澱粉樣前體蛋白n端結構在其運輸和代謝過程中的作用的製作方法

2023-06-20 03:14:26

專利名稱：：澱粉樣前體蛋白n端結構在其運輸和代謝過程中的作用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，更具體地，本發明涉及澱粉樣前體蛋白N端結構在其運輸和代謝過程中的作用。
背景技術：
：老年痴呆症是中、老年人群中最常見的一種神經退行性疾病，臨床特徵包括記憶的下降，認知能力的喪失，嚴重的行為異常並最終導致死亡。AD患者腦片顯示有三種異常病理特徵老年斑、神經纖維纏結和神經細胞的大量減少。老年斑的主要組分是含有3943個胺基酸殘基的P澱粉樣蛋白(l-amyloidprotein，AP)，它主要有兩種形式AP40和A1342，分別由40和42個胺基酸組成，其中A1342主要分布於AD病人腦中，是有細胞毒性的形式。以AP神經毒性為中心的AP假說已成為目前學術界廣為接受的AD發病機制。AP是由澱粉樣前體蛋白(Amyloidprecursor，tein，APP)經分泌酶水解而來。APP基因位於第21號染色體上，共有18個外顯子，經剪切加工形成不同的編碼產物APP770、APP751和APP695等。APP695(缺少第7、第8兩個外顯子)特異表達在大腦中，尤其在神經元細胞中高表達，與AP的產生關係最密切。APP蛋白單次跨膜，屬於I型跨膜蛋白，它在細胞內的運輸途徑包括分泌和內吞兩個過程。APP在核糖體中合成後，首先通過細胞內的運輸途徑，依次經過內質網，高爾基體，被運輸小泡運輸到細胞表面，然後在其胞內端內吞信號的指導下，通過細胞內的內吞途徑被內吞小泡帶回到細胞內，進入內吞體，溶酶體等細胞器中。在上述過程中，APP可以被定位於不同細胞器上的各種分泌酶所切割，產生不同的代謝產物。APP的細胞內代謝主要有兩種不同的途徑，根據最終是否產生AP，可以分為非澱粉樣蛋白途徑和澱粉樣蛋白途徑。由於a-分泌酶(a-secretase)禾PP_分泌酶(P-secretase)分別介導了這兩個過程，因此又被稱為a-分泌酶代謝途徑和e-分泌酶代謝途徑。如圖1所示，在正常生理狀況下，APP在細胞內主要在細胞膜表面通過非澱粉樣代謝途徑被代謝，APP先在a-分泌酶作用下，生成含部分A13序列的分泌性APP(secretoryAPP，sAPPa)和包含83個胺基酸的羧基末端跨膜片段(APPC-terminalfragment,C83)，該羧基末端片段則在細胞內被進一步降解。金屬酶家族成員ADAM9，ADAM10，ADAM17具有a-分泌酶活性。a-分泌酶的作用位點位於AP序列內部，酶切後會破壞AP的完整結構，因此不會生成AP。而在e-分泌酶代謝途徑中，APP會在分泌小泡或者內吞體、溶酶體等處被e-分泌酶作用，生成分泌性sAPPI3和含有AP完整結構的羧基末端片段(C99)，P-分泌酶(e-secretase)進一步在膜上將C99片斷水解，生成AP和APP胞內區(APPintracellulardomain,AICD)片斷。P-分泌酶又稱BACE(beta-siteAPP-cleavingenzyme)，是天冬氨酸蛋白酶家族的一個特殊成員。Y-分泌酶是一個由四種蛋白質組成的複合物，包括早老素蛋白l(Presenlin1，PS1)，Nicastrin，Aph-l和Pen-2，其中發揮催化作用的是PSl跨膜部分的天冬氨酸殘基所提供的天冬氨酸水解酶活性。它在APP上的作用位點並不專一，產生的A|3主要有A|340和A|342兩種，其中A|342疏水性更強，在生理條件下更容易形成有毒的AI3寡聚體和沉積。在以往的工作中，本發明人已經克隆到一種人APP基因的新剪接產物APP639(APP-AE2)。相比腦內大量存在的APP695蛋白，APP-AE2缺少N端第二個外顯子編碼的56個胺基酸(E2區)，參見ZL03129585.1。儘管現有技術中本領域人員對於APP蛋白作了大量的研究工作，然而APP蛋白上各區段對於APP自身代謝調節方面的了解還不夠清楚。因此，有必要對APP蛋白上各區段進行更細緻的研究，以找到合適的藥物靶點，為神經退行性疾病防治藥物的篩選提供有效途徑。
發明內容本發明的目的在於提供一種對於篩選神經退行性疾病防治藥物有用的藥物靶點，所述的靶點位於澱粉樣前體蛋白(APP)的N端。本發明的另一目的在於提供一種基於所述的藥物靶點篩選藥物的方法。在本發明的第一方面，提供一種分離的澱粉樣前體蛋白片段，所述蛋白片段的胺基酸序列如SEQIDNO:1中第21-76位所示(56aa)。在本發明的第二方面，提供所述的蛋白片段的用途，用於製備或篩選特異性作用於該蛋白片段的物質。在另一優選例中，所述的物質選自但不限於肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。在另一優選例中，所述的物質選自特異性結合該蛋白片段的抗體，特異性結合該蛋白片段的配體，特異性作用於該蛋白片段(優選阻滯該蛋白片段的活性)的小分子化合物。在本發明的第三方面，提供一種篩選抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝進而抑制神經退行性疾病的潛在物質的方法，所述方法包括以含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的胺基酸序列的澱粉樣前體蛋白或片段作為篩選的靶點，選出特異性作用於該靶點(如抑制、阻滯或下調該靶點上蛋白片段的活性)的物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。在另一優選例中，所述的方法包括(1)提供一種澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(2)用候選物質處理步驟(1)所述的澱粉樣前體蛋白片段；(3)選擇出特異性作用於所述的蛋白或片段中SEQIDNO:1中第21-76位所示的胺基酸序列位點的候選物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。在另一優選例中，所述的候選物質選自(但不限於)肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。在另一優選例中，所述的候選物質是化合物(優選小分子化合物)，抗體或配體。在另一優選例中，所述的方法包括(1)提供一種澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第521-76位所示的胺基酸序列；(la)提供一種對照蛋白片段，所述的對照蛋白片段不含有SEQIDNO:l中第21-76位所示的胺基酸序列，其它胺基酸序列與(1)的澱粉樣前體蛋白或片段相同；(2)分別用候選物質處理步驟(1)和(la)所述的蛋白或片段；(3)選擇出作用於步驟(1)的澱粉樣前體蛋白或片段，且不作用於步驟(la)的對照蛋白片段的物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。在另一優選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對於抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝有用的物質。在另一優選例中，所述的方法還包括(4)用步驟(3)獲得的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段(例如表達APP695蛋白)，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(5)觀察步驟(4)的細胞內澱粉樣前體蛋白或片段與內質網、高爾基體、運輸小泡或內吞體等細胞器的共定位情況，若基本上不存在共定位，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。在另一優選例中，所述的方法還包括(4')用步驟(3)獲得的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(5')測定步驟(4')的細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段(CTF)的量，並與對照組比較；其中所述的對照組是不用步驟(3)獲得的潛在物質處理的表達澱粉樣前體蛋白或片段的細胞；若經所述潛在物質處理的細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段的量在統計學上低於(如低20%;較佳地低50%;更佳地低100%或更低)對照組細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段的量，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。在另一優選例中，所述的澱粉樣前體蛋白C端片段包括C99，C83，澱粉樣前體蛋白胞內區(AICD)，AP40，AP42。在另一優選例中，所述的方法還包括(4")用步驟(3)獲得的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(5")測定步驟(4")的細胞內是否形成斑塊結構，若形成斑塊結構，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。在本發明的第四方面，提供一種通過所述的方法獲得的抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。在另一優選例中，所述的物質是抗體。在本發明的第五方面，提供一種抗澱粉樣前體蛋白的抗體，所述的抗體特異性地結合所述的蛋白片段。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1.APP的兩種代謝方式，包括a-分泌酶代謝方式和|3_分泌酶代謝方式。圖2.APP蛋白N端E2的缺失引起APP代謝的下調。A.APP-AE2代謝產生的CTF少於APP695和APP-AE3，泳道1-4為a-分泌酶代謝過程，泳道5-8為P-分泌酶代謝過程，CTF包括C99myc、C83myc和AICDmyc。B.APP-AE2代謝產生的AP量少於APP695和APP-AE3。C.APP結構示意圖。圖3.APP蛋白N端E2的缺失使得APP的a-分泌酶代謝過程和P-分泌酶代謝過程都被下調。A.APP-AE2的a-和p-分泌酶代謝過程的產物CTF和sAPP都少於APP695，泳道1-6為a-分泌酶代謝過程，泳道7-12為13-分泌酶代謝過程，wo-2抗體特異性的識別sAPPa，sAPPP抗體特異性的識別APP695產生的sAPPP，不能識別APPsw產生的sAPPP。B.APP-AE2不能與BACE共定位，APP695可以與BACE共定位，白色部分為共定位的APP與BACE。圖4.APP蛋白N端E2的缺失使得APP的亞細胞定位受到影響。A.APP-AE2沒有成熟形式的蛋白存在，APP695和APP-AE3都有相應的修飾後的蛋白，myc抗體和wo-2抗體均可識別全長的APP-myc。B.APP-AE2和不同的細胞器標誌物(Marker)都沒有共定位，APP695和這些標誌物都可以共定位。其中，LMAN1是內質網到高爾基體的運輸小泡的標誌物，GM130是高爾基體的標誌物，EEA1是早期內吞體的Marker,M6PR是晚期內吞體的標誌物。圖5.APP蛋白N端E2區內部Cys突變的APP代謝和定位情況與APP-AE2—致。A.C向G突變的APP-myc代謝產生的CTF和APP-AE2類似，都明顯少於APP695,泳道1-6為a-分泌酶代謝過程，泳道7-12為13-分泌酶代謝過程。B.C向G突變的APP-EYFP與APP-AE2類似都在細胞中形成聚集的斑塊結構。圖6.APP-AE2所形成的特殊斑塊結構並不是聚集體。A.APP-AE2與聚集體的標誌物都沒有共定位，Vimentin、y-tubulin、Ubiquitin是聚集體的標誌物(Marker)。B.APP-AE2與APP695—樣，在溫和去垢劑可溶性與非可溶性的組分中都有分布，s為可溶性組分，i為非可溶性組分。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次揭示澱粉樣前體蛋白(APP)的N端結構在澱粉樣前體蛋白的運輸和代謝過程中發揮了重要作用，破壞APP蛋白的N端結構可以使得細胞內APP的運輸和代謝異常，毒性產物的生成顯著減少。基於本發明人的新發現，可以以APP蛋白的N端結構作為藥物篩選的靶點，篩選可通過抑制該靶點從而抑制APP蛋白在細胞內正常運輸和代謝的物質，所述的物質是可以防治神經退行性疾病的潛在物質。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化7的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構成"、"基本上由......構成"、和"由......構成"；"主要由......構成"、"基本上由......構成"和"由......構成"屬於"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，"特異性作用於澱粉樣前體蛋白片段"是指一種物質能夠與澱粉樣前體蛋白中內含子2區域(優選地是具有SEQIDNO:1中第21-76位所示胺基酸序列的位點)相互作用，從而抑制、阻滯或下調該區域的活性或功能。所述區域活性或功能的抑制、阻滯或下調對澱粉樣前體蛋白在細胞中的運輸或代謝產生影響。如本文所用，抗體的"特異性"是指抗體能結合於澱粉樣前體蛋白的內含子2區域(優選地是具有SEQIDNO:1中第21-76位所示胺基酸序列的位點)，從而抑制、阻滯或下調該區域的活性或功能。如本文所用，除非另外說明，"澱粉樣前體蛋白或片段"是全長的澱粉樣前體蛋白、各種剪切形式的澱粉樣前體蛋白，澱粉樣前體蛋白胞外區蛋白、澱粉樣前體蛋白N端結構等的總稱。本文中，除非另外說明，所述的神經退行性疾病是指一類與澱粉樣前體蛋白代謝產生細胞毒性片段(如AP42)相關的神經退行性疾病，如老年性痴呆(又稱為阿爾茨海默症)。藥物耙點及其用途澱粉樣前體蛋白(APP)大部分位於細胞外，N端含有一個17個胺基酸的信號肽，胞內部分是很短的APP蛋白C末端。由於C端包含了AP序列，是各種分泌酶的作用區域。到目前為止還沒有得到APP蛋白完整的晶體結構，三維結構的分析主要局限在APP胞外區域。一種APP蛋白的胺基酸序列例如可以與SEQIDN0:1所示的序列(APP695，GenBank登錄號NP_958817)基本上相同，APP695特異性表達在腦中，與AI3的產生密切相關。不同種屬的APP蛋白N端序列非常保守，胺基酸同源性高達36-84%。APP蛋白胞外N端區域含有九個a摺疊和一個|3螺旋，構成一個緊密的球形結構。APP的N端富含半胱氨酸，形成三個二硫鍵，將整個APP蛋白胞外區域束緊在一起。APP蛋白的N端具有一個肝素結合區域，已知外源性的肝素能夠影響AI3的分泌。N端區域帶有較多鹼性胺基酸，帶有的正電荷可以和大腦富含的氨基葡聚糖互相結合；鄰近的疏水區域可能具有配體結合能力，或能形成自身二聚體；APP蛋白N端區域的結構和一些富含半胱氨酸的生長因子類似。本發明人經過大量的工作，證明了APP蛋白N端結構的完整性對於APP蛋白的正常運輸和代謝具有重要的作用。本發明人構建了APP蛋白N端外顯子2(E2)缺失的蛋白(APP-AE2，該缺失使得APP蛋白的N端結構被破壞)，發現APP-AE2在細胞內的代謝水平明顯低於APP695或其它一些APP剪切形式，這種代謝異常主要發生在a-分泌酶、|3-分泌酶作用的過程，Y-分泌酶的作用並不受影響。並且，APP-AE2在細胞內的亞細胞定位情況也與APP695或其它一些APP剪切形式有不同。將E2區內部的Cys定點突變可以得到與APP-AE2類似的結果。上述結果也提示了E2區的缺失引起APP的錯誤摺疊導致APP蛋白代謝和定位的異常。並且，本發明人還發現，APP蛋白的N端結構被破壞後，在細胞內主要以聚集的斑塊形式存在。細胞對於錯誤摺疊的蛋白有多種應對機制，其中一種是通過纖維蛋白的作用使得錯誤摺疊的蛋白在中心體周圍形成聚集體(Aggresome)的結構，但APP-AE2形成的這種特殊的結構並不是聚集體結構。基於本發明人的上述新發現，本發明提供了一種分離的澱粉樣前體蛋白片段，所述蛋白片段是分離自澱粉樣前體蛋白的外顯子2區域的蛋白片段。優選的，所述的蛋白片段的胺基酸序列如SEQIDNO:1中第21-76位所示(56aa)。所述的蛋白片段用於篩選與其可發生特異性作用的物質，所述的物質例如可選自(但不限於)肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。作為本發明的優選方式，可以將所述的蛋白片段作為一種抗原，製備特異性結合該抗原的抗體。基於全長的澱粉樣前體蛋白作為抗原也可以獲得一些抗澱粉樣前體蛋白的抗體，然而這些抗體可能結合於澱粉樣前體蛋白上不同的抗原表位，要從中篩選出特異性結合於澱粉樣前體蛋白外顯子2區域的抗體需要大量的工作，篩選效率並不高。因此，以本發明的蛋白片段作為抗原直接進行抗體的製備，可大大地降低抗體篩選的工作量。此外，也可以基於全長或含有外顯子2的澱粉樣前體蛋白剪切形式作為抗原來製備一系列的抗體，再通過抗原-抗體結合區域分析技術來選擇可特異性作用於外顯子2區域的抗體。一種可用的分析技術例如是單抗的抗原表位掃描技術，該技術例如可參考專利申請號200710173305.2。—旦分離獲得了所述蛋白片段的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白片段。這通常是將其編碼基因克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到。此外，對於較短的蛋白而言，也可採用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。本發明還提供了所述的蛋白片段的用途，其作為澱粉樣前體蛋白的一種有效的抗原性的片段，用於製備特異性結合澱粉樣前體蛋白的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。所述的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的本發明的蛋白片段可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達所述的蛋白片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，其可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Ha騰rling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。多克隆抗體的生產可用本發明的蛋白片段免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。作為本發明的優選方式，以含有所述的蛋白片段的澱粉樣前體蛋白或其剪切形式作為篩選模型，篩選可特異性作用於所述的蛋白片段的物質，例如小分子化合物。篩選方法在得知了澱粉樣前體蛋白的外顯子2區域在澱粉樣前體蛋白的運輸和代謝過程中發揮了重要作用後，可基於該新發現來篩選特異性作用於澱粉樣前體蛋白的外顯子2區域，進而影響澱粉樣前體蛋白在細胞中的運輸和代謝的物質。通過影響澱粉樣前體蛋白在細胞中的運輸和代謝，下調a-澱粉酶和P-澱粉酶的代謝途徑，可有效地降低細胞內毒性蛋白(如A1342)的產生，有效地緩解神經退行性疾病。因此，本發明提供一種篩選抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質的方法，所述方法包括以含有澱粉樣前體蛋白的外顯子2區域(優選如SEQIDN0:1中第21-76位所示的胺基酸序列)的澱粉樣前體蛋白或片段作為篩選的靶點，選出特異性作用於該靶點(如抑制、阻滯或下調該靶點上蛋白片段的活性)的物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。以蛋白上特定的區域作為靶點，來篩選作用於該區域的物質的方法是本領域人員所熟知的，這些方法均可用於本發明。所述的候選物質可以選自肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列等。根據待篩選的物質的種類，本領域人員清楚如何選擇適用的篩選方法。作為本發明的優選方式，所述的方法包括(l)提供一種澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有澱粉樣前體蛋白的外顯子2區域；(2)用候選物質處理步驟(1)所述的澱粉樣前體蛋白片段；(3)選擇出特異性作用於所述外顯子2區域的候選物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。作為一種更優選的方式，可通過同時測試①含有外顯子2區域的澱粉樣前體蛋白或片段、以及②不含有外顯子2區域且其它區域與①相同的澱粉樣前體蛋白或片段；來判斷出可特異性結合前者(①)而不結合於後者(②)的物質，也即該物質作用於澱粉樣前體蛋白外顯子2區域。在得知了該方案後，具體的實施方法對本領域人員而言是很容易的。在一種篩選模式下，通過模擬所述含有澱粉樣前體蛋白的外顯子2區域的澱粉樣前體蛋白或片段的三維結構來進行藥物篩選。目前大量蛋白質的三維結構已由X射線晶體衍射技術和多維核磁共振(NMR)等技術解析而得，為研究蛋白質-配體複合物的分子識別提供了有利條件。澱粉樣前體蛋白的N端位於胞外，可通過模擬其胞外區域的三維結構來進行篩選。目前已經有許多備選的篩選庫(如小分子化合物篩選庫)，使得高通量篩選成為可能。可藉助計算機輔助藥物設計，通過分析藥物靶標，即蛋白分子功能位點的結構性質，設計出特定的化學小分子，使其分子的各部分分子結構和理化性質與靶標相匹配，以達到與之結合併發揮作用的目的，這些技術均是本領域人員所熟知的。經過大規模的藥物篩選，可以獲得一類特異性作用於澱粉樣前體蛋白外顯子2區域的潛在物質。這些初步篩選出的潛在物質可構成一個篩選庫，以便於人們最終可以在進一步驗證的基礎上，從中篩選出能夠對於調節FSTL1的表達和活性真正有用的物質。作為本發明的優選方式，還需要對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從這些物質中進一步選擇和確定對於抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝有用的物質。在細胞水平上，可通過構建細胞模型的方式來進行驗證試驗。相關細胞模型的構建是本領域人員熟知的。例如，可通過將澱粉樣前體蛋白或片段的表達單位(如表達載體)轉入到宿主細胞內，使之可穩定地表達、運輸和代謝澱粉樣前體蛋白或片段。表達單位和宿主細胞的選擇是本領域人員熟知的技術。所述的宿主細胞例如是(但不限於)HEK293。當然，也可以以內源表達澱粉樣前體蛋白或片段的細胞作為篩選的模型，所述細胞例如是(但不限於)SK-N-SH細胞。10作為本發明的優選方式，所述的方法包括用所述的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有澱粉樣前體蛋白外顯子2區域；觀察該細胞內澱粉樣前體蛋白或片段與細胞內質網、高爾基體、運輸小泡或內吞體等細胞器的共定位情況，若基本上不存在共定位，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。一種分析上述蛋白與細胞器的共定位情況的技術是免疫螢光技術，這是本領域人員已知的技術。相應細胞器的標誌蛋白是本領域人員已知的。作為本發明的優選方式，可從細胞內a_分泌酶代謝途徑、13_分泌酶代謝途徑來確定經候選物質處理後細胞內澱粉樣前體蛋白或片段的代謝變化情況。優選地，所述的方法包括用所述的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有澱粉樣前體蛋白外顯子2區域；測定該細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段(CTF，包括C99，C83，澱粉樣前體蛋白胞內區(AICD)，AP40，AP42等)或分泌性APP(sAPP)的量，並與對照組比較；其中所述的對照組是不用步驟(3)獲得的潛在物質處理的表達澱粉樣前體蛋白或片段的細胞；若經所述潛在物質處理的細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段或分泌性APP的量在統計學上低於對照組細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段或分泌性APP的量，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。可以採用例如蛋白質印跡(如Western印跡)等技術來定性、定量或半定量地分析細胞內上述各片段的含量，這是本領域人員熟知的技術。作為本發明的優選方式，所述的方法包括用所述的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有澱粉樣前體蛋白外顯子2區域；測定步驟該細胞內是否形成斑塊結構，若形成斑塊結構，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。本發明還包括了採用所述篩選方法獲得的可用於抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質，所述的物質對於緩解神經退行性相關疾病如老年性痴呆是有效的。本發明還包括了含有所述的物質的組合物，組合物的配製對於本領域人員而言是易於實現的。本發明的主要優點在於(1)首次定位了一個對於澱粉樣前體蛋白的代謝有重要作用的區域，從而為篩選抑制澱粉樣前體蛋白代謝為毒性分子的藥物提供了有效的途徑。(2)提供了一種篩選抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質的有效方法以及抑制物質。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。實施例1.E2的缺失的APP的獲得1.cDNA文庫篩選與Southern雜交所用探針模板的製備(l)cDNA文庫篩選探針模板(Probe1)的製備(a)使用TRIZ0L試齊U，從SK-N-SH細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)中提取總RNA。(b)常規方法進行反轉錄RT-PCR。(c)以RT-PCR產物為模板，使用引物對Pl/P2(表1)進行PCR擴增。(d)電泳，回收純化PCR擴增產物，克隆進pGEM-T-easy載體，酶切，測序。(e)XhoI和SacI酶切，電泳回收純化得到的682bp片段即是Probe1。(2)Southern雜交所用探針模板(Probe2和Probe3)的製備(a)Probe2的製備以篩庫獲得的APP695cDNA為模板，使用引物P3/P4(表1)進行PCR擴增，所得到的459bp片段即為Probe2。(b)Probe3的製備用KpnI和AccI酶切含有APP695cDNA的質粒，電泳，回收純化得到的167bp片段即為Probe3。2.APP639cDNA的獲得本發明人用Probe1篩選人胎腦cDNA文庫(購自GIBC0公司)，經過兩輪雜交，共獲得17個陽性克隆。利用引物P1/P6(表1)進行PCR分析和酶切鑑定這些克隆。在17個陽性克隆中，有14個克隆含有APP基因的編碼序列，其中一個克隆對應於APP770型，一個克隆對應於APP751型，其餘12個克隆屬於APP695型。發明人挑選了幾個對應於APP695的克隆進行測序，結果發現Clone13除了不含有第7、8外顯子外，還缺少第2外顯子，造成第1和第3外顯子直接連接。全序列測定顯示，Clone13全長為3011bp，閱讀框內含有1920bp，推測編碼的蛋白含639個胺基酸(SEQIDNO:1中第1-20位，第77-695位)。因此，發明人將之命名為APP639。表ltableseeoriginaldocumentpage12實施例2.E2的缺失引起了APP代謝的下調本發明人構建了C端帶有myc-tag的APP不同剪切形式的表達質粒，構建方法如下以APP695cDNA(參見GenBank登錄號NM_201414.1)為模板，使用5'引物(5'-TTTTCTAGAGATGCTGCCCGGTTTG_3，(SEQIDNO:8))和3，引物(5，_GAGTCTAGACTAGTTCTGCATCTGC_3，(SEQIDNO:9))(下劃線為XbaI的位點)進行PCR擴增。純化PCR擴增片段，使用XbaI(購自日本TAKARA公司)酶切；同時對載體myc-pcDNA3(購於美國Invitrogen公司)亦使用限制性內切酶XbaI酶切，將經酶切的所述PCR片段插入到酶切後的myc-pcDNA3，獲得含全長APP695(圖中簡寫為695)以及myc-tag的質粒(APP695_myc載體)。以APP639cDNA為模板，使用5'引物(5'-TTTTCTAGAGATGCTGCCCGGTTTG-3'(SEQIDNO:10))禾P3'引物(5，-GAGTCTAGACTAGTTCTGCATCTGC_3，(SEQIDNO:11))(下劃線為XbaI的位點)進行PCR擴增。純化PCR擴增片段，使用XbaI酶切；同時對載體myc-pcDNA3(購於美國Invitrogen公司)亦使用XbaI酶切，將經酶切的所述PCR插入到酶切後的myc-pcDNA3，獲得含APP639(即缺失外顯子2的APP695，圖中簡寫為AE2)以及myc-tag的質粒(APP639-myc載體)。含缺失第3個外顯子的APP695(圖中簡寫為AE3)以及myc-tag的質粒構建以APP695-myc為模板，使用5'引物(5，_TTGGTGAGTTTGTAAGTGATGCCCTTCTCG_3，(SEQIDNO:12))禾卩3，引物(5，-TTCTTGGCAATACTGCAGGATGCCTTCCTTG_3(SEQIDNO:13))進行PCR擴增，純化PCR擴增片段，使用DpnI(購自美國NEB公司)消化多餘模板，自連得到含APP654(即缺失E3的APP695，APP-AE3，簡寫為AE3)以及myc-tag的質粒(APP654-myc載體)。將上述構建的重組質粒轉染到293T細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)中，通過對APP代謝產物量的檢測考察APP的代謝情況，以在細胞內轉入空載體作為對照。利用WesternBlot檢測了APP639蛋白的表達情況。利用myc抗體(購於美國Invitrogen公司)，成功地檢測到APP639-myc融合蛋白(圖2A中2，5泳道)、APP654-myc融合蛋白(圖2A中3，6泳道)和APP695-myc融合蛋白圖2A中4，7泳道)，而在對照組沒有檢測到相應條帶(圖2A中1泳道)。並且，結果顯示APP639-myc代謝產生的C99myc，C83myc和AICDmyc融合蛋白要明顯少於APP654-myc和APP695-myc。也即，全長的APP695可以產生較多的C端片段(CTF);缺失了E2後，CTF的水平都明顯下降，相應的細胞培液中的AP的量也要明顯低於APP695所產生的(圖2B)，但缺失第三個外顯子對應的胺基酸序列對APP的代謝沒有影響。上述結果說明，E2的缺失可以特異性地引起APP代謝的下調。實施例3.E2的缺失使得APP的a-分泌酶和|3-分泌酶代謝途徑都被下調為了進一步研究這種特異性的下調的分子機制，本發明人詳細地考察了APP的a-，e-分泌酶代謝途徑。大多數情況下，APP在細胞中主要經過a-分泌酶代謝途徑分解，在過表達P-分泌酶(BACE)後，主要進行e-分泌酶代謝過程。本發明人分別在不轉染和轉染BACE的情況下考察了APP的代謝產物的生成情況。如實施例2的方法，構建含myc以及APP全長、缺失外顯子2、缺失外顯子3的質粒，分別瞬時轉染入HEK293細胞，收集上述轉染細胞的培液，沉澱其中的蛋白，利用WesternBlot的手段檢測了sAPP蛋白的產生情況。發現在a-，|3-兩個代謝途徑中，APP-AE2代謝所產生的CTF和sAPP都要少於APP695。APP有一種Swedish(sw)突變形式，是將BACE的剪切位點之前的KM突變為NL，這種突變形式易於被BACE剪切，常被作為研究APP代謝的模型(FormanMS等，DifferentialeffectsoftheSwedishmutantamyloidprecursorproteinonbeta—amyloidaccumulationandsecretioninneuronsandno皿euronalcells.JBiolChem19975272(51):32247-32253)。本發明人又構建了缺失E2的APPsw-myc突變形式，得到了與APP695類似的結果(圖3A，a-分泌酶代謝泳道2、3;P-分泌酶代謝泳道8、9)。利用W0-2抗體(購自北京大學第六醫學院)檢測到APP695-myc代謝產生的sAPP。沒有檢測到APP639-myc代謝產生的sAPP，說明APP639代謝產生sAPP的能力要弱於APP695，見圖3A。為了觀察APP和分泌酶在細胞內的定位情況，本發明人分別構建了帶有EYFP-tag的APP-EYFP表達載體和帶有ECFP-tag的BACE-ECFP表達載體，構建方法如下APP639-EYFP:將EYFP-tag片段用XbaI從pEYFP(購自美國Clontech公司)載體中切下，純化酶切後片段，插入到用XbaI酶切後的APP639-myc載體中，得到APP639-EYFP表達載體。APP695-EYFP:將EYFP-tag片段用XbaI從pEYFP載體中切下，純化酶切後片段，插入到用XbaI酶切後的APP695-myc載體中，得到APP695-EYFP表達載體。BACE-ECFP:以BACElcDNA(參見GenBank登錄號NM_012104)為模板，使用5'引物(5'-TCCTCTAGAACTAGTGGATCCATGGCCCAA-3'(SEQIDNO:14))和3，引物(5，-GAGCTCGAGCTTCAGCAGGGAGATGTCATC-3'(SEQIDNO:15))進行PCR擴增，得至IJPCR擴增片段，使用XbaI和XhoI進行酶切，並純化酶切後片段；同時對pECFP-Nl(購自美國Clontech公司)使用NheI和XhoI酶切純化操作，將前述PCR片段插入得到BACE-ECFP表達載體。將上述構建的重組載體轉染到C0S7細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)中，通過共聚焦顯微鏡分別觀察APP639-EYFP，APP695-EYFP與BACE-ECFP在細胞內的共定位情況，白色顯示兩種蛋白有共定位。結果表明，APP695-EYFP與BACE-ECFP可以在細胞中共定位，APP639-EYFP(APP-AE-EYFP)與BACE-ECFP不能在細胞中共定位，見圖3B。實施例4.E2的缺失使得APP的亞細胞定位受到影響在上面的實驗中本發明人發現，APP代謝產物中sAPP的量都明顯減少，因此這種代謝的下調應該是發生在APP被a-分泌酶或13-分泌酶剪切這一步。但還不能確定是由於APP與分泌酶不能結合，還是不能同時定位到相應的細胞器上所致。因此，本發明人又考察了不同剪切形式的APP的亞細胞定位情況。APP在細胞內的運輸包括分泌和內吞兩個過程。在分泌過程中，APP會在內質網和高爾基體上經過氨基化和糖基化的修飾形成成熟的蛋白，因此正常情況下，APP在細胞內會有未成熟，半成熟和成熟的三種形式。如實施例2的方法構建重組質粒和轉染細胞，利用WesternBlot方法檢測了細胞內高爾基體中APP639蛋白的成熟情況。利用myc抗體和wo-2抗體，檢測到APP654-myc和APP695-myc融合蛋白的成熟形式和未成熟形式。可以看到轉染了APP-AE3和APP695的細胞中確實有這三種形式對應的條帶(圖4A，泳道3、4)，而轉染了APP-AE2和細胞中只有未成熟的APP對應的條帶(圖4A，泳道2)。這說明APP-AE2並沒有定位到高爾基體上，APP639myc不能正常成熟，停留在內質網中。將APP639-EYFP和APP695-EYFP分別轉染到C0S7細胞中，利用免疫螢光染色方法，使用LMANl(美國密西根大學張斌博士提供)，GM-130(購自美國BDBioscience公司)，EEA-1(購自美國BDBioscience公司)，M6PR(購自美國SantaCruz公司)抗體分別檢測APP639-EYFP和APP695-EYFP與內質網到高爾基體，高爾基體，早期內吞體，晚期內吞體的共定位情況。結果顯示，APP-AE2-EYFP和內質網到高爾基體的運輸小泡(圖4B，14LMAN1)和高爾基體(圖4B，GM130)都沒有共定位，而APP695-EYFP可以很好的共定位(圖4BLMAN1，GM130)。在內吞過程中，APP在細胞膜上，被內吞體帶回細胞內，因此APP695-EYFP和內吞體(圖4B，EEA-1、M6PR)都有很好的共定位，而APP639-EYFP和內吞體沒有共定位(圖4B，EEA-1、M6PR)。實施例5.APP蛋白N端結構的破壞引起APP的代謝和定位異常在研究APP定位情況時，本發明人發現APP-AE2-EYFP在細胞內會形成聚集的斑塊結構，而一些錯誤摺疊的蛋白往往會形成這樣的結構。本發明人分析了E2序列的特徵，發現其中有三個Cys殘基(aa38、aa62、aa73)，會形成二硫鍵，而二硫鍵對於蛋白結構的穩定具有重要作用，本發明人採用常規的方法把這些Cys殘基分別突變為Gly，破壞了這些二硫鍵，考察了這些突變的APP的代謝和定位情況。分別用WesternBlot和免疫螢光染色的方法，考察上述定點突變後的APP695-myc和APP695-EYFP融合蛋白的代謝和定位情況。WesternBlot結果顯示這些結構被破壞的APP695與APP639代謝情況一致，產生的CTF都少於未突變的APP695(wt)(圖5A，a-分泌酶代謝泳道4-6，P-分泌酶代謝泳道10_12)。免疫染色結果也顯示，APP695蛋白外顯子2中三個半胱氨酸點突變的APP695iyc和APP695-EYFP融合蛋白與APP639融合蛋白一樣，不能正常代謝，在細胞內聚集成團，形成聚集的斑塊結構(圖5B)。實施例6.APP-AE2形成的特殊結構不是聚集體當細胞內產生大量的錯誤摺疊蛋白時，一般的降解機制不能完全降解這些蛋白，就會形成聚集體(Aggresome)的結構，在這種情況下，錯誤摺疊的蛋白被纖維蛋白帶到微管集合中心周圍，形成富含泛素的包被著纖維蛋白的結構，這種結構不能溶於溫和的去垢劑。因此，可以通過考察APP-AE2是否與泛素和纖維蛋白有共定位，以及是否溶於溫和去垢劑來確定這種特殊的結構是否是聚集體。參照實施例4的細胞亞定位方法，利用免疫螢光染色的方法，分別使用抗波形蛋白(Vimentin)、Y-微管蛋白(Y-tubulin)和泛素(Ubiquitin)抗體(均購自美國SantaCruz公司)作為聚集體的標誌蛋白，考察APP639-EYFP和APP695-EYFP蛋白是否與它們有共定位。結果表明，APP639-EYFP與APP695-EYFP與這些標誌蛋白都沒有共定位，APP639沒有形成聚集體，如圖6A。參照實施例2的相關方法，利用WesternBlot的手段檢測了APP639蛋白在去垢劑(NP40)不溶組分(i)中的分布情況。利用抗myc抗體和抗wo-2抗體，檢測到APP639-myc和APP695-myc融合蛋白均在去垢劑(NP40)可溶性組分(s)中分布較多，在去垢劑不溶性組分中分布較少，見圖6B。而APP639-myc融合蛋白只檢測到未成熟形式。結果表明APP639沒有形成聚集體。實施例7.小分子化合物的藥物篩選採用X射線晶體衍射技術，根據APP695蛋白的胞外區(N端含有SEQIDN0:1中第28-123位)胺基酸序列設計模擬的蛋白三維結構，採用高通量虛擬篩選技術，以SPECS化合物資料庫中的化合物為候選物質。將初步篩選與APP外顯子2區域有特異性結合作用的化合物進行歸類，結果獲得了一些經初篩認為潛在有效的候選化合物。實施例8.抗體製備常規方法重組表達和純化獲得蛋白，所述的蛋白序列如SEQIDNO:l中第21-76位所示，將該蛋白作為抗原進行動物免疫。免疫動物為紐西蘭白兔，雄性，體重為2-2.5kg。免疫流程將抗原與Freund's佐劑l:l混合，乳化後，皮下和皮內多點注射進行免疫。抗原的劑量為0.9mg/次/兔。首次免疫用完全Freund's佐劑，再次免疫用不完全Freund's佐劑。免疫的間隔時間為3周。第三次免疫後1周，兔放血，收集抗血清，獲得抗APP蛋白E2區域的免疫多抗。利用APP蛋白作為抗原，與前述獲得的多抗進行抗原抗體反應驗證，結果發現所述的多抗可以特異性結合APP蛋白的E2區域，且不結合於雜蛋白以及APP蛋白上其它區域。將上述製備的抗體加入到如實施例2的方法製備的表達APP695的293T細胞中，通過對APP代謝產物量的檢測考察APP的代謝情況，並與不用抗體處理的表達APP695的細胞、轉入空載體的細胞以及轉入APP639表達載體的細胞進行比較。結果發現，由於抗體的特異性封閉作用，經抗體處理後的細胞APP的代謝情況顯著低於未經抗體處理的情況，而是與轉入APP639表達載體的細胞相當。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表〈110〉中國科學院上海生命科學研究院〈120〉澱粉樣前體蛋白N端結構在其運輸和代謝過程中的作用〈130>086125〈160>15〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>695〈212>PRT〈213〉智人(HomoSapiens)〈400>1MetLeuProGlyLeuAlaLeuLeuLeuLeuAlaAlaTrpThrAlaArg151015AlaLeuGluValProThrAspGlyAsnAlaGlyLeuLeuAlaGluPro202530GinlieAlaMetPheCysGlyArgLeuAsnMetHisMetAsnValGin354045AsnGlyLysTrpAspSerAspProSerGlyThrLysThrCyslieAsp505560ThrLysGluGlylieLeuGinTyrCysGinGluValTyrProGluLeu65707580160172]GinlieThrAsnValValGluAlaAsnGinProValThrlieGinAsn0173]8590950174]TrpCysLysArgGlyArgLysGinCysLysThrHisProHisPheVal0175]1001051100176]lieProTyrArgCysLeuValGlyGluPheValSerAspAlaLeuLeu0177]1151201250178]ValProAspLysCysLysPheLeuHisGinGluArgMetAspValCys0179]1301351400180]GluThrHisLeuHisTrpHisThrMaiAlaLysGluThrCysSerGlu0181]1451501551600182]LysSerThrAsnLeuHisAspTyrGlyMetLeuLeuProCysGlylie0183]1651701750184]AspLysPheArgGlyValGluPheValCysCysProLeuAlaGluGlu0185]1801851900186]SerAspAsnValAspSerAlaAspAlaGluGluAspAspSerAspVal0187]1952002050188]TrpTrpGlyGlyAlaAspThrAspTyrAlaAspGlySerGluAspLys0189]2102152200190]ValValGluValAlaGluGluGluGluValAlaGluValGluGluGlu0191]2252302352400192]GluAlaAspAspAspGluAspAspGluAspGlyAspGluValGluGlu0193]2452502550194]GluAlaGluGluProTyrGluGluAlaThrGluArgThrThrSerlie0195]2602652700196]AlaThrThrThrThrThrThrThrGluSerValGluGluValValArg0197]2752802850198]ValProThrThrAlaAlaSerThrProAspAlaValAspLysTyrLeu0199]2902953000200]GluThrProGlyAspGluAsnGluHisAlaHisPheGinLysAlaLys0201]3053103153200202]GluArgLeuGluAlaLysHisArgGluArgMetSerGinValMetArg0203]3253303350204]GluTrpGluGluAlaGluArgGinAlaLysAsnLeuProLysAlaAsp0205]3403453500206]LysLysAlaVallieGinHisPheGinGluLysValGluSerLeuGlu0207]3553603650208]GinGluAlaAlaAsnGluArgGinGinLeuValGluThrHisMetAla0209]3703753800210]ArgValGluAlaMetLeuAsnAspArgArgArgLeuAlaLeuGluAsn385390395400TyrlieThrAlaLeuGinAlaValProProArgProArgHisValPhe405410415AsnMetLeuLysLysTyrValArgAlaGluGinLysAspArgGinHis420425430ThrLeuLysHisPheGluHisValArgMetValAspProLysLysAla435440445AlaGinlieArgSerGinValMetThrHisLeuArgVallieTyrGlu450455460ArgMetAsnGinSerLeuSerLeuLeuTyrAsnValProAlaValAla465470475■GluGlulieGinAspGluValAspGluLeuLeuGinLysGluGinAsn485490495TyrSerAspAspValLeuAlaAsnMetlieSerGluProArglieSer500505510TyrGlyAsnAspAlaLeuMetProSerLeuThrGluThrLysThrThr515520525ValGluLeuLeuProValAsnGlyGluPheSerLeuAspAspLeuGin530535540ProTrpHisSerPheGlyAlaAspSerValProAlaAsnThrGluAsn545550555560GluValGluProValAspAlaArgProAlaAlaAspArgGlyLeuThr565570575ThrArgProGlySerGlyLeuThrAsnlieLysThrGluGlulieSer580585590GluValLysMetAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluVal595600605HisHisGinLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLys610615620GlyAlalielieGlyLeuMetValGlyGlyValVallieAlaThrVal625630635640lieVallieThrLeuValMetLeuLysLysLysGinTyrThrSerlie645650655HisHisGlyValValGluValAspAlaAlaValThrProGluGluArg660665670HisLeuSerLysMetGinGinAsnGlyTyrGluAsnProThrTyrLys675680685PhePheGluGinMetGinAsn69069522〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉misc_feature〈223〉引物〈400>2gaagaggctgaggaaccctaeg〈210〉3DNA〈213〉人工序列<221〉misc_feature〈223〉引物〈400〉3tccattcacgggaaggagctcc〈210〉4〈211〉20人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400〉4gtttggcactgctcctgctg〈210>5〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉misc_feature〈223〉引物〈400>6caccatcctcatcgtcctcg20〈210>7〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>7tgagcatggcttccactctggc22〈210>8〈211>25〈212>DNA人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>8ttttctagagatgctgcccggtttg25〈210>9〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>9gagtctagactagttctgcatctgc2510〈211>25〈212>DNA〈213>人工序列misc_feature〈223〉引物〈400〉10ttttctagagatgctgcccggtttg25〈210>11〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc—feature〈223〉引物20〈400>11gagtctegactagttctgcatctgc2512〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc一feature〈223〉引物〈400>12ttggtgagtttgtaagtgatgcccttctcg30〈210>13〈211>31〈212>DNA人工序列〈22l>misc—feature〈223〉引物〈400〉13ttcttggcaatactgcaggatgccttccttg31〈210>14〈211>30DNA〈213〉人工序列〈22l>misc—feature〈223>引物〈400>14tcctctagaactagtggatccatggcccaa30〈210>15〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈22l>misc—feature引物〈400>15gagctcgagcttcagcagggagatgtcatc302權利要求一種分離的澱粉樣前體蛋白片段，所述蛋白片段的胺基酸序列如SEQIDNO1中第21-76位所示。2.權利要求1所述的蛋白片段的用途，用於製備或篩選特異性作用於該蛋白片段的物質。3.如權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述的物質選自肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。4.一種篩選抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質的方法，所述方法包括以含有SEQIDN0:l中第21-76位所示的胺基酸序列的澱粉樣前體蛋白或片段作為篩選的靶點，選出特異性作用於該靶點的物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括(1)提供一種澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:l中第21-76位所示的胺基酸序列；(2)用候選物質處理步驟(1)所述的澱粉樣前體蛋白片段；(3)選擇出特異性作用於所述的蛋白或片段中SEQIDNO:l中第21-76位所示的胺基酸序列位點的候選物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括(1)提供一種澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:l中第21-76位所示的胺基酸序列；(la)提供一種對照蛋白片段，所述的對照蛋白片段不含有SEQIDN0:l中第21-76位所示的胺基酸序列，其它胺基酸序列與(1)的澱粉樣前體蛋白或片段相同；(2)分別用候選物質處理步驟(1)和(la)所述的蛋白或片段；(3)選擇出作用於步驟(1)的澱粉樣前體蛋白或片段，且不作用於步驟(la)的對照蛋白片段的物質，所述的物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質。7.如權利要求4-6任一所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對於抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝有用的物質。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括(4)用步驟(3)獲得的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(5)觀察步驟(4)的細胞內澱粉樣前體蛋白或片段與內質網、高爾基體、運輸小泡或內吞體的共定位情況，若基本上不存在共定位，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括(4')用步驟(3)獲得的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(5')測定步驟(4')的細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段的量，並與對照組比較；其中所述的對照組是不用步驟(3)獲得的潛在物質處理的表達澱粉樣前體蛋白或片段的細胞；若經所述潛在物質處理的細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段的量在統計學上低於對照組細胞內澱粉樣前體蛋白C端片段的量，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。10.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括(4")用步驟(3)獲得的潛在物質處理細胞，所述的細胞表達澱粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的胺基酸序列；(5")測定步驟(4")的細胞內是否形成斑塊結構，若形成斑塊結構，則所述的潛在物質是抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。11.一種通過權利要求4-10任一所述的方法獲得的抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質。12.—種抗澱粉樣前體蛋白的抗體，所述的抗體特異性地結合權利要求1所述的蛋白片段。全文摘要本發明涉及澱粉樣前體蛋白N端結構在其運輸和代謝過程中的作用。本發明公開了一種分離自澱粉樣前體蛋白的蛋白片段，其可用於製備或篩選特異性作用於該蛋白片段的物質。本發明還公開了一種篩選抑制澱粉樣前體蛋白的運輸或代謝進而抑制神經退行性疾病的潛在物質的方法，所述方法包括以澱粉樣前體蛋白外顯子2區域作為篩選的靶點，選出特異性作用於該靶點的物質。本發明為神經退行性疾病防治藥物的篩選提供了新途徑。文檔編號C07K16/18GK101724057SQ200810201708公開日2010年6月9日申請日期2008年10月24日優先權日2008年10月24日發明者景乃禾,沈承勇,陳永峰申請人:中國科學院上海生命科學研究院