並且Man甘露糖，並且其中GIcNAC與連接至抗體的胺基酸殘基的核心的1， 3甘露糖臂和1，6甘露糖臂連接。因此，例如，抗⑶20抗體組合物可以具有基本上同質的N 糖基化特徵，其中抗⑶20抗體組合物中N-聚糖的總量的至少80%、至少85%、至少90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少 99%是 GO 聚糖物類。一些免疫球蛋白具有重鏈的Fc區的保守N-連接糖基化。例如，IgG型免疫球蛋白具有在天冬醯胺297具有N-連接寡糖的糖基化的Ch2結構域。與Fc區位置四7的天冬醯胺連接的寡糖中巖藻糖含量降低的抗體可以增強Fc對Fc γ RIII的親和力，這轉而可以提高抗體的ADCC。因此，具有主要是GO的N-糖基化特徵的抗體相對於在不抑制α 1，3_巖藻糖基轉移酶的表達或功能(並因此產生具有更多的^1，3-巖藻糖的抗體)的植物中生產的抗體具有提高的ADCC活性。治療方法
人源化抗⑶20抗體，包括其抗原結合片段，可用於治療具有與⑶20表達細胞例如表達⑶20的正常和惡性B細胞相關的任何疾病或疾患的受試者。因此，人源化抗⑶20抗體用於治療B細胞疾患。「惡性」 B細胞預期任何瘤生成細胞，包括但不限於源自淋巴瘤的B細胞，包括低、 中和高級B細胞淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、Epstein-Barr病毒(EBV)誘導的淋巴瘤和AIDS相關淋巴瘤以及B細胞急性淋巴細胞白血病、骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病等。因此，人源化抗CD20抗體用於治療許多惡性和非惡性疾病，包括自身免疫疾病和相關病症以及CD20陽性癌症，包括B細胞淋巴瘤和白血病。骨髓中的幹細胞(B細胞祖細胞)缺乏⑶20抗原，允許在治療後產生健康B細胞並在數月內恢復至正常水平。可使用抗CD20抗體治療的自身免疫疾病或自身免疫相關病症包括關節炎(類風溼性關節炎、青少年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎)、銀屑病、皮膚炎(例如，特異性皮炎)；慢性自身免疫蕁麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死溶解、全身性硬皮病和硬化症，與炎性腸病(IBD)相關的反應(Crohn病、潰瘍性結腸炎)、呼吸窘迫症候群、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、腦脊膜炎、過敏性鼻炎、腦炎、葡萄膜炎、結腸炎、血管球性腎炎、過敏性病症、溼疹、哮喘、涉及T細胞浸潤和慢性炎症反應的病症、粥樣硬化、自身免疫性心肌炎、白細胞粘附缺陷、全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡(包括腎炎、非腎、盤狀、 脫髮)、青少年型糖尿病、多發性硬化、過敏性腦脊髓炎、由細胞因子和T淋巴細胞介導的與急性和延遲型超敏反應相關的免疫應答、結核病、結節病、肉芽腫病，包括Wegener肉芽腫病、粒細胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障礙性貧血、Coombs陽性貧血、Diamond Blackfan貧血、免疫性溶血性貧血，包括自身免疫溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、單純紅細胞再生障礙(PRCA)、VIII因子缺陷、A型血友病、自身免疫性中性粒細胞減少症、各類血細胞減少症、白血球減少症、涉及白血球滲出的疾病、CNS炎性疾患、多器官損傷症候群、重症肌無力、抗原-抗複合物介導的疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、過敏性神經炎；Reiter疾病、Castleman症候群、Goodpasture症候群、Lambert-Eaton肌無力症候群、！Raynaud症候群Jjdgren症候群、Stevens-Johnson症候群、實體器官移植排斥(包括為高反應性抗體滴度預處理，組織中的IgA沉積，等)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、類天胞瘡、天皰瘡(都包括尋常的、落葉性)、自身免疫性多內分泌腺疾病、Reiter疾病、僵體症候群、Behcet疾病、巨細胞動脈炎、免疫複合物腎炎、IgA腎病、IgM多發性神經病或IgM介導的神經病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、免疫性血小板減少症、睪丸和卵巢的自身免疫疾病，包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發性甲狀腺機能減退；自身免疫性內分泌病，包括自身免疫性甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎(Hashimoto甲狀腺炎)、亞急性甲狀腺炎、特發性甲狀腺機能減退、Addison疾病、Grave疾病、自身免疫性多腺體症候群(或多腺體內分泌失調症候群)、I型糖尿病(還稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM) )、Sheehan症候群、自身免疫性肝炎、淋巴間質性肺炎(HIV)、梗阻性細支氣管炎(非移植)與NSIP、GuiIlain-BarW症候群、大血管炎(包括風溼性多肌病和巨細胞 (Takayasu' s)動脈炎)、中血管炎(包括Kawasaki疾病和結節性多動脈炎)、強直性脊柱炎、Berger病(IgA腎病)、急進型腎小球腎炎、原發性膽汁性肝硬變、口炎性腹瀉(麩質腸病)、冷球蛋白血症、ALS、冠心病。
可使用本文描述的人源化抗⑶20抗體治療的⑶20陽性癌症包括包括在細胞表面表達⑶20的細胞異常增殖的那些。⑶20陽性B細胞腫瘤包括⑶20陽性霍奇金病，包括淋巴細胞主導型霍奇金病(LPHD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞性白血病(ALL)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；和毛細胞性白血病。非霍奇金淋巴瘤包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、中級/濾泡性 NHL、中級彌散性NHL、高級成免疫細胞NHL、高級成淋巴細胞NHL、高級小無裂細胞NHL、腫塊型NHL、漿細胞樣淋巴細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症。還涵蓋這些癌症的復發的治療。在一些實施方案中，人源化抗⑶20抗體可用於治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)、淋巴細胞主導的霍奇金疾病(LPHD)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴細胞性白血病、類風溼性關節炎和青少年類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、Wegener疾病、炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少症、 多發性硬化、銀屑病、IgA腎病、IgM多發性神經病、重症肌無力、血管炎、糖尿病、Raynaud症候群、$0gren症候群和血管球性腎炎。本文描述的人源化抗CD20抗體作為單劑治療用於例如復發或難治的低級或濾泡性⑶20陽性、B細胞NHL，或者可以與其他藥物以多藥物方案組合施用給患者。根據待治療的適應症和本領域醫師熟悉的有關給藥的因素，人源化抗CD20抗體可以有效治療所述適應症同時最小化毒性和副作用的劑量施用。對於治療CD20陽性癌症或自身免疫疾病，治療有效劑量可以是約lOOmg/m2至約600mg/m2，儘管也可以使用更高或更低的劑量。在不同實施方案中，劑量可以是IOOmg/劑、125mg/劑、150mg/劑、175mg/齊U、 200mg/ 劑、225mg/ 劑、250mg/ 劑、275mg/ 劑、300mg，325mg/ 劑、350mg/ 劑、375mg/ 劑、400mg/ 劑、425mg/劑、450mg/劑、475mg/劑、500mg/劑、525mg/劑、550mg/劑、575mg/劑、600mg/劑。 也可以使用其他給藥量、方案和間隔。在治療疾病中，人源化抗⑶20抗體可以長期或間歇地施用給患者，如疾病領域醫師所確定的。在一些實施方案中，患者可以接受最初調理劑量的抗體，隨後是治療劑量以緩解或最小化任何副作用。調理劑量可以低於治療劑量以調理患者以耐受更高劑量。人源化抗⑶20抗體可以使用任何可用的施用途徑來施用，包括通過靜脈內施用 (例如快速濃注或經一段時間的連續輸注)，或者通過皮下、肌肉內、腹膜內、腦脊液內、關節內、滑膜內、鞘內或吸入途徑。在一個實施方案中，人源化抗CD20抗體通過靜脈內輸注與作為輸注媒介物的 0.9%氯化鈉溶液一起施用。在治療上述B細胞瘤時，患者還可以用本文描述的人源化抗CD20抗體結合一種或多種諸如化療劑的治療劑以多藥方案組合治療。人源化抗CD20抗體可以共時、順序或與化療劑交替施用，或者在用其他療法無應答之後施用。淋巴瘤治療的標準化療可以包括環磷醯胺、阿糖胞苷、苯丙氨酸氮芥和米託蒽醌加苯丙氨酸氮芥。在另一個實施方案中，人源化 CD20抗體可以與CHOP組合使用，CHOP是治療非霍奇金淋巴瘤的最常用化療方案之一。以下是在CHOP方案中使用的藥物環磷醯胺(商品名Cytoxan，neosar)；阿黴素(多柔比星 /羥基多柔比星)；長春新鹼(Oncovin)；和強的松龍(有時稱為Deltasone或Orasone)。17/26 頁
在具體實施方案中，人源化抗CD20抗體與下述治療劑的一種或多種組合施用給有相應需要的患者多柔比星、環磷醯胺、長春新鹼和強的松龍。在一個具體實施方案中，罹患淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)的患者可以用本文描述的抗CD20抗體結合CHOP (環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼和強的松龍)療法治療。在另一個實施方案中，癌症患者可以用人源化抗 CD20抗體結合CVP (環磷醯胺、長春新鹼和強的松龍)療法治療。在治療上述自身免疫疾病或自身免疫相關病症時，患者可以用人源化抗CD20抗體結合第二治療劑治療，所述第二治療劑例如免疫抑制劑(例如以多藥方案)。人源化抗 CD20抗體可以共時、順序或與免疫抑制劑交替、或對其他療法無應答之後施用。用於輔助療法的免疫抑制劑包括用於抑制或掩蔽患者免疫系統的任何物質。此類物質包括但不限於抑制細胞因子生成、下調或抑制自身抗原表達、或掩蔽MHC抗原的物質。此類物質的實例包括類固醇，例如糖皮質激素(例如，強的松、甲基強的松龍和地塞米松)；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶、硫唑嘌呤；溴隱亭；戊二醛；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A ；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗幹擾素-Y、- β或-α 抗體；抗腫瘤壞死因子-α抗體；抗腫瘤壞死因子-β抗體；抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；pan-T抗體；含有LFA-3結合結構域的可溶性肽；鏈激酶；TGF-β ；鏈道酶；脫氫精胍菌素；雷帕黴素；T-細胞受體；T-細胞受體片段； 和T細胞受體抗體。對於類風溼性關節炎的治療，患者可以用人源化抗CD20抗體結合以下藥物的任何一種或多種來治療DMARDS (調節疾病的抗風溼藥(例如，氨甲喋呤))、NSAI或NSAID (非甾類抗炎藥)、HUMIRA (阿達木單抗；Abbott Laboratories)、ARAVA (來氟米特)、 REMICADE (英夫利息單抗；Centocor Inc.，Malvern，Pa.)、ENBREL (依那西普；Immunex， Wash.)和C0X-2抑制劑。MM人源化抗CD20抗體的治療性製劑可以通過將具有所需純度的抗體與任選藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合來製備以貯存或使用，以凍幹製劑或水溶液的形式。 可接受的載體、賦形劑或穩定劑在採用的劑量和濃度下對受體是非毒性的，並且包括緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、氯化苄乙銨；苯酚、丁基或苄基醇；烷基對羥基苯甲酸酯，例如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇； 3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(小於約10殘基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、 組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ；糖，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡合物 (例如，Zn-蛋白絡合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。本文製劑還可以含有超過一種待治療的特定適應症所必要的活性化合物。例如， 可能希望進一步提供細胞毒性劑、化療劑、細胞因子或免疫抑制劑。此類其他物質的有效量取決於製劑中存在的抗體的量、疾病或疾患的類型或治療、以及上文討論的其他因素。活性成分還可以還可以包埋於例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠囊中，例如，分別在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳化液、納米離子和納米膠囊)或大乳化液中的羥基甲基纖維素或明膠大膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)大膠囊。還可以製備包含人源化抗⑶20抗體的持續釋放製劑。持續釋放製劑適合的實例包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物的半製備基質，所述基質是有形物品形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的實例包括但不限於聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-穀氨酸和L-穀氨酸乙酯的共聚物、不可降解的醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥乙酸共聚物和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。軛合的抗體和其他方法人源化抗CD20抗體可以與一種或多種治療劑或診斷劑軛合。本文描述的人源化抗體可用於治療方法和診斷方法。因此，人源化抗體可以作為裸抗體單獨施用或者作為多模式療法施用，臨時根據給藥方案，但不一定與治療劑軛合。在一個實施方案中，裸人源化和嵌合抗體的效力可以通過為裸抗體補充一種或多種其他裸抗體即對特定抗原的單克隆抗體而被增強，所述抗原例如⑶4、⑶5、⑶8、⑶14、⑶15、⑶19、 CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、 B7、MUCl、la、HMl. 24或HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、致癌基因、致癌基因產物、或其與以下的組合一種或多種抗CD20免疫軛合物或與治療劑軛合的這些所述抗原的抗體，所述治療劑包括藥物、毒素、免疫調節劑、激素、治療性放射性核素等，一種或多種治療劑，包括藥物、寡核苷酸、毒素、免疫調節劑、激素、治療性放射性核素等，共時或順序或根據預定給藥方案與人源化抗體一起施用。免疫軛合物可以為診斷和治療性用途在B細胞淋巴瘤、自身免疫疾病、移植排斥和其他疾病或疾患中施用。因此，人源化抗CD20抗體可以與細胞毒性劑軛合，所述細胞毒性劑例如毒素或放射性同位素。在一些實施方案中，毒素是加利車黴素、美登醇、多拉斯他汀、auristatin E及其類似物或衍生物。許多診斷劑和治療劑可以與人源化抗⑶20抗體軛合。此類治療劑還可用於與上述裸抗體單獨施用。治療劑包括例如化療劑，例如長春花生物鹼、蒽環類、 印idophyllotoxin、紫杉烷、抗代謝物、烷化劑、扛激酶劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑和凋亡劑，特別是阿黴素、氨甲喋呤、紫杉酚、CPT-11、camptothecans和來自這些和其他類別抗癌劑的其他等。用於製備免疫軛合物和抗體融合蛋白的其他有用的癌症化療藥物包括氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉬配位絡合物、激素等。用於與人源化抗體軛合的其他毒素包括任何藥學上可接受的毒素，並且包括但不限於DNA破壞劑、微管聚合或解聚抑制劑和抗代謝藥。細胞毒性劑的類別包括例如酶抑制劑，例如二氫葉酸還原酶抑制劑和胸苷酸合酶抑制劑、DNA插入劑、DNA切割劑、拓撲異構酶抑制劑、蒽環類家族藥物、長春花葯物、絲裂黴素、博來黴素和細胞毒性核苷、蝶啶家族藥物、diynenes、鬼白毒素和分化誘導劑。人源化抗CD20抗體還可以與放射性同位素軛合。例如，為了選擇性破壞腫瘤，抗體可以包含高放射性原子。許多放射性同位素可用於生產放射性軛合的抗CD20抗體。當軛合物被用於診斷時，它可以包含用於閃爍研究的放射性原子，或者用於核磁共振(NMR)成像的自旋標記。
標記可以使用任何方法加入軛合物中。例如，肽可以被生物合成，或者可以通過化學胺基酸合成來合成，使用適合的胺基酸前體，包括例如氟-19取代氫。寡核苷酸例如反義分子也可以軛合至人源化抗CD20抗體，或者與人源化抗CD20 抗體一起施用。以下實施例作為示例說明而非限制被提供。 實施例實施例1 人源化1F5抗體的製備 嵌合表達載體使用小鼠抗體1F5的重鏈和輕鏈序列製備(Press等人Blood， 69(2) :584-591(1987))。Genbank 訪問號 AY058906 提供了 1F5VK 的序列，小鼠抗體 1F5 的輕鏈。該VK使用AJ231219種系V基因，其DNA序列98%相同。GenBank AY058907訪問號是1F5VH的序列，小鼠抗體1F5的重鏈。該VH使用AC090843種系V基因，其DNA序列95% 相同。嵌合表達載體的構建包括向小鼠VH和VK添加適合的前導序列，之前是HindIII 限制位點和Kozak序列。Kozak序列確保了可變區序列的有效翻譯。它定義了核糖體可以從其起始翻譯的正確的AUG密碼子。Kozak序列中重要的鹼基是AUG起點上遊位置-3的腺嘌呤。當與1F5VK連續時，預測人1210VK前導序列由信號蛋白酶正確切割。當與1F5VK連續時，預測人1210VK前導序列由信號蛋白酶正確切割。適當的1210前導序列因此在1F5VH 和VK編碼區的上遊(5')被克隆。嵌合表達載體的構建還包括將人Y 1恆定區的5'片段引入天然ApaI限制位點， 與1F5的J區的3'端連續。人Yl恆定區在表達載體中編碼，在插入的VH序列的下遊，但不同於κ構建體，它缺乏V-C內含子。對於κ鏈，天然剪接供體位點和BamHI位點添加在 V區下遊。剪接供體序列促進從KV-C內含子剪接出，這用於框內連接VK至κ恆定區。分析小鼠1F5VH和VK基因以鑑定可以幹擾亞克隆的任何額外限制位點。一個限制位點存在於優化前的1F5VK序列(圖17)，但是在1F5VH序列中沒有被鑑定出來 (圖19)。這些DNA序列被優化表達，通過去除內部TATA盒、chi-位點和核糖體進入位點、AT富集或GC富集序列區段；ARE、INS、CRS序列元件；重複序列和RNA 二級結構；(隱藏的)剪接供體和受體位點、分支點；通過使密碼子使用適應中國倉鼠/人的密碼子偏倚；並且通過增加GC含量以改善mRNA穩定性。優化的C1F5VK(圖18)和clF5VH(圖 20) DNA構建體序列被合成並克隆入克隆載體pGA4 (Geneart AG, Regensburg，Germany)。 VK和VH插入子分別用(BamHI+Hindlll)或(Hindlll+Apal)切除。切除的片段然後被凝膠純化，分別連接入pKNIOO或PG1D200，其已經被類似地切割，並且經磷酸酶消化。連接的構建體被轉化成感受態TOPlO細菌。通過PCR篩選表達克隆菌落中正確大小的插入子的存在，使用引物 gl0545(5' -TGTTCCTTTCCATGGGTCTT) (SEQ ID NO 75)禾口 g23070(5' -GTGTGCACGCCGCTGGTC) (SEQ ID NO 76)。Minipr印s 產生正確表達克隆並用於轉化HEK293T細胞。圖22顯示具有加下劃線的恆定區的成熟嵌合1F5抗體的重鏈的胺基酸序列。圖 23顯示具有加下劃線的恆定區的成熟嵌合1F5抗體的輕鏈的胺基酸序列。鼠單克隆抗體1F5的嵌合重鏈和輕鏈然後被人源化，通過與人和小鼠免疫球蛋白的序列比較鑑定適當的人FR序列。來自hternational Immunogenetics資料庫 2006(Lefranc, M. P.，Nucl. Acids Res. ,31 :307-310(2003))和 Kabat 資料庫(Kabat, Ε. A.，等人，NIH National Technical Information Service, 1-3242 (1991)) Release 5 of Sequences of Proteins of Immunological Interest ( MffMf 17—Nov—1999)的入禾口/]、 鼠免疫球蛋白的蛋白序列被用於彙編Kabat比對中的免疫球蛋白序列資料庫。該資料庫含有9322人VH和2689人VK序列。序列分析程序Gibbs用於詢問具有1F5VH和VK蛋白序列的人VH和VK資料庫。1F5RHA 和 1F5RHB 的產生為了產牛人源化VH序列，在資料庫中鑑定在位於V區構架內的遊標、ιΗ則和VH-VK ^^(VCI)殘基與1F5VH具有最高同一性的人VH序列。所鑑定的VH序列中，訪問號 U00570被選擇作為1F5RHA的人FR供體。與U00570最相同的人種系V基因是VHI家族基因)(62109 (VHB)，從其提取信號肽。SignalP算法預測，它將用信號肽酶適當切割。圖IA 顯示了用於從X62109信號、1F5VH CDR和U00570FR產生天然DNA序列的DNA序列lF5RHAss 的序列。來自1F5VH的⑶Rl、2和3被移植入U00570的受體FR，以產生1F5RHA(圖1B)。 DNA序列通過沉默誘變(GeneArt)被優化，以去除內部TATA框、chi位點和核糖體進入位點、AT富集或GC富集的序列區段、ARE、INS、CRS序列元件、重複序列和RNA 二級結構(隱藏的)剪接供體和受體位點和分支點。優化的1F5RHA構建體DNA和蛋白序列顯示於圖2。 該構建體在構架區中不含突變。第二構建體1F5RHB(圖3)是基於1F5RHA序列，以含有如下四個非保守遊標殘基的回覆突變:V67A ；V69L ；R71A 和 T73K(Kabat 編號)(圖 10A)。1F5RKA11 禾Π 1F5RKA12 的產生人源化VK序列基於與人VK序列的序列比較來產生，在位於V區構架內的VCI殘基的1F5VK具有最高同一性。根據序列比較，沒有鑑定出具有與1F5VK相同長度(10個胺基酸)的CDRl的人VK基因。然後分析具有最接近的CDRl長度(11和12個胺基酸)的人 FR的兩個基團，其與1F5VK具有相同長度的⑶R2和3。對於11個胺基酸CDRl序列，訪問號ΑΒ064140被選擇作為1F5RKA11基礎的FW供體。圖4Α顯示了從1F5VK的天然DNA序列、人VK序列ΑΒ064140和人Ζ00013信號序列產生1F5RKA11ss。該序列還被優化以產生1F5RKA11構建體(圖5)，其不含FR突變。圖4Β 提供了用於產生1F5RKA11的FR和⑶R的胺基酸序列。來自1F5VK的CDRl、2和3被移植入人ΑΒ064140的受體FR以產生1F5RKA11。 ΑΒ064140的最近的種系V基因是Z00013(Vd/L8)，從中獲得信號肽。SignalP算法預測了該信號肽的適合的切割。第二構建體1F5RKB11 (圖6)通過在以下三個非保守遊標殘基和VH/VK界面殘基 Y87F (Kabat編號)引入四個回復突變而從1F5RKA11產生L46P ；L47W和F71Y (Kabat編號) (圖 10B)。其他形式1F5RKB11 ； 1F5RKD11 ； 1F5RKE11 和 1F5RKF11 基於 1F5RKB11，每種含有這4個突變之一的不同逆轉(圖10B)。第二組人源化VK序列也基於人κ序列來製備，具有含有12個胺基酸的⑶Rl序列。訪問號AY^3415被選作1F5RKA12基礎的FR供體。圖7A顯示用於從1F5VK的天然DNA序列產生lF5RKA12ss、人VK序列和人X12686信號序列的核酸序列。來自1F5VK的CDR1、2和3被移植入人AY263415的受體FR以產生1F5RKA12(圖7B)。訪問號AY263415的最近種系V基因是VKIII家族成員 X12686(A27)，從其獲得信號肽。SignalP算法預測該信號肽的切割。優化的1F5RKA12構建體DNA和蛋白序列顯示於圖8。該構建體不含FR突變。第二構建體1F5RKB12 (圖9)通過在三個非保守遊標殘基引入三個回復突變而從1F5RKA12產生L46P ；L47W和F71Y(Kabat 編號)。其他形式1F5RKC12 ； 1F5RKD12和1F5RKE12基於1F5RKB12，每種含有這3個突變之一的不同逆轉。製備了表達載體，該表達載體對於重鏈包括與可變區連接的人Y 1恆定區，對於輕鏈包括與可變區連接的κ恆定區。 圖 IlA-E 分別提供了來自 1F5RKG11、1F5RKB11、1F5RKF12、1F5RKB12 和 1F5RHA 蛋白的成熟可變區和恆定區的胺基酸序列。圖22和23分別提供了 C1F5VH和clF5VK的成熟可變區和恆定區的嵌合蛋白序列的胺基酸序列。胺基酸序列的恆定區加下劃線。編碼(人源化或嵌合)重鏈和輕鏈的表達質粒製品被用於轉染HEK293t細胞。對於轉染，細胞最初在燒瓶中生長在DMEM加補充了 10% FCS、青黴素和鏈黴素的GlutaMax 中，並在充入CO2氣體的細胞培養室中孵育。細胞培養物每兩天分割1 3或者每3-4天分割1 4或1 5。使用輕微胰蛋白酶消化使細胞在傳代期間從燒瓶分離。轉染前一天，通過向每個孔添加2ml培養基來準備6孔板，隨後添加細胞(2xl05細胞/孔)。在第二天檢查細胞以確保至少80%匯合，並以2ml/孔更換培養基。對於轉染，96 μ 1 OPtiPROSFM被分成小份進入無菌1.5ml管，直接向培養基中添加6μ1 Fugene 6，並在室溫孵育5分鐘。添加DNA (總計1 μ g ;0. 5 μ g重鏈和0. 5 μ g輕鏈載體)，並在室溫下孵育15分鐘。圍繞孔逐滴添加Fugene 6、DNA和OptiProSFM混合物的混合物，然後將板在細胞培養孵育器中孵育 4天。4天後收穫條件培養基，定量IgG，並進行抗原結合測定。這些條件培養基中IgG通過ELISA測量以測量Raji細胞結合(實施例2)。使用的所有轉染的293細胞條件培養基中IgGl κ抗體的濃度示於表1。人源化和嵌合抗體被良好表達至優良水平，並用於以下進一步的實施例2-4。表權利要求
1. 一種人源化抗體，包括(a)輕鏈，包括包含選自由以下組成的組的胺基酸序列的輕鏈可變區(1)Glulie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln TrpSer Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEQ ID NO :1)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；Xaa7ci 是 Tyr 或 Phe ；並且Xaa86 是 Tyr 或 Phe ；和(2)Glulie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlaSer Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr LeuThr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp SerSer Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEQ ID NO :2)其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46是Trp或Leu ；並且Xaa7tl 是 Tyr 或 Phe ；和(b)重鏈，包括包含以下胺基酸序列的重鏈可變區GlnValGlnLeuVal GlnSerGlyAla Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser ValLysValSerCysLysAlaSer GlyTyrThrPhe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp ValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeu GluTrplieGly Ala lie Tyr Pro Gly Asn GlyAsp ThrSerTyrAsnGlnLysPheLys GlyArgXaa6^^ Thr Xaa70 Thr Xaa72 AspXaa74 Ser Ala AsnThrAlaTyrMetGluLeuSer SerLeuLysSer Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys AlaArgSerHisTyrGlySerAsn TyrValAspTyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr LeuValThrValSerSer(SEQID NO 3)其中Xaa68 是 Val 或 Ala ；Xaa70 是 Val 或 Leu ；Xaa72是Arg或Ala ；並且Xaa74 是 Thr 或 Lys ；其中所述人源化抗體結合人CD-20。
2.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述重鏈可變區包括SEQ ID NO 13的胺基酸序列。
3.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括SEQID NO 54的胺基酸序列。
4.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括SEQID NO 49的胺基酸序列。
5.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括SEQID NO 59的胺基酸序列。
6.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括SEQID NO 55的胺基酸序列。
7.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述重鏈可變區包括SEQID NO 13的胺基酸序列，並且所述輕鏈可變區包括選自由SEQ ID N0:49、M、55和59組成的組的胺基酸序列。
8.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述重鏈可變區包括選自由SEQID NO 13和 48組成的組的胺基酸序列。
9.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括選自由SEQID NO =28,49, 50、51、52、53、54、42、55、56、57、58和59組成的組的胺基酸序列。
10.權利要求8所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括選自由SEQID NO :28、 49、50、51、52、53、54、42、55、56、57、58 和 59 組成的組的胺基酸序列。
11.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述抗體以類似於嵌合抗體clF5的親和力結合人CD20。
12.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述抗體以大於嵌合抗體clF5的親和力結合人 CD20。
13.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述抗體以小於嵌合抗體clF5的解離速率結合人CD20。
14.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述輕鏈還包括人輕鏈恆定區。
15.權利要求14所述的人源化抗體，其中所述輕鏈包括選自由SEQID NO :60、61、62和 63組成的組的胺基酸序列。
16.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述重鏈還包括人重鏈恆定區。
17.權利要求16所述的人源化抗體，其中所述重鏈包括SEQID NO :64的胺基酸序列。
18.權利要求14所述的人源化抗體，其中所述重鏈還包括人重鏈恆定區。
19.權利要求18所述的人源化抗體，其中所述重鏈包括SEQID NO :64的胺基酸序列， 並且所述輕鏈包括選自由SEQ ID N0:60、61、62和63組成的組的胺基酸序列。
20.權利要求19所述的人源化抗體，其中所述重鏈包括SEQID NO 64的胺基酸序列， 並且所述輕鏈包括SEQ ID NO 60的胺基酸序列。
21.權利要求19所述的人源化抗體，其中所述重鏈包括SEQID NO :64的胺基酸序列， 並且所述輕鏈包括SEQ ID NO 61的胺基酸序列。
22.權利要求19所述的人源化抗體，其中所述重鏈包括SEQID NO :64的胺基酸序列， 並且所述輕鏈包括SEQ ID NO 62的胺基酸序列。
23.權利要求19所述的人源化抗體，其中所述重鏈包括SEQID NO :64的胺基酸序列， 並且所述輕鏈包括SEQ ID NO :63的胺基酸序列。
24.一種藥物組合物，包括前述權利要求任一項所述的人源化抗體和藥學上可接受的賦形劑。
25.一種藥物組合物，包括權利要求7所述的人源化抗體和藥學上可接受的賦形劑。
26.權利要求1所述的人源化抗體，其中所述抗體在選自由哺乳動物細胞、酵母細胞和植物細胞組成的組的宿主細胞中產生。
27.一種人源化抗體，包括輕鏈，所述輕鏈包括包含以下胺基酸序列的輕鏈可變區 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ArgValThr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala SerGly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu ThrIle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Trp SerSer Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEQ ID NO :1) 其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ；Xaa46 是 Trp 或 Leu ；Xaa7tl 是 Tyr 或 Phe ；並且Xaa86 是 Tyr 或 Phe ；其中所述人源化抗體結合人CD-20。
28.權利要求27所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區具有SEQID NO :54的胺基酸序列。
29.權利要求27所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區具有SEQID NO :49的胺基酸序列。
30.權利要求27所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括選自由SEQID NO :28、 49、50、51、52、53和M組成的組的胺基酸序列。
31.權利要求27所述的人源化抗體，其中所述抗體以類似於嵌合抗體clF5的親和力結合人CD20。
32.權利要求27所述的人源化抗體，其中所述抗體以大於嵌合抗體clF5的親和力結合人 CD20。
33.權利要求27所述的人源化抗體，其中所述抗體以小於嵌合抗體clF5的解離速率結合人CD20。
34.一種人源化抗體，包括輕鏈，所述輕鏈包括包含以下胺基酸序列的輕鏈可變區 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu ArgAlaThr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala SerGly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu ThrIle Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser SerAsn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEQ ID NO :2) 其中Xaa45 是 Pro 或 Leu ； Xaa46是Trp或Leu ；並且Xaa70 是 Tyr 或 Phe ；其中所述人源化抗體結合人CD-20。
35.權利要求34所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括SEQID NO :59的胺基酸序列。
36.權利要求34所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括SEQID NO :55的胺基酸序列。
37.權利要求34所述的人源化抗體，其中所述輕鏈可變區包括選自由SEQID NO :42、 55、56、57、58和59組成的組的胺基酸序列。
38.權利要求34所述的人源化抗體，其中所述抗體以類似於嵌合抗體clF5的親和力結合人CD20。
39.權利要求34所述的人源化抗體，其中所述抗體以大於嵌合抗體clF5的親和力結合人 CD20。
40.權利要求34所述的人源化抗體，其中所述抗體以小於嵌合抗體clF5的解離速率結合人CD20。
41.一種人源化抗體，包括重鏈，所述重鏈包括包含以下胺基酸序列的重鏈可變區 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser ValLysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn GlyAsp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 AspXaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO :3) 其中Xaa68 是 Val 或 Ala ；Xaa70 是 Val 或 Leu ；Xaa72是Arg或Ala ；並且Xaa74 是 Thr 或 Lys ；其中所述人源化抗體能夠結合人CD-20。
42.權利要求41所述的人源化抗體，其中所述抗體以類似於嵌合抗體clF5的親和力結合人CD20。
43.權利要求41所述的人源化抗體，其中所述抗體以大於嵌合抗體clF5的親和力結合人 CD20。
44.權利要求41所述的人源化抗體，其中所述抗體以小於嵌合抗體clF5的解離速率結合人CD20。
45.權利要求41所述的人源化抗體，其中所述重鏈可變區包括SEQID N0:13的胺基酸序列。
46.權利要求41所述的人源化抗體，其中所述重鏈可變區包括SEQID NO :48的胺基酸序列。
47.一種治療受試者的B細胞疾患的方法，包括給有相應需要的受試者施用治療有效量的權利要求1、27、34或41所述的抗體。
48.一種預防受試者的B細胞疾患的方法，包括給受試者施用預防有效量的權利要求 1、27、34或41所述的抗體。
49.一種人源化抗⑶20抗體組合物，包括權利要求1、27、34或41所述的人源化抗體， 其中所述組合物中存在的N-聚糖的至少90%是GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO)。
50.一種分離的核酸，包括編碼權利要求1、27、34或41所述抗體的核酸序列。
51.一種宿主細胞，包括權利要求50所述的分離的核酸。
全文摘要
提供了可用於治療與CD20表達細胞相關的疾病和病症的人源化抗CD20抗體。還提供了編碼此類抗體的核酸、製備此類抗體的方法和包含此類抗體的組合物。
文檔編號C12P21/06GK102439163SQ201080016449
公開日2012年5月2日 申請日期2010年2月16日 優先權日2009年2月16日
發明者D·G·威廉斯 申請人:拜奧雷克斯治療公司