一種製備天然18-α甘草酸的方法

2023-06-19 18:07:31 4

專利名稱：一種製備天然18-α甘草酸的方法
技術領域：
本發明公開了一種用於肝病治療的天然18-α甘草酸的製備方法，屬於醫藥領域 範疇。
背景技術：
甘草為豆科植物甘草Glycyrrhizauralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza in flataBat.、或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根和根莖，主產於內蒙古、新疆、甘肅等 地。甘草入藥已有悠久歷史，《神農本草經》就將其列為藥之上乘，古代醫學家尊稱其為「國 老」。由於其資源珍貴，被國家列入國家二級保護野生藥材。甘草化學成分種類較多，主要 含三萜皂苷類、黃酮類、生物鹼、多糖等成分。以甘草入藥開發的製劑很多，臨床上得到了較 廣泛的應用，主要用於肝病、呼吸道疾病、胃病等方面的治療。甘草酸(C42H62O16)屬於甘草中三萜皂苷類成分，也是甘草中起保肝、抗炎作用的主 要成分。以甘草酸為中間體開發出的藥用原料及製劑很多，臨床主要用於肝炎的治療，如甘 草酸單銨鹽、甘草酸二鉀鹽、異甘草酸鎂等。由於甘草酸分子結構的18位碳原子是一個手 性碳，因此甘草酸具有一對同分異構體，即18-α甘草酸和18-β甘草酸。構象研究表明， 由於空間位阻效應，18-α甘草酸在溶解性、旋光度等理化性質以及藥理活性等許多方面與 18-β甘草酸都具有很大的差別。在臨床使用上，以兩種甘草酸異構體分為主要成分的製劑 都具有廣泛應用，如複方甘草酸苷片是以18-β甘草酸單銨鹽為主要活性成分，而異甘草 酸鎂注射液是以18-α甘草酸單鎂鹽為主要成分。因此，通過深入研究，明確18-α甘草酸 和18-β甘草酸不同作用特點，具有很好的現實意義。根據文獻報導，在天然甘草藥材中，甘草酸以18-α甘草酸和18-β甘草酸兩種 構型同時存在，在《RP-HPLC法測定甘草中甘草酸差向異構體的含量》(瀋陽藥科大學學報， 2008，11期)介紹了測定甘草酸中兩種異構體含量的方法。本專利發明人通過研究也證 明，天然甘草中同時存在兩種構型的甘草酸，其中18-α甘草酸的含量較低。由於二者結構 相似，分離難度大，而且在不同產地、不同來源的甘草中含量差異較大，因此，很難從天然甘 草中製備18-α甘草酸。目前市場上應用較廣泛的異甘草酸鎂是18-α甘草酸鎂鹽，其制 備方法是通過將甘草酸銨鹽在強鹼溶液中經過異構化反應製備得到的，屬於非天然產物範 疇，與本發明所述的製備方法有本質的差異。在其他公開和發表文獻或專利中，尚未見從甘 草藥材中分離製備天然18-α甘草酸的報導。

發明內容
本發明的目的是從資源綜合開發利用的角度出發，提供了一種從天然甘草藥材中 分離製備得到的天然18-α甘草酸。本發明還提供了一種從天然甘草藥材中分離製備得到天然18-α甘草酸的製備 方法。本發明的另一目的在於提供一種含有一定比例的18-α甘草酸藥物組合物的製備方法，臨床用於肝病的治療。本發明的優勢在於製備天然18-α甘草酸採用的是現代中藥分離純化技術，提高 了中藥材資源的利用率。本發明的優勢還在於在採用分離純化技術製備天然18-α甘草酸的過程中，由於 沒有進行化學反應，減少了帶入反應副產物和雜質的風險，進一步提高了產品的安全性。根據本發明的比較優選的實施方案，從甘草中分離純化天然18-α甘草酸的製備 方法包括如下步驟(1)取甘草藥材，粉碎成粗粉，加入適量一定濃度的氨水浸泡提取一定時間，將其 中的甘草酸類成分充分轉化成甘草酸銨鹽，過濾，藥渣再加一定濃度的氨水浸泡提取數次， 合併提取液，減壓濃縮至一定體積，靜置，放置至室溫，過濾，得濃縮液。(2)取濃縮液，在攪拌狀態下向濃縮液中緩緩加入一定濃度的酸溶液適量，調節溶 液至一定的PH值，放冷，進行酸沉，使18-β甘草酸充分沉澱，離心過濾，分別得到以18-β 甘草酸為主要成分的固體物和以18-α甘草酸為主要成分的濾液。(3)取濾液，過一定型號的大孔吸附樹脂柱，薄層監測，上柱完成後，加水充分洗脫 去除無機鹽及其他大極性雜質後，改用一定濃度的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至 稠膏。(4)取稠膏，加入含有一定比例有機溶劑的水溶液適量，溶解，低溫靜置結晶，過 濾，即得天然18-α甘草酸粗品。(5)取18-α甘草酸粗品，加入含有一定比例有機溶劑的水溶液適量，溶解，低溫 靜置結晶，過濾，即得天然18-α甘草酸純品。上述步驟(1)中所述的「一定濃度的氨水」是指濃度為0. 2% 5%的氨水溶液， 優選濃度為0. 5% 2%，最佳濃度為0. 8%;每次浸泡提取時間為3 12小時，優選為6小 時；浸泡提取次數為1 3次，優選為2次。上述步驟⑵中所述的「一定濃度的酸溶液」是指含有一定比例的有機酸或無機 酸的水溶液，所用的酸可以是硫酸、鹽酸、磷酸、乙酸、甲酸和草酸中的一種或幾種的組合， 優選為鹽酸和草酸；酸溶液的濃度為0. 2%，優選為0. 5% ；調節溶液的PH值範圍為 ΡΗ2. 5 5. 0，優選為ΡΗ3. 0 4. 0，最佳PH點為3. 6 ；酸沉的適宜溫度為2°C 20°C，優選 為5°C 15°C，最佳溫度為6°C 8°C。上述步驟(3)中所用的大孔樹脂型號可為HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、 HPD-600，或D101、XDA-8。通過正交試驗優選，綜合上樣量、吸附率、解吸速度等各方面因 素，優選樹脂型號為HPD-600大孔樹脂。上柱完成後，用水洗淨雜質，然後使用乙醇洗脫，通 過對洗脫率、樣品得率、樣品含量的綜合篩選，洗脫乙醇的濃度為70% 95%，最佳濃度為 80%。根據本發明優選的技術方案，將事先處理好的大孔樹脂裝柱，對所用層析柱的規格和 材質無特殊要求，可根據實際生產的需要選定，並按常規操作方法裝填，裝柱量不少於柱高 的2/3，最好選用直徑與柱高比在1 5-1 6的柱。乙醇的洗脫速度優選為1000-1500毫 升/分鐘。上述步驟(4)中所用的有機溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、異丙醚、冰醋 酸中的一種或幾種的組合，優選為異丙醇；結晶適宜溫度為-10°C 20°C，優選為-8°c 10°C，最佳溫度為-4°C。
上述步驟(5)中所用的有機溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、甲酸、冰醋酸中 的一種或幾種的組合，優選為甲醇；結晶適宜溫度為-10°c 20°C，優選為-5°c 10°C，最 佳溫度為2°C 5°C。根據本發明的技術方案，可在製得的天然18-α甘草酸中加入適當的輔料製成一 定形式的藥物製劑，包括片劑、膠囊、滴丸、軟膠囊或注射液。本發明通過科學可行的方法從甘草中經提取、分離、純化、結晶等一系列步驟，特 別是運用18-α甘草酸和18-β甘草酸在一定PH條件下溶解度不同的原理使二者達到有 效分離的這一關鍵步驟，製得的天然18-α甘草酸含量大於90%。本發明運用現代中藥分離純化技術，提供了一種含量高、成分明確、質量可控的天 然18-α甘草酸及其製備方法，與傳統化學轉化的製備工藝相比，具有資源利用率高、生產 成本低、無反應副產物產生等優點。本發明的製備工藝已經通過多批生產驗證，證明其重複 性、穩定性都好，適合工業化生產，易於推廣，具有很強的實用性。以下通過本發明提供的天然18-α甘草酸的藥理研究來進一步說明發明的實用 性1、天然18- α甘草酸對D-半乳糖胺鹽酸鹽致大鼠急性肝損傷的影響1.1試驗目的探討天然18- α甘草酸對D-半乳糖胺鹽酸鹽致大鼠急性肝損傷的影響。1. 2試驗材料SD大鼠，雌雄各半，160_220g ；天然18_α甘草酸，白色結晶性粉末，江蘇天晟藥業 有限公司提供，批號20100326。臨用時稱取適量用蒸餾水配成所需濃度。主要試劑D_半乳糖胺鹽酸鹽(D-GalN) ；ALT及AST試劑盒。1.3方法與結果大鼠40隻，隨機分成4組，每組10隻。均自由取食，自由飲水，給藥組分別每日灌 胃給予天然18-α甘草酸10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg，連續七天；於末次給藥後1小時腹腔 注射10% D-GalN生理鹽水溶液0. 5ml/100g體重(500mg/kg)，48小時後，採血收集血清，用 於ALT、AST的測定；肝臟用10%福馬林液固定，石蠟包埋切片，HE染色，用於組織病理學 檢查。根據每種病變程度，記為「_」、「 + 」、「++」、「+++」，分別換算成0、1、2、3分，計算每組的 平均積分值。ALT、AST的測定按試劑盒說明書進行。結果表明，對照組血清ALT、AST水平明顯升高，而天然18_α甘草酸中、高劑量組 對血清ALT、AST均有顯著的降低作用。組織病理學檢查結果表明，模型組小鼠肝細胞有明 顯壞死，匯管區有炎細胞浸潤，而天然18-α甘草酸各劑量組使肝細胞壞死明顯減輕，炎細 胞浸潤明顯減少。提示，天然18-α甘草酸對D-GalN誘導的大鼠急性肝損傷模型有明顯的 保護作用。
具體實施例方式以下實施例中所用甘草藥材來源於新疆喀什，含量測定用甘草酸對照品由江蘇天 晟藥業有限公司提供，生產中所用水為純化水，其他試劑為分析純，所用輔料為藥用級。以下實施內容是為了對權利要求的技術特徵給予說明，並進一步說明本發明的實 用性，不應理解為對本發明的藥材來源或對本發明權利要求的限制。
實施例一取甘草50kg，粉碎成粗粉，加入濃度為0. 5%的氨水400L浸泡提取2次，每次浸泡 8小時，合併提取液，過濾，濾液於70°C減壓濃縮至50L，靜置，放置至室溫，過濾，得濃縮液。取濃縮液，在攪拌狀態下向濃縮液中緩緩加入1 %的鹽酸溶液適量，調節溶液至 PH4. 0，放冷，離心過濾，取濾液，過型號為XDA-8大孔吸附樹脂柱，上柱完成後，加水200L充 分洗脫後，改用70%的乙醇100L洗脫，收集乙醇洗脫液，60°C減壓濃縮至稠膏。取稠膏，加入20%的甲醇-水溶液5000ml溶解，於5°C下靜置結晶，過濾，得天然 18-α甘草酸粗品650g。取上述18-α甘草酸粗品，加入50%甲醇-水溶液2600ml，加熱溶解，於_5°C下靜 置結晶，過濾，即得天然18-α甘草酸370g(本品經高效液相色譜法檢測，含量為97.2%，紫 外最大吸收波長為252. Onm)。實施例二取甘草100kg，粉碎成粗粉，加入濃度為0. 2 %的氨水1000L浸泡提取2次，每次浸 泡6小時，合併提取液，過濾，濾液於70°C減壓濃縮至80L，靜置，放置至室溫，過濾，得濃縮 液。取濃縮液，在攪拌狀態下向濃縮液中緩緩加入0. 4%的草酸溶液適量，調節溶液至 PH3. 6，放冷，離心過濾，取濾液，過型號為HPD-600大孔吸附樹脂柱，上柱完成後，加水500L 充分洗脫後，改用75%的乙醇400L洗脫，收集乙醇洗脫液，65°C減壓濃縮至稠膏。取稠膏，加入35%的異丙醇-水溶液8000ml溶解，於2°C下靜置結晶，過濾，得天 然18-α甘草酸粗品950g。取上述18-α甘草酸粗品，加入50 %丙酮-水溶液2600ml，加熱溶解，於_4°C下靜 置結晶，過濾，即得天然18-α甘草酸470g(本品經高效液相色譜法檢測，含量為99. 1%，紫 外最大吸收波長為252. Onm)。實施例三取甘草100kg，粉碎成粗粉，加入濃度為2 %的氨水600L浸泡提取3次，每次浸泡 12小時，合併提取液，過濾，濾液於75°C減壓濃縮至120L，靜置，放置至室溫，過濾，得濃縮液。取濃縮液，在攪拌狀態下向濃縮液中緩緩加入0. 4%的甲酸溶液適量，調節溶液至 PH3. 0，放冷，離心過濾，取濾液，過型號為HPD-100大孔吸附樹脂柱，上柱完成後，加水400L 充分洗脫後，改用80%的乙醇500L洗脫，收集乙醇洗脫液，65°C減壓濃縮至稠膏。取稠膏，加入35%的乙醇-水溶液6000ml溶解，於4°C下靜置結晶，過濾，得天然 18-α甘草酸粗品llOOg。取上述18-α甘草酸粗品，加入40%乙醇-水溶液2200ml，加熱溶解，於_5°C下靜 置結晶，過濾，即得天然18-α甘草酸660g(本品經高效液相色譜法檢測，含量為92. 1%，紫 外最大吸收波長為252. 2nm)。實施例四取甘草50kg，粉碎成粗粉，加入濃度為1 %的氨水500L浸泡提取2次，每次浸泡9 小時，合併提取液，過濾，濾液於75°C減壓濃縮至60L，靜置，放置至室溫，過濾，得濃縮液。取濃縮液，在攪拌狀態下向濃縮液中緩緩加入1 %的磷酸溶液適量，調節溶液至PH4. 2，放冷，離心過濾，取濾液，過型號為DlOl大孔吸附樹脂柱，上柱完成後，加水300L充 分洗脫後，改用75%的乙醇150L洗脫，收集乙醇洗脫液，65°C減壓濃縮至稠膏。取稠膏，加入25%的丙酮-水溶液4000ml溶解，於2°C下靜置結晶，過濾，得天然 18-α甘草酸粗品680g。取上述18-α甘草酸粗品，加入35 %甲醇-水溶液2900ml，加熱溶解，於_4°C下靜 置結晶，過濾，即得天然18-α甘草酸385g(本品經高效液相色譜法檢測，含量為98.2%，紫 外最大吸收波長為252. Onm)。實施例五(天然18- α甘草酸膠囊的製備)取實施例四中的天然18-α甘草酸100g，澱粉25g，β -環糊精123g，微粉矽膠2g， 混勻，制粒，過60目篩，乾燥後裝成1000粒膠囊，即得。用法用量為口服，每次2粒，每日 3次。
權利要求
一種天然18 α甘草酸，其特徵在於18 α甘草酸含量為90％ 99％。
2.一種天然18-α甘草酸的製備方法，由以下步驟組成步驟(1)取甘草藥材，粉碎成粗粉，加入適量一定濃度的氨水浸泡提取一定時間，過 濾，藥渣再加一定濃度的氨水浸泡提取數次，合併提取液並減壓濃縮至一定體積，靜置，放 置至室溫，過濾，得濃縮液。步驟(2)取濃縮液，在攪拌狀態下向濃縮液中緩緩加入一定濃度的酸溶液適量，調 節溶液至一定的PH值，放冷，進行酸沉，使18- β甘草酸充分沉澱，離心過濾，分別得到以 18-β甘草酸為主要成分的固體物和以18-α甘草酸為主要成分的濾液。步驟(3)取濾液，過一定型號的大孔吸附樹脂柱，薄層監測，上柱完成後，加水充分洗 脫去除無機鹽及其他大極性雜質後，改用一定濃度的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮 至稠膏。步驟(4)取稠膏，加入含有一定比例有機溶劑的水溶液適量，溶解，低溫靜置結晶，過 濾，即得天然18-α甘草酸粗品。步驟(5)取18-α甘草酸粗品，加入加入含有一定比例有機溶劑的水溶液適量，溶解， 低溫靜置結晶，過濾，即得天然18-α甘草酸。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的「一定濃度的氨水」 是指濃度為0. 2% 5%的氨水溶液，優選濃度為0. 5% 2%，最佳濃度為0. 8% ；每次浸 泡提取時間為3 12小時，優選為6小時；浸泡提取次數為1 3次，優選為2次。
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)中所述的「一定濃度的酸溶 液」是指含有一定比例的有機酸或無機酸的水溶液，所用的酸可以是硫酸、鹽酸、磷酸、乙 酸、甲酸和草酸中的一種或幾種的組合，優選為鹽酸和草酸；酸溶液的濃度為0. 2%， 優選為0. 5% ；調節溶液的PH值範圍為ΡΗ2. 5 5. 0，優選為ΡΗ3. 0 4. 0，最佳PH點為 3. 6 ；酸沉的適宜溫度為2°C 20°C，優選為5°C 15°C，最佳溫度為6°C 8°C。
5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中所用的大孔樹脂型號可以 為 HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、HPD-600,或 D101、XDA-8，優選的大孔吸附樹脂型 號為 HPD-600。
6.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(4)中所用的有機溶劑可以為甲 醇、乙醇、丙酮、異丙醇、異丙醚、冰醋酸中的一種或幾種的組合，優選為異丙醇；結晶適宜溫 度為-10°c 20°C，優選為-8°c 10°C，最佳溫度為-4°c。
7.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(5)中所用的有機溶劑可以為 甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、甲酸、冰醋酸中的一種或幾種的組合，優選為甲醇；結晶適宜溫度 為-10°c 20°C，優選為-5°c 10°C，最佳溫度為2°C 5°C。
8.根據權利要求1所述的天然18-α甘草酸，其特徵在於可以加入藥學上可接受的載 體製成口服劑型或注射液。
全文摘要
本發明提供了一種天然18-α甘草酸及其製備方法，其中18-α甘草酸含量為90％～99％，其製備方法主要由提取、分離、層析、結晶、重結晶工序組成。本發明的製備工藝重現性好，所得到的18-α甘草酸含量高，成本低，質量穩定可控，適合工業化生產。
文檔編號A61P1/16GK101928325SQ20101026420
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者楊永安 申請人:江蘇天晟藥業有限公司