一種篩選高含量功能成分石斛培養物的方法

2023-06-20 03:07:36 2

一種篩選高含量功能成分石斛培養物的方法
【專利摘要】本發明提供篩選高含量功能成分石斛培養物的方法和提高石斛組培苗中的多糖和/或石斛鹼的方法以及用於實施所述方法的套盒。本發明的方法包括種子預處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無菌石斛種子；種子誘導萌發步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導培養基中培養種子，使種子萌發後形成原胚體；和種胚愈傷組織的誘導增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養基培養所述原胚體，形成細胞團或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。本發明的套盒含有用於實施本發明方法的各種培養基。採用本發明方法和套盒，可獲得生長健壯、代謝旺盛的組培苗，其主要功能成分多糖和石斛鹼含量高於普通組培苗，且可穩定遺傳，可作為優良的種苗繁殖來源。
【專利說明】一種篩選局含量功能成分石斛培養物的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種石斛高含量培養物的篩選方法及用途。【背景技術】
[0002]石斛是我國名貴中藥材，位居「中華九大仙草」之首，具有良好的抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和提高免疫等功能，為歷代養生保健人士所追崇，具有巨大的市場需求，但石斛自身生長緩慢，生境要求苛刻，加上過量開採挖掘，野生資源已瀕臨滅絕，1987年被國家列為重點保護的珍稀瀕危藥用植物。開展與擴大人工種植，既能起到保護資源，又能實現合理利用，是一舉多得的可持續化發展之路。目前石斛的組織培養技術已經比較成熟，規模化人工種植技術已在我國的一些地方取得突破，但在培養種植中石斛藥材品質參差不齊，多糖和石斛鹼等功能成分含量高的上品石斛種質材料的篩選及培育仍然是目前亟待解決的問題。
[0003]藥材的品質一方面取決於原藥材本身的遺傳特性，另一方面也受到生長環境因子的影響。植物在生長中，容易受到各種環境因子脅迫，包括生物脅迫與非生物脅迫。在應對外界環境脅迫時，植物本身並不是被動接受，它會產生各種複雜機制的應激響應，這種響應既包括信號傳導的調控，也包括代謝合成的調控。藥材中功能成分主要都是植物生命活動中的一些次生代謝產物，如多糖，類黃酮，生物鹼等。已有大量研究表明，在藥材的培養中通過添加外源的誘導子，如內生菌、信號分子或前體分子可刺激功能成分的合成，同時一些外源刺激如光、溫、聲波等，也可促進某些功能成分的合成。但是，這些功能成分的合成都是來源於誘導刺激的產物，不能穩定的遺傳。因此，需要研發一種篩選培育高含量功能成分石斛材料，且穩定遺傳的方法。
[0004]石斛蒴果中含有數萬至數十萬粒種子，種子細小呈粉末狀，不含胚乳組織，自然條件下需要與真菌共生才能萌發，自然條件萌發率小於5%。石斛主要以異花授粉為主，自花授粉的成功率低，所形成的大量種胚(子)發育並不完全，同一植株的不同種子間存在遺傳信息(背景)個體差異，通過連續的逆境脅迫培養，生命力旺盛的個體得以生存，存活組培苗生長強壯，代謝旺盛，代謝產物多糖`和石斛鹼的含量亦會增加。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種高含量功能成分石斛組培物的篩選方法，通過從種子萌發到芽簇形成長期再生過程中給予生長逆境脅迫，進行連續篩選，最終可以獲得一批生長健壯、代謝旺盛的組培苗，其主要功能成分多糖和石斛鹼含量高於普通組培苗，且可穩定遺傳，作為優良的種苗繁殖來源。
[0006]本發明的另一個目的是通過安全有效的方式穩定提高石斛組培苗中的功能成分含量，大大提高石斛組培苗的藥用或食用價值，在完全人工可控的環境下生產無菌苗，直接用於生產鮮加工產品。
[0007]本發明方法可通過以下方式實現:收集石斛成熟蒴果，獲得大量種子進行無菌萌發，獲得的原球莖細胞團進行振蕩培養增殖，增殖的細胞或細胞團誘導芽簇分化，在上述從種子萌發到芽簇分化的過程中，始終加以一定濃度的鹽分(NaCl )、甘露醇、低氮等逆境脅迫篩選，最終獲得的芽簇在去除篩選壓的分化培養基上促其分化成芽簇群，跟蹤檢測芽簇的石斛多糖和石斛鹼含量，獲得有效成分含量高、繼代穩定性好的石斛組培苗。
[0008]本發明篩選石斛組培物的方法包括以下步驟:
[0009](1)種子預處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無菌石斛種子；
[0010](2)種子誘導萌發步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導培養基中培養種子，使種子萌發後形成原胚體；和
[0011](3)種胚愈傷組織的誘導增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養基培養所述原胚體，形成細胞團或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
[0012]本發明提高石斛組培苗中的功能成分含量，例如多糖和石斛鹼，的方法包括以下步驟:
[0013](1)種子預處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無菌石斛種子；
[0014](2)種子誘導萌發步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導培養基中培養種子，使種子萌發後形成原胚體；和
[0015](3)種胚愈傷組織的誘導增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養基培養所述原胚體，形成細胞團或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
[0016]上述方法的進一步實施方式中還包括以下一個或多個【具體實施方式】的任意組合。
[0017]在一個【具體實施方式】中，所述方法還包括:
[0018](4)無性繁殖體系的建立步驟，包括在含有NaCl的分化培養基上培養所述細胞團或愈傷組織，形成牙簇群；和
[0019](5)篩選獲得石斛組培苗的步驟，包括重複繼代所述牙簇群3 — 5次並逐步降低激素水平直到芽簇適應無激素生長，進行多糖和石斛鹼含量測定，篩選多糖和石斛鹼含量高、繼代穩定的材料作為石斛組培苗。
[0020]在一個【具體實施方式】中，取未開裂的野生鐵皮石斛蒴果獲得石斛種子。
[0021]在一個具體實施例中，石斛蒴果經75%乙醇處理I 一 3分鐘後，進行表面滅菌。
[0022]在一個具體實施例中，用1%次氯酸鈉或滅菌靈對石斛蒴果進行表面滅菌15-20分鐘。
[0023]在一個具體實施例中，滅菌後獲得種胚，用無菌水適量製成種子懸液，在種子懸液中加入終濃度0.2-0.3%NaCl (質量體積百分比濃度)和/或0.1-0.3mol/L甘露醇，進行脅迫處理。
[0024]在一個具體實施例中，在4-10°C脅迫處理3-5天。
[0025]在一個具體實施例中，將經脅迫處理的種子轉移至誘導培養基中，所述誘導培養基用2/3MS培養基配製，含有400-600mg/L水解乾酪素(CH)、400-600mg/L萘乙酸(NAA)、400-600mg/L吲哚乙酸(IAA)、2_4%蔗糖和0.4-0.8%瓊脂(質量體積百分比濃度，下同)，所述培養基還含有0.2-0.3% NaCl和/或0.1-0.3mol/L甘露醇。
[0026]在一個具體實施例中，所述誘導培養基優選含有500mg/L的水解乾酪素、500mg/L的萘乙酸和500mg/mL的吲哚乙酸。
[0027]在一個具體實施例中，在誘導培養基中誘導萌發30-60天，優選40-50天。
[0028]在一個具體實施例中，液體愈傷組織增殖培養基以2/3N6培養基為基礎，其中N元素含量降至正常量的1/10，且所述培養基含有400-600mg/L水解乾酪素、400-600mg/L穀氨醯胺、0.3-0.6mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0.05-0.15mg/L NAA、和 2-3% 蔗糖。
[0029]在一個具體實施例中，所述液體愈傷組織增殖培養基含有500mg/L的水解乾酪素、500mg/L穀氨醯胺、0.5mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸和0.lmg/L NAA。
[0030]在一個具體實施例中，將誘導萌發產生的原胚體轉移值所述液體愈傷組織增殖培養基中進行暗培養。
[0031]在一個具體實施例中，所述暗培養持續I 一 2個月，且培養初期每3天繼代一次，培養2周後，改為每周繼代一次。
[0032]在一個具體實施例中，暗培養後用分化培養基進行脅迫篩選前還包括用60-100mg/L (優選80-90mg/L)的平陽黴素處理收集得到的細胞團或愈傷組織18-28小時(優選24小時)。
[0033]在一個具體實施例中，用於進行脅迫篩選的分化培養基以2/3N6培養基為基礎，添加有400-600mg/L CH,0.03-0.08mg/L NAA,0.5-1.5mg/L6_糠氨基嘌呤(ΚΤ)、0.3-0.8mg/L6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)、1-3%蔗糖、0.5-0.8%瓊脂，以及 0.2-0.3% NaCl0
[0034]在一個具體實施例中，本發明的分化培養基中，CH的濃度為500mg/L、NAA為0.05mg/L、KT 為 1.0mg/L、6_BA 為 0.5mg/L、蔗糖為 2%、和瓊脂為 0.6%?
[0035]在一個具體實施例中，脅迫篩選在20-25 °C、光照條件下進行30-60天，優選40_50天，形成芽簇群。
[0036]本發明提供的篩選方法，是根據生命體活力差異，在逆境下通過大量選擇淘汰發育不良、生活力差的群體，使具有優良遺傳性狀的個體得以保留，這些個體能適應逆境脅迫，具有較強的代謝合成能力，能夠產生較多的次生代謝產物，這種表現使得人們能夠通過篩選培養後獲得具有高含量功能成分的組培苗。
【具體實施方式】
[0037]1.培養基
[0038]本發明使用到的誘導培養基以MS培養基為基礎。MS培養基的配方如下表1所不(單位:mg/L):
[0039]表1
[0040]
【權利要求】
1.一種篩選石斛組培物的方法，該方法包括以下步驟: (1)種子預處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無菌石斛種子； (2)種子誘導萌發步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導培養基中培養種子，使種子萌發後形成原胚體；和 (3)種胚愈傷組織的誘導增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養基培養所述原胚體，形成細胞團或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
2.一種提高石斛組培苗中的多糖和/或石斛鹼的方法，該方法包括以下步驟: (1)種子預處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無菌石斛種子； (2)種子誘導萌發步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導培養基中培養種子，使種子萌發後形成原胚體；和 (3)種胚愈傷組織的誘導增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養基培養所述原胚體，形成細胞團或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括: (4)無性繁殖體系的建立步驟，包括在含有NaCl的分化培養基上培養所述細胞團或愈傷組織，形成牙簇群；和 (5)篩選獲得石斛組培苗的步驟，包括重複繼代所述牙簇群3- 5次並逐步降低激素水平直到芽簇適應無激素生長，進行多糖和/或石斛鹼含量測定，篩選多糖和/或石斛鹼含量高、繼代穩定的材料作為石斛組培苗。
4.如權利要求1一 3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述種子預處理步驟包括:滅菌石斛蒴果後獲得種胚，用無菌水適量製成種子懸液，在種子懸液中加入終濃度0.2-0.3%NaCl (質量體積百分比濃度)和/或0.1-0.3mol/L甘露醇，進行脅迫處理。
5.如權利要求1一 4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述種子誘導萌發步驟包括:將經脅迫處理的種子轉移至誘導培養基中，所述誘導培養基用2/3MS培養基配製，含有400-600mg/L 水解乾酪素(CH)、400-600mg/L 萘乙酸(NAA)、400-600mg/L 吲哚乙酸(IAA)、質量體積百分比濃度為2-4%的蔗糖和0.4-0.8%的瓊脂，所述培養基還含有質量體積百分比濃度為0.2-0.3%的NaCl和/或0.1-0.3mol/L甘露醇。
6.如權利要求1一 5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述液體愈傷組織增殖培養基以N6培養基為基礎配製，其中，N6培養基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機元素不變，且N元素含量降至正常量的1/10，且所述培養基含有400-600mg/L水解乾酪素、400-600mg/L 穀氨醯胺、0.3-0.6mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0.05-0.15mg/L NAA 和2-3%鹿糖。
7.如權利要求3— 6中任一項所述的方法，其特徵在於，用分化培養基進行培養前還包括用60-100mg/L (優選80-90mg/L)的平陽黴素處理從步驟(3)收集得到的細胞團或愈傷組織18-28小時(優選24小時)。
8.如權利要求3- 7中任一項所述的方法，其特徵在於，所述分化培養基以2/3N6培養基為基礎配製，其中，N6培養基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機元素不變，並添加有 400-600mg/L CH、0.03-0.08mg/L NM,0.5-1.5mg/L6_糠氨基嘌呤(ΚΤ)、0.3-0.8mg/L6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)、1-3 %蔗糖、0.5-0.8 %瓊脂，以及0.2-0.3 % NaCl和/或0.1-0.3mol/L 甘露醇。
9.一種套盒，其特徵在於，所述套盒含有: (O誘導培養基，所述誘導培養基用2/3MS培養基配製，含有400-600mg/L水解乾酪素(CH)、400-600mg/L萘乙酸(NAA)、400-600mg/L吲哚乙酸(IAA)、質量體積百分比濃度為2-4%的蔗糖和0.4-0.8%的瓊脂，所述培養基還含有質量體積百分比濃度為0.2-0.3%的NaCl 和 / 或 0.1-0.3mol/L 甘露醇； (2)液體愈傷組織增殖培養基，所述液體愈傷組織增殖培養基以N6培養基為基礎配製，其中，N6培養基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機元素不變，且N元素含量降至正常量的1/10，且所述培養基含有400-600mg/L水解乾酪素、400-600mg/L穀氨醯胺、0.3-0.6mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0.05-0.15mg/L NAA 和 2-3% 蔗糖；和 (3)分化培養基，所述分化培養基以2/3N6培養基為基礎配製，其中，N6培養基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機元素不變，並添加有400-600mg/L CH、0.03-0.08mg/L NAA、0.5-1.5mg/L6-糠氨基嘌呤(KT)、0.3-0.8mg/L6_BA (6-苄氨基腺嘌呤)、1-3%蔗糖、0.5-0.8%瓊脂，以及 0.2-0.3% NaCl 和 / 或 0.1-0.3mol/L 甘露醇。
10.如權利要求9所述的套盒，其特徵在於，所述套盒還含有用於實施權利要求1一 8中任一項所述方法中的用於種子預處理的NaCl、 甘露醇或其混合物，以及平陽黴素。
【文檔編號】A01H4/00GK103636503SQ201310686855
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】劉成洪, 黃劍華, 王亦菲, 陳志偉, 陸瑞菊, 杜志釗, 何婷, 高潤紅, 徐紅衛, 郭桂梅 申請人:上海市農業科學院