一株能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株的製作方法
2023-06-19 15:25:11
專利名稱：一株能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，屬工業微生物發酵工程技術領域。
背景技術：
環境、能源和持續發展已經成為目前世界性的問題，其中能源是人類社會的重要物質基礎。隨著現代工業，農業和國防科技事業的迅猛發展，能源的消耗量顯著增加。一場全面的能源危機使得人類開始尋找替代能源。必須逐步擴大可再生的生物質資源的比例。 乙醇作為可替代燃料具有以下優點(1)生產成本相對較低；(2)對環境的汙染比汽油、柴油均小得多；(3) 20%的乙醇和汽油混合使用，汽車發動機不必改裝；(4)其來源取之不盡， 用之不竭。生產乙醇的原料主要有植物纖維原料，糖蜜和含澱粉質原料等。地球上每年大約形成1700億噸植物有機物，是自然界分布最廣、含量最多、價格低廉，而又未得到充分利用的可再生資源川，除少量用於造紙、建築、紡織等行業或用作粗飼料、薪柴外，大部分未被有效利用，而白白爛掉或燒掉，有些還造成環境汙染(例如焚燒)。通過生物技術將這些纖維廢棄物轉化為能源、化工產品等，可一舉數得，同時緩解上述幾個問題。以酒精作為石油的代用能源，其關鍵是降低酒精的生產成本。目前雖然澱粉質原料很容易從農業生產中得到， 並且澱粉生產酒精的技術也十分成熟，但是利用豐富，廉價且可再生的植物纖維原料生產乙醇的研究己經漸漸成為全球範圍的熱點之一。這些原料可來自軟、硬木材，雜草，農業生產廢棄物，舊報紙，城市固體廢物等。所有植物來源的木質纖維素均含有豐富的纖維素、半纖維素和木質素，在植物纖維原料中，戊聚糖約佔20% — 30%，在植物纖維原料水解液中戊糖佔30%左右，因此，以木糖為主的戊糖發酵是決定植物纖維資源生產酒精經濟可行的關鍵之一。Karczweskav於1959年第一次提出了用木糖發酵乙醇，但這個發現未引起人們的足夠重視。直到1980年，wnag等人提出，木糖可被一些微生物發酵成酒精。此後， 國際上掀起一股木糖酒精發酵菌種的研究熱潮，迄今為止已發現100多種微生物能代謝木糖成酒精，包括細菌、真菌、和酵母。在戊糖發酵的微生物中，酵母的戊糖發酵能力最強，目前人們研究最多且最有工業應用前景的木糖發酵微生物有3種酵母菌種，即管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、樹幹畢赤酵母(Pihcia stipitis)和休哈塔假絲酵母 (Candidashechatate)它們的木糖發酵酒精轉化率和生產能力分別達0. 28-0. 48g/g (酒精 / 消耗的糖)和 0. 02-0. 66g/ (L · h)。但是能同化戊糖的酵母大多不能發酵戊糖生產酒精，而能發酵戊糖的酵母發酵木糖的酒精產率較低， 選育高效的木糖發酵菌仍然是開發纖維素類可再生資源的重要技術關鍵之一。迄今為止，能工業化運用的酒精生產菌株只有釀酒酵母，除工程菌外，現行釀酒酵母又不能利用木糖等戊糖，而工程菌利用木糖的能力還不能滿足工業化的需要。本發明經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報導。
發明內容
本發明的目的在於克服現行酒精生產菌株——釀酒酵母 Saccharomycescerevisiae (非工程菌)不能直接利用木糖發酵產生酒精，木糖工程菌株利用木糖的能力還不能滿足工業化需要的不足，而提供一株能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，從而擴寬現行酒精生產菌株生產酒精的原料來源的，降低纖維素生產酒精的成本。本發明通過從自然界中進行菌株分離、培養，獲得一株能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母(Pichia anomala)MLBl菌株(保藏號CGMCCNo. 4252，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心2010年10月22日保藏)，該菌株能100%直接發酵木糖產生酒精，酒精產率大幹50%。該菌株也能100%利用葡萄糖產生酒精，酒精轉化率大於60%。 本發明的實現能降低纖維素酒精乃至燃料乙醇的生產成本。本發明是通過如下常規過程獲得將採集自雲南省元江縣城郊的土壤樣品(2 克)，用麥芽液體培養基富集培養48小時，然後按稀釋塗布法取一定量的富集液進行塗布分離，挑取單菌落純化保存備用，採用的培養基為只含木糖的氮基礎培養基。本發明的能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株按如下常規酒精發酵步驟實現首先，將纖維素原料處理後成為木糖液作為碳源，添加到酵母酒精發酵的常規培養基中，調整pH值4. 0-5. 2，開始使用。其次，酒精發酵將MLBl菌株按微生物發酵常規液體種子培養方法、以滅菌木糖液(含糖濃度為2% -5% )培養基進行培養，經搖瓶、種子罐一系列培養後，當每毫升培養液含酵母菌數大於1 X 108個時，按發酵罐培養液(已滅菌，含糖濃度大於5% ) 1/15的量投入到發酵罐中進行培養，溫度控制在28°C，pH值控制在4. 0-5. 2，保持持續或間斷通入無菌空氣，即每間隔1小時通氣10分鐘。培養48-72小時。第三，蒸餾按現行常規酒精生產蒸餾方法進行。本發明的酵母菌菌株MLBl具備以下特徵(1)酵母菌菌株MLBl是異常畢赤酵母(Pichia anomala)，基本生理特徵細胞短卵形至圓柱形，單個、成雙或呈短鏈，菌落白色，表面皺狀；25°C培養3-10天形成子囊，每個子囊含1-4個球形孢子；(2)酵母菌菌株MLBl同酒精生產所使用的其它釀酒酵母菌菌株相比，能100%直接發酵木糖產生酒精，酒精產率大幹50%。該菌株也能100%利用葡萄糖產生酒精，酒精轉化率大於60%。能降低纖維素酒精乃至燃料乙醇的生產成本。本發明提供的能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，彌補了木糖工程菌株利用木糖能力的不足，從而擴寬現行酒精生產菌株生產酒精的原料來源的，降低纖維素生產酒精的成本。同時，還為酵母菌利用木糖發酵酒精提供遺傳依據。
圖1和圖2為異常畢赤酵母(Pichia anomala)MLBl菌株顯微形態照片(100X)。
具體實施例方式實施例一首先，將纖維素原料處理後成為木糖液作為碳源，添加到酵母酒精發酵的常規培養基中，調整pH值4. 0，開始使用。其次，酒精發酵將MLBl菌株按微生物發酵常規液體種子培養方法、以滅菌木糖液培養基(含糖濃度為2%)進行培養，經搖瓶、種子罐一系列培養後，當每毫升培養液含酵母菌數大於1 X 108個時，按發酵罐培養液(已滅菌，含糖濃度5% ) 1/15的量投入到發酵罐中進行培養，溫度控制在28°C，pH值控制在4.0，保持持續或間斷通入無菌空氣，即每間隔1 小時通氣10分鐘。培養48小時。木糖100%被利用產生酒精，其產率大於50%。第三，蒸餾按現行常規酒精生產蒸餾方法進行。實施例二 與實施例一不同之處培養液的pH值為4. 5，種子培養液的糖濃度為3%，發酵罐培養液的糖濃度為7%，培養時間60小時。實施例三與實施例一不同之處培養液的pH值為5. 2，種子培養液的糖濃度為5%，發酵罐培養液的糖濃度為10%，培養時間72小時。實施例四首先，以葡萄糖作為碳源，添加到酵母酒精發酵的常規培養基中，調整PH值4. 0， 開始使用。其次，酒精發酵將MLBl菌株按微生物發酵常規液體種子培養方法、以滅菌培養基(含糖濃度為3%)進行培養，經搖瓶、種子罐一系列培養後，當每毫升培養液含酵母菌數大於1 X IO8個時，按發酵罐培養液(已滅菌，含糖濃度大於5% ) 1/15的量投入到發酵罐中進行培養，溫度控制在28°C，pH值控制在4.0，保持持續或間斷通入無菌空氣，即每間隔1 小時通氣10分鐘。培養48小時。第三，蒸餾按現行常規酒精生產蒸餾方法進行。葡萄糖的利用率為100%，產生酒精的轉化率> 60%。
權利要求
1. 一株能直接利用木糖的異常畢赤酵母菌菌株，其特徵在於異常畢赤酵母 (Pichiaanomala)MLBl菌株，於2010年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 4252。
全文摘要
本發明涉及一株能直接利用木糖的異常畢赤酵母菌株，屬工業微生物發酵工程技術領域。本發明涉及的菌株MLB1是分離自雲南省元江縣城郊自然生態環境，並能直接發酵木糖產生酒精的野生型菌株。該菌株經分類學鑑定屬於異常畢赤酵母Pichia anomala，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.4252。該菌株能100％直接發酵木糖或葡萄糖產生酒精，以木糖為碳源的酒精產率大於50％，以葡萄糖為碳源的酒精轉化率大於60％。本發明提供的能直接利用木糖產生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，彌補了木糖工程菌株利用木糖能力的不足，從而擴寬現行酒精生產菌株生產酒精的原料來源的，降低纖維素生產酒精的成本。同時，還為酵母菌利用木糖發酵酒精提供遺傳依據。
文檔編號C12R1/84GK102154128SQ201010593070
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者喬敏, 餘澤芬, 周薇, 張克勤, 賈東晨 申請人:雲南大學