人骨髓瘤細胞系的製作方法

2023-06-19 11:15:36 4

專利名稱：人骨髓瘤細胞系的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人骨髓瘤細胞系。具體地說，本發明涉及人骨髓瘤細胞系在製造人雜交瘤的方法中的應用，所述人雜交瘤能夠產生人單克隆抗體。
背景Kohler和Milstein在1975年設計了用於提供小鼠單克隆抗體的技術(1，2)。在該方法中，免疫小鼠的產生抗體的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，產生稱為雜交瘤的雜交細胞。融合後，使用殺死所述骨髓瘤親本細胞的藥物選擇所述細胞，而未融合的親本脾細胞壽命有限，很快死亡，因此僅有雜交細胞存活下來。這些雜交瘤能夠無限增殖並分泌抗體，所述抗體特異性針對用於免疫所述脾細胞供體的抗原。克隆產生具有所需特異性抗體的雜交瘤，獲得產生均一抗體分子(即單克隆抗體)的雜交瘤細胞系。
人們已經進行了許多研究努力，試圖應用該技術產生人單克隆抗體。使用小鼠骨髓瘤獲取人單克隆抗體的嘗試是不成功的，因為異種特異性雜交細胞快速丟失相關人類染色體。人們還嘗試使用已知的分泌抗體的人骨髓瘤細胞系(例如分泌IgEλ的U266人骨髓瘤細胞系，以及包含類淋巴母細胞和漿母細胞的異質混合物的RPMI-8226細胞系(3))產生人單克隆抗體，但這些嘗試都失敗了，儘管早期報導是有希望的。
由於未曾成功獲得產生人抗體的雜交瘤，因此人們已經考慮各種可替代的細胞系。例如，已經使用EB病毒(EBV)使產生抗體的人外周血B淋巴細胞無限增殖。然而，與產生小鼠單克隆抗體的雜交瘤相比，這樣的細胞系有許多缺點。例如，它們往往生長不穩定、抗體產量低，而且EBV並不優先使參與抗體反應的淋巴母細胞無限增殖(4)。
也已經發展出產生具有人類特徵的單克隆抗體的策略，所述策略繞過對產生抗體的人類細胞系的需求。例如，通過連接齧齒動物可變區和人類恆定區，已經「人源化」有用的小鼠單克隆抗體(嵌合抗體)(13)。這在某種程度上降低所述抗體的人抗小鼠免疫原性，但由於外源V-區框架的存在，仍然有殘餘的免疫原性。此外，其抗原結合特異性基本是小鼠供體的抗原結合特異性。CDR嫁接和框架操作(EP0239400)已經改進和改良抗體操作，達到可能產生人類藥學應用可接受的人源化小鼠抗體的程度。然而，所述抗體特異性仍然由小鼠結合位點供體決定。此外，它們的產生涉及複雜的序列操作，並且費力繁重。
已經發展用於在體外產生人單克隆抗原結合片段的噬菌體展示技術，可以回收所述抗原結合片段的V基因並工程化進抗體基因，以產生單克隆抗體(14)。然而，通過該途徑產生人單克隆抗體是複雜多步驟的方法，並且由於所述抗體是作為隨機產生序列的組合的結果在體外工程化，因此所述抗體不象天然抗體一樣接受體內親和性成熟。
已經發展出包含人而不是小鼠免疫球蛋白基因的轉基因小鼠品系(15)。該小鼠品系包含人類基因，產生人類抗體；然而，因為所產生的多樣性並非在人宿主內選擇，而是在小鼠宿主內選擇，並且所述抗體在小鼠體內經受親和性成熟，所以所述抗體並不是真正的人類抗體。
從分析的觀點看，已知方法沒有一種能夠揭示人對特異性抗原攻擊的免疫反應。在聚合酶鏈反應(PCR)擴增後直接分析重鏈和輕鏈的基因已經成為用於表徵化人類在某些狀況下所表達的抗體的可選方法。該方法的缺點是缺乏重鏈-輕鏈配對的信息。
用於產生單克隆抗體的小鼠雜交瘤方法有下面附加的好處(與上述基於非雜交瘤的方法相比)該方法能夠優先使抗原激活的B細胞無限增殖，由此長期產生單克隆抗體。
因此，需要一種產生人單克隆抗體的方法，該方法具有常規小鼠單克隆抗體產生方法的所有好處。
發明簡述本發明提供人骨髓瘤細胞系，所述細胞系能夠以類似於製備小鼠單克隆抗體的常規方法中使用的小鼠骨髓瘤的方式作用。因此，本發明首次能夠可靠產生真正的人雜交瘤和單克隆抗體。
因此，本發明涉及能夠使用標準技術與人淋巴細胞融合產生雜交細胞的人骨髓瘤細胞系，所述標準技術例如聚乙二醇(PEG)融合方法、應用失活仙臺病毒(2)或應用電融合方法(17)。本發明的發明人還發展出產生具有相當生長優勢(即倍增時間比來自骨髓瘤患者的初級漿細胞培養物更短)的骨髓瘤細胞系的方法。
本發明的人骨髓瘤細胞系能夠用作通用抗體產生細胞。例如，通過用已知抗體基因轉染所述骨髓瘤細胞系，能夠產生以前特徵鑑定的抗體。因為所述骨髓瘤細胞所產生的翻譯後蛋白可能與人抗體產生細胞所產生的蛋白相同，所以所述骨髓瘤細胞系適於「生理性」抗體產生。
然而，在一個優選實施方案中，本發明的骨髓瘤細胞系用於產生人雜交瘤的方法，所述人雜交瘤能夠產生人單克隆抗體。因此，本發明的其它方面涉及一種產生雜交瘤的方法，所述方法包括將人骨髓瘤細胞系與人淋巴細胞融合的步驟；一種通過所述方法產生的人雜交瘤細胞系；一種由所述雜交瘤產生的人單克隆抗體。
本發明的雜交瘤產生方法可以用於無限增殖化產生在病理狀況下由天然機體反應激發的人抗體。這使得能夠隨時間監控免疫反應，同時提供抗體來源，與通過其它方法製備的抗體相比，所述抗體更可能用於治療。對所述抗體特異性的分析能夠用於提供在體內激發所述抗體的疾病特異性抗原的信息。所述信息能夠再用於設計基於抗原的治療策略，例如改良疫苗。
圖2分析骨髓瘤Karpas707細胞系和雜交瘤分泌的免疫球蛋白。所述細胞以2×106細胞/ml的濃度培養在補充10％透析的胎牛血清和250μCi/ml[35S]甲硫氨酸和半胱氨酸(Amersham International)的L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸缺陷型培養基上培養。所述細胞在CO2培養箱中在37℃下溫育8小時。溫育後，所述細胞懸浮液在1000g離心5分鐘。完全還原後通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳分析上清。通過免疫固定確認放射標記的分泌Ig的成分。
組別1 骨髓瘤細胞產生的小量κ輕鏈2 與gp41 HIV-1反應的IgG，所述gp41 HIV-1由與164形成的雜交細胞產生。
3，4 通過將骨髓瘤細胞與新鮮白細胞融合形成的產生IgG的雜交瘤。
5，8，9，16 與扁桃腺細胞形成的產生IgG的雜交瘤。
6，7 僅分泌κ輕鏈的與扁桃腺細胞形成的兩個雜交瘤。
10-12與新鮮扁桃腺細胞形成的雜交瘤所分泌的IgM。帶12指出該雜交瘤分泌兩種輕鏈。
13 該雜交瘤看起來僅分泌兩種輕鏈，因為它的重鏈G和M是陰性的。
14 具有兩種輕鏈的IgG，所述兩種輕鏈由骨髓瘤和扁桃腺細胞之間的雜交細胞產生。
15 與扁桃腺細胞形成的僅分泌高水平輕鏈的雜交瘤。
圖3a 接近四倍體的Karpas707細胞系的染色體核型。注意包含免疫球蛋白基因的染色體2、14和22是正常的並且是二倍體。83，XX，-X，-X，del(1)(p1lp36)x4，+del(1)(q11q44)，-2，-2，der(3)del(3)(p21p25)inv(3)(q23q25)，+del(3)(q13q21)，der(5)t(1；5)(p11；q31)，der(5)t(2；5)(q21；q31)，del(5)(q13q33)x2，+add(5)(q31)，-6，-6，add(7)(p25)，del(8)(q22q24)，-9，del(11)(q23q25)，-11，del(12)(p12p13)，-13，-13，-14，-14，add(15)(p11)x2，der(16)t(1；16)(p11；p11)，add(16)(p11)x2，-16，der(18)t(1；18)(q23；p11)，add(18)(p11)，add(18)(q23)，-18，add(19)(q13)x2，+der(19)t(1；19)(q11；p13)+der(19)t(dup(1)(q23q44)；19)(q11；p13)，-21，-22，-22，+mar1x2，+mar2b.雜交瘤Karpas707/164的核型，該雜交瘤接近六倍體，包含正常染色體對，這一點在第1染色體非常明顯。125，XXX，-X，-X，-X，del(1)(p11p36)x4，+del(1)(q11q44)，-2，-2，add(3)(p25)，der(3)del(3)(p21p25)inv(3)(q23q25)，add(4)(q31)，-4，der(5)t(1；5)(p11；q31)，der(5)t(2；5)(q21；q31)，del(5)(q13q33)x2，+add(5)(q31)，del(6)(q21 q23)-6，-6，add(7)(p25)x2，del(8)(q22q24)，-9，del(11)(q23q25)，-11，del(12)(p12p13)x2，-13，-13，-14，-14，add(15)(p11)x2，der(16)t(1；16)(p11；p11)，add(16)(p11)x2，-16，der(18)t(1；18)(q23；p11)，add(18)(p11)，add(18)(q23)，-18，add(19)(q13)x2，+der(19)t(1；19)(q11；p13)，+der(19)t(dup(1)(q23q44)；19)(q11；p13)，-21，-21，-22，-22，+mar1x2，+mar2圖4骨髓瘤(a)和雜交瘤(b)的電子顯微鏡照片。與看起來並不包含可檢測水平粗面內質網(RER)的骨髓瘤細胞的胞質相比，雜交瘤的胞質被平行和同心RER(類似漿細胞)佔據。這些形態學觀察與下面事實相關骨髓瘤產生低水平κ輕鏈，雜交瘤分泌高水平IgG。所述細胞在3％戊二醛中固定，超薄切片在乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛中染色。
發明詳述第一方面，本發明涉及一種人骨髓瘤細胞系，所述細胞系適用於產生分泌人單克隆抗體的雜交瘤的方法。
可以從骨髓瘤患者(例如從所述患者的骨髓或外周血)獲得的初級漿細胞培養物獲得所述骨髓瘤細胞系。為發展純系細胞系，從所述患者獲得的細胞在體外培養並擴增。
新發展的人骨髓瘤細胞系通常具有相對長的倍增時間，例如約70小時。然而，本發明的發明人吃驚地發現可通過體外培養所述細胞而產生生長快得多的細胞系。例如，可降低倍增時間到約35小時或更低。
本發明骨髓瘤細胞系的倍增時間是體外培養物處理前的細胞系倍增時間的0.75倍以下，最好0.5倍以下。本發明的骨髓瘤細胞系的倍增時間低於50小時，優選低於40小時，更優選約30小時。
為使用標準聚乙二醇(PEG)融合技術，本發明的骨髓瘤細胞系可能對PEG有抗性。本發明的發明人發現99％的人骨髓瘤細胞在用PEG進行第一次處理進行淋巴細胞融合後被殺死。通過用PEG多個循環處理骨髓瘤細胞，可以使所述細胞抗PEG。本發明的發明人已經發現在二十個循環處理的區域產生其中僅25％的細胞被PEG處理殺死的細胞系。選擇抗PEG的骨髓瘤細胞獲得能夠與人淋巴細胞融合產生本發明的人/人雜交瘤的細胞系。
在標準的產生分泌小鼠單克隆抗體的雜交瘤的方法中，融合細胞用次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)培養基選擇。小鼠骨髓瘤細胞是對HAT敏感，因為它們缺乏次黃嘌呤鳥苷磷酸核糖基轉移酶(HGPRT)，而雜交瘤細胞抗HAT，因為脾細胞融合配體提供HGPRT基因。為使用同樣的選擇方法，本發明的骨髓瘤細胞系應當對HAT敏感。可以通過在8-氮雜鳥嘌呤和/或6-硫代鳥嘌呤或其它本領域內已知的選擇劑中培養，選擇HAT敏感性。本文所用術語「HAT敏感」指在雜交瘤融合方法中，用HAT培養基處理導致優先殺死未融合的骨髓瘤，以便可以分離雜交瘤細胞。
所述骨髓瘤細胞系最好抗Quabain，以便利細胞系或從組織(例如骨髓、扁桃腺、淋巴結、脾和惡性組織)分離的新鮮細胞進行融合和選擇方法。通過將細胞在不斷增加的Ouabain濃度中連續培養，可以使細胞抗Ouabain。所獲得的細胞系對HAT敏感並且抗Ouabain。
已經發現具有生長優勢的骨髓瘤細胞與倍增時間更長的骨髓瘤細胞相比，具有更多的染色體數目。本發明的骨髓瘤細胞可能染色體數目增加(異倍體(anuploid))，或者接近四倍體，並且可能有多種總染色體異常。然而，染色體2、14和22中的一個或多個(最好所有)可能正常和/或是二倍體。可以使用標準技術例如G-帶方法進行染色體分析。
本發明的發明人已經產生和表徵倍增時間短、抗PEG、抗Ouabain和對HAT敏感的人骨髓瘤細胞系(見實施例)。該細胞系稱為「Karpas707」，其樣品已經保藏在rhe ECACC，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，保藏號為00071108。
本發明的第二方面涉及產生骨髓瘤細胞系的方法。除選擇生長優勢、HAT敏感性、Ouabain抗性和/或PEG敏感性(如上述)的步驟外，該方法還包括將標記引入所述細胞的步驟，所述標記能夠賦予對除HAT、Ouabain和PEG外試劑的敏感性或抗性。所述一種標記或多種標記可以通過例如本領域內已知的遺傳工程方法引入細胞。代表性標記有產生可檢測產物的酶，例如β-半乳糖苷酶；賦予抗生素抗性或敏感性的蛋白；以及在某些情況下其存在致細胞死亡的基因(「自殺基因」)，例如在丙氧鳥苷存在下導致細胞死亡的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK)。
本發明的第三方面涉及一種產生人雜交瘤細胞系的方法。可以通過與產生小鼠雜交瘤的常規方法類似的方法產生所述雜交瘤(7)。例如，使用例如標準PEG融合方法、失活仙臺病毒或電融合方法，可以將本發明第一方面的骨髓瘤細胞系與人淋巴細胞融合。
可以通過本領域內已知的任何方法從未融合的細胞中選擇出雜交細胞。例如，可以通過細胞分選(例如通過螢光激活的細胞分選(FACS))、使用磁珠或使用細胞毒性選擇和/或分離雜交細胞。用於選擇雜交細胞的常規小鼠方法涉及在培養基中培養融合後細胞，所述培養基中包含選擇性殺死未與淋巴細胞融合的骨髓瘤細胞的化合物(例如HAT)。隨後可選地克隆所述雜交細胞，產生純系雜交瘤細胞系。產生雜交瘤的通用方法是本領域內已知的。例如，可以使用下面方法在補充2mM L-穀氨醯胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的無血清RPMI1640(RPMI)中形成來自免疫後個體的人淋巴細胞的單細胞懸浮液。所述細胞懸浮液通過無菌70目Nitex細胞濾器過濾，如下洗滌兩次在200g離心5分鐘，沉澱重懸浮於20ml無血清RPMI。
將2×108淋巴細胞與4×107骨髓瘤細胞(融合前在含11％胎牛血清(FBS)的RPMI中保持在對數期達三天)混合，離心並吸出上清。移出細胞沉澱，在一分鐘內邊攪拌邊加入2ml 37℃的PEG1500(在75mM HEPES，pH8.0中50％)，然後在七分鐘內加入14ml無血清RPMI。可加入另外的RPMI，然後細胞在200g離心10分鐘。棄去上清後，將沉澱重懸浮於含15％FBS、100mM次黃嘌呤鈉、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸苷(HAT)、25單位/ml IL-6和1.5×106淋巴細胞/ml的200ml RPMI中。所述懸浮液以200μl/孔分配到十個96孔平底組織培養板內。如下在融合後第2、4和6天飼餵細胞用18G針頭從每孔吸出100μl，然後加入100μl/孔含或不含10U/ml IL-6並且不含淋巴細胞的平板培養基。
當細胞生長達到60-80匯合後，從每孔取出培養物上清，通過ELISA篩選對所需抗原的反應性。可以如下進行ELISA。用50mM碳酸鹽緩衝液，pH9.6中的100ng/孔抗原以50μl/孔在4℃下包被Immulon4板。用含0.05％Tween20的PBS洗板，然後在37℃下用0.5％魚皮明膠封閉30分鐘。如上述洗板，然後加入50μl培養物上清。在37℃溫育30分鐘後，加入50μl偶聯辣根過氧化物酶的山羊抗人IgG(fc)[在PBST中稀釋110,000]。在37℃溫育板30分鐘，用PBST洗滌，然後加入100μl在100mM檸檬酸，pH4.5中含1mg/mlTMB和0.15ml/ml 30％ H2O2的底物。加入50ml 15％ H2SO4，終止顏色反應。在讀板儀上讀出A450。
術語淋巴細胞包括任何產生抗體的細胞。例如，淋巴細胞可以是淋巴母細胞，例如EBV轉化的B細胞。所述淋巴細胞也可以是體外培養的細胞。或者，可以從人類受試者新鮮分離所述淋巴細胞。例如，可以從器官中分離所述淋巴細胞，所述器官例如扁桃腺以及淋巴結、脾、血液或骨髓。
人類受試者可能是健康個體，尤其是已經用特定抗原免疫的個體，或者已經患過特定疾病(已經從所述疾病康復)的個體。所述人類受試者或者可以是目前患有特定疾病的個體。因此，從所述人類受試者獲得的淋巴細胞可能能夠產生目的抗體。
依照本發明的骨髓瘤還可以與不產生抗體的淋巴細胞或產生淋巴因子的其它白細胞融合。尤其優選的是產生抗腫瘤抗體或具有治療用途的淋巴因子的腫瘤浸潤細胞。如此獲得的雜交瘤能夠可靠地大量產生抗腫瘤抗體或淋巴因子。
本發明的雜交瘤產生方法以及用於產生分泌小鼠單克隆抗體的雜交瘤的常規方法的一個好處是所述骨髓瘤細胞系優先與抗原激活的淋巴細胞融合。
本發明還提供一種雜交瘤細胞系以及所述細胞系產生的單克隆抗體。
本發明的雜交瘤最好產生高產量的抗體。例如，所述雜交瘤可能分泌多於100μg/ml的抗體，優選至少200μg/ml抗體，更優選至少300μg/ml抗體。
本發明的雜交瘤可能具有大量的粗面內質網(RER)。與骨髓瘤細胞的胞質(所述細胞並不包含可檢測水平的粗面內質網)不同，本發明的發明人已經發現本發明的雜交瘤細胞的胞質表現為平行和同中心RER(類似漿細胞)。本文中術語「大量的」用於指RER在所述雜交瘤中的水平與在漿細胞中發現的水平類似。
所述單克隆抗體可以是任何同種型例如IgG、IgM、IgD、IgA或IgE。它可以包含輕鏈、重鏈或二者都包括。
最好所述抗體可用於預防或治療疾病。例如，假如從一位患者體內分離出一種疾病特異性的抗體產生細胞，那麼可以用本發明的方法使所述細胞無限增殖，以便大量產生所述抗體。可以將所述抗體以被動免疫的方法給予患者，賦予對所述疾病的抗性。或者，可以將所述抗體給予患有所述疾病的患者，以增強免疫反應並幫助清除感染。可用各種白細胞衍生出的雜交瘤會產生一系列治療用體液因子。
按照本發明的方法產生的人單克隆抗體基本上可以用於任何涉及配體-多肽結合的工藝，包括體內治療和預防應用、體外和體內診斷應用、體外測定和試劑應用等。例如，抗體分子可以根據本領域內技術人員已知的方法用於基於抗體的測定技術，例如ELISA技術。
如上文所提到的，根據本發明產生的抗體可用於診斷、預防和治療方法。例如，按照本發明產生的抗體可在診斷上用於凝集作用、ELISA、免疫過氧化物酶、蛋白質印跡和通過標準免疫組織化學方法的原位蛋白檢測。為在這些應用中使用，所述抗體可以按照本領域內已知的技術標記。此外，所述抗體當絡合到層析支持物如樹脂上後可以製備性用於親和層析方法。所有這些技術對於本領域內技術人員是眾所周知的。
按照本發明製備的抗體的治療和預防應用涉及給予接受者或患者所述抗體。
優選給予患者具有至少90到95％同質性的基本純的抗體，而對於藥學應用最優選98到99％或更高同質性。一旦如所需部分純化或純化所選定的抗體到同質性後，所述抗體就可以應用在診斷或治療上(包括在體外應用)，或者用於發展和實施測定方法、免疫螢光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I卷和第II卷，Academic Press，NY)。
本發明的抗體一般可用於預防、抑制或治療炎症狀態、變應性過敏、癌症、細菌感染或病毒感染以及自身免疫疾病(包括但不限於I型糖尿病、多發性硬化、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、節段性迴腸炎和重症肌無力)。
在本申請中，術語「預防」涉及在疾病入侵前給予保護性組合物。「抑制」指在誘發事件後但疾病臨床出現前給予所述組合物。「治療」涉及在疾病症狀表現後給予所述保護性組合物。
目前有可用於篩選抗體保護或治療疾病的有效性的動物模型系統。在易感小鼠體內測定系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法是本領域內已知的(Knigiht等(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等(1978)NewEng.J.Med.，299515)。如下在SJL/J雌性小鼠體內測試重症肌無力(MG)用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘導所述疾病(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42233)。在小鼠易感品系體內通過注射II型膠原蛋白誘導關節炎(Stuart等(1984)Ann.Rev.Immunol.，42233)。已經描述通過注射分枝桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘導佐劑關節炎的模型(Van Eden等(1988)Nature，331171)。如所述通過給予甲狀腺球蛋白在小鼠中誘導甲狀腺炎(Maron等(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰島素依賴型糖尿病(IDDM)自然發生或者可以在某些小鼠品系中誘導，例如Kanasawa等(1984)Diabetologia，27113所述的品系。小鼠和大鼠中的EAE作為人類MS的模型。在該模型中，通過給予髓磷脂鹼性蛋白誘導脫髓鞘疾病(見Paterson(1986)Textbook ofImmunopathology，Mischer等編輯，Grune和Stratton，New York，第179-213頁；McFarlin等(1973)Science，179478；和Satoh等(1987)J.Immunol.，138179)。
本發明的抗體也可以與其它抗體聯合應用，尤其是與人類疾病相關性細胞上的其它標記反應的人單克隆抗體(Mab)。例如，合適的T細胞標記可以包括那些分類為所謂「分化簇」的標記，「分化簇」由First International Leukocyte Differentiation Workshop命名(Bernhard等(1984)Leukocyte Typing，Springer Verlag，NY)。
一般地說，本發明的抗體將以純化形式與藥學上合適的載體一起應用。通常所述載體包括水溶液或醇/水溶液、乳濁液或懸浮液，均包含鹽水和/或緩衝介質。胃腸外媒介物包括氯化鈉溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉以及乳酸化Ringer’s。如果需要保持多肽複合物為懸浮液，那麼合適的生理學上可接受的佐劑可以選自增稠劑例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。
靜脈內媒介物包括液體和營養補充物以及電解補充物，如那些基於Ringer葡萄糖的補充物。也可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、鰲合劑和惰性氣體(Mack(1982)Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版)。
本發明的抗體可以用作單獨給予的組合物或與其它試劑聯合給予。這些可以包括各種免疫治療藥物，例如環孢菌素、氨甲蝶呤、阿黴素或順鉑(cisplatinum)以及免疫毒素。藥用組合物可以包括各種細胞毒劑或其它試劑與本發明選定抗體、其受體或結合蛋白組成的「混合物」，或者甚至與依照本發明具有不同特異性的選定多肽的組合，例如使用不同靶配體選出的多肽，而不論它們在給予前是否混合。
依照本發明的藥用組合物的給藥途徑可以是本領域內一般技術人員眾所周知的途徑中的任何一種。為進行治療，包括但不限於免疫治療，可以按照標準技術將本發明的抗體給予任何患者。所述給藥可以通過任何合適模式，包括胃腸外、靜脈內、肌內、腹膜內、經皮、通過肺途徑，或者如果合適，通過導管直接灌輸。給藥劑量和頻率將取決於患者的年齡、性別和病況、其它藥物的同時給予、禁忌以及臨床醫師考慮的其它參數。
本發明的抗體可以凍幹保存並在使用前用合適載體重建。已經顯示該技術對於常規免疫球蛋白有效，並且可以利用本領域內已知的凍幹和重建技術。本領域內技術人員將認識到凍幹和重建可能導致不同程度的抗體活性損失(如使用常規免疫球蛋白時，IgM抗體比IgG抗體損失更多活性)，需要上調使用水平以進行補償。
可以給予包含本發明抗體或其混合物的組合物以進行預防性和/或治療性治療。在某些治療應用中，成功使選定細胞群至少部分抑制、遏制、調節、殺死或達到某些其它可測量參數的足夠量被定義為「治療有效量」。需要達到該劑量的用量將取決於疾病的嚴重性以及患者自身免疫系統的一般狀態，但一般範圍從0.005到5.0mg抗體每公斤體重，更通常使用0.05到2.0mg/kg/劑的劑量。為進行預防應用，包含本發明選定多肽或其混合物的組合物也可以以相似劑量或稍低劑量給予。
可以在預防和治療中利用包含依照本發明抗體的組合物，以幫助在哺乳動物體內改變、失活、殺死或除去選定靶細胞群。此外，本文所述抗體可以在體外應用或在體外從細胞的異質收集物中殺死、排除或有效除去靶細胞群體。可以將來自哺乳動物的血液在體外與選定抗體、其細胞表面受體或結合蛋白混合，由此從所述血液中殺死或除去不需要的細胞，然後按照標準技術將所述血液輸回所述哺乳動物。
也可以利用從患者體內抗體產生細胞產生無限量特定抗體的能力來獲得關於免疫反應的有價值信息。例如，假如患者患有疾病，就有可能推導免疫系統所靶向的疾病特異性抗原。可以利用該信息設計更好藥物和疫苗以治療和/或預防所述疾病。
幾乎每種疾病都產生抗體介導的免疫反應，因此是抗體療法的預防/治療的候選者。本發明的方法對於無限產生受到病理狀況天然防禦性反應激發的人類抗體是無價的。然而，最感興趣的是應用本發明的方法無限增殖化腫瘤浸潤淋巴細胞。這可能產生有用的抗癌抗體，同時發現腫瘤特異性抗原。所述抗原可以反過來用作抗癌疫苗。
通過分析在不同時間產生的抗體，有可能作出對抗原攻擊的免疫反應的時間圖。這可以為特定治療策略或接種方法提供關於最佳時間的有價值信息。
在本發明的另一方面中，提供下面應用通過用產生抗體的基因轉染依照本發明第一方面的人骨髓瘤細胞，應用所述細胞產生抗體。所述人骨髓瘤細胞產生的翻譯後修飾與在人抗體內形成的翻譯後修飾相同。因此，為進行生物技術產生，所述人骨髓瘤系優選不僅通過人雜交瘤產生抗體，而且通過用已知抗體基因轉染來產生抗體。
也可以應用本發明的人雜交瘤細胞系選擇也是HAT敏感性的突變體，篩選方法與小鼠Sp2/0-Ag14與另一種淋巴細胞融合後發展成為雜種雜交瘤(16)的篩選方法相同。尤其是對於使用本發明的產生低/無法檢測水平但具有高水平RER的骨髓瘤細胞系產生的雜交瘤，可以根據與能夠產生目的抗體的第二種淋巴細胞的融合進行選擇。使用該方法，可以產生能夠分泌高滴度所需抗體的雜種雜交瘤。
下面實施例用於舉例說明本發明，而不應當視為本發明的限制。本發明尤其涉及在這些實施例中描述的特定實施方案。
為試圖研究發展雜交細胞重複失敗的原因，用PEG按細胞融合所用的同樣方法單獨處理所述骨髓瘤細胞。此後，將細胞接種在不含HAT或Ouabain的生長培養基中，檢查生活力。對PEG處理細胞的檢查揭示PEG高度有毒，殺死超過99％的細胞。產生抗PEG的亞系考慮到上面發現，本發明的發明人決定嘗試和發展一種抗PEG的亞系。這可以如下完成用PEG(1500MW)根據用於形成小鼠雜交瘤的方法處理約107骨髓瘤細胞。最後長出的少數生活細胞再次用PEG處理。在約18個月內重複所述處理循環超過二十次，然後出現一個骨髓瘤亞系，該亞系僅有四分之一的細胞被PEG處理殺死。然而，在此過程中再次出現抗HAT的細胞。因此所述細胞用8-氮雜鳥嘌呤再處理一次並克隆。分離出一個在HAT培養基中培養未發生回復的集落。該細胞系被稱為骨髓瘤Karpas 707細胞系，已經將該細胞系的樣品保藏起來，保藏號為ECACC00071108。與EBV無限增殖化的淋巴細胞融合然後使用標準PEG融合方法(7)，使所述HAT敏感、抗PEG的細胞與EBV無限增殖化的產生針對gp41的單克隆抗體的人B-淋巴細胞164細胞融合。細胞懸浮液接種在多孔塑料板上。在HAT和Ouabain存在下培養後，生長出類似骨髓瘤細胞系的集落。在針對抗病毒抗體的Karpas AIDS細胞測試(8)中，組織培養液顯示丙酮固定的HIV-1感染的Karpas45T細胞的膜的強烈染色。表徵所述雜交瘤產生的人單克隆抗體使用HIV-1 gp41幾種多肽的進一步研究使我們明確以下事實我們的單克隆抗體針對肽LAVERYLKDQQLLGIWG反應，但不能針對HIV-1 gp41的其它肽反應(結果未顯示)。該單克隆抗體識別的表位看起來在HIV-1的非洲NDK株(9)中並不存在，因為所述抗體不與NDK感染的T細胞反應，而是不僅與HIV-1的Cambridge分離物(10)反應，而且與早期French LAV分離物(11)反應。資料庫搜尋證實HIV-1的French(LAV)和British(CAM1)分離物具有共同的上述胺基酸序列，而African分離物包含一個賴氨酸到精氨酸的突變。與新鮮人淋巴細胞融合在與164細胞系成功融合後，本發明的發明人決定研究清楚它們的骨髓瘤細胞是否也與新鮮人淋巴細胞形成產生抗體的雜交瘤。他們將所述骨髓瘤細胞與來自一名成人外周血的未分級分離白細胞(WBC)融合，並且將所述骨髓瘤細胞與來自兩名兒童手術切除的扁桃腺製備的扁桃腺細胞融合。PEG融合後獲得的細胞懸浮液接種在24孔和96孔塑料組織培養板中，並首先在補充20％胎牛血清和HAT的RPMI-1640培養基中培養12天。然後使用單獨的生長培養基，當所述骨髓瘤細胞與扁桃腺細胞融合時，在隨後2-3周內在約25％孔中觀察到集落形成，當所述骨髓瘤細胞與血液WBC融合時，2-3周後在約10％孔中觀察到集落形成。通過ELISA分析從有活性細胞生長的孔中收集的組織培養液中IgG的存在。在該方法中，在塑料孔中使用蛋白A捕獲所述新形成的雜交瘤產生的IgG單克隆抗體。從超過100個孔收集的組織液包含IgG。
目前，本發明的發明人已經從與外周血淋巴細胞的融合中發展超過20個獨立的分泌IgG的雜交細胞，從與扁桃腺細胞的融合中發展超過100個產生抗體的雜交細胞。實施例3-表徵人骨髓瘤細胞系和雜交瘤雜交瘤的形態學分析許多長出細胞的生長模式各不相同。當在靜置培養中時，骨髓瘤細胞以貼壁細胞的統一模式生長，形成覆蓋塑料表面的不規則鑲嵌，同時不斷釋放細胞進入培養液。當在滾瓶中培養時，大多數細胞在懸浮液中保持為不同大小的細胞簇。一些雜交細胞的生長類似親本骨髓瘤細胞，但許多其它雜交細胞獲得不同的形態學和生長形式。在靜置培養物中，一些雜交瘤附著到塑料表面，呈現許多厚但短的紡錘、矩形和三角形。其它雜交瘤細胞主要在懸浮液中以單細胞或簇的形式存在。
對所培養的骨髓瘤的超微結構檢查揭示與在培養第一年內包含大量粗面內質網(RER)的細胞(5)不同，所述細胞在長期體外培養後損失大部分RER。然而，對兩個雜交瘤707/164和707/105(與血液B細胞形成)的檢查揭示在兩種情況下所述雜交細胞都類似漿細胞(圖4)。大部分胞質被平行和同心RER佔據，而瀦泡的膨脹程度在細胞之間各不相同。RER的內容物看起來是細微的顆粒狀物質，可能是免疫球蛋白。在大部分切片中可以看到大量線粒體，而通過高爾基體區域的切片揭示高度發達的細胞器。由於對EBV無限增殖化的164B細胞的超微結構檢查揭示僅有少量短和薄的RER束，因此提出融合的淋巴母細胞在某種程度上激活潛伏的骨髓瘤RER產生Ig並不是沒有道理的。骨髓瘤細胞系的染色體分析為證實產生抗體的細胞確實是骨髓瘤和人淋巴細胞的雜交細胞，製備細胞培養物，使用Czepulkowski等(12)描述的G帶方法進行染色體分析。在早期，發現所培養的骨髓瘤細胞(象新鮮的患者細胞)是亞二倍體，其45條染色體包含幾個染色體異常(5)。然而，發現具有選擇性生長優勢(多輪體外培養循環後)和PEG抗性增加的骨髓瘤細胞接近四倍體，包含許多並且不尋常大數量的總染色體異常。事實上在23個染色體中13個是異常的。核型分析揭示存在5個拷貝的染色體1和3個標記染色體，其中染色體1的5個拷貝都比正常情況短。有趣的是，注意到染色體2、14和22(它們包含免疫球蛋白基因)是正常的並且是二倍體。
為明確PEG處理的重複循環是否誘導這些染色體核型異常，對PEG處理前凍存細胞的染色體也進行分析。分析揭示所有這些變化在PEG處理前都已存在。因此，看起來在許多個月的連續體外培養和用8-氮雜鳥嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、HAT和Ouabain處理後，出現與亞二倍體骨髓瘤細胞相比有生長優勢的接近四倍體的細胞系。雜交瘤細胞系的染色體分析對與164細胞形成的雜交瘤的核型分析揭示所述細胞接近六倍體，包含所述骨髓瘤細胞接近四倍體的染色體和來自淋巴母細胞的正常染色體。
對產生針對HIV-1 gp41的單克隆抗體的EBV轉化淋巴母細胞(Karpas164系)的核型分析顯示約10％所述細胞呈現t(1；16)(p11；q10)轉位，該轉位類似於在所述骨髓瘤細胞系中發現的轉位。這可能是由長期體外培養引起的。IgG產生分析至於IgG產生的量，對所述EBV感染的淋巴母細胞和所述雜交細胞(707/164)進行的HIV-1 gp41抗體分泌的比較測定揭示在相同條件下培養同樣數目細胞(106/m1)後，所述雜交瘤產生抗體至少是所述淋巴母細胞的八倍。準確地說，培養四天後，雜交細胞707/164分泌470μg/ml IgG，而164細胞分泌的量低於70μg/ml的測定檢測水平。由於兩種細胞培養物具有抗體合成的相同遺傳信息，因此清楚的是本發明的雜交瘤細胞在抗體產生上遠遠更有效。
對免疫球蛋白分泌的測試證實所述骨髓瘤細胞僅產生小量輕鏈。與扁桃腺細胞的融合細胞以及與血液淋巴細胞的融合細胞產生分泌IgG和IgM的集落。其中一個與扁桃腺細胞形成的雜交細胞僅產生輕鏈(λ+κ)。所述Ig產生的多樣性提示所述骨髓瘤細胞系能夠與大多數(如果不是所有範圍)的抗體產生細胞形成雜交瘤。事實上，本發明的發明人已經發現與本文所述骨髓瘤細胞系形成的雜交瘤在抗體產生上比小鼠雜交瘤遠遠更有效(明確的說，分泌抗HⅣ-1gp41抗體的雜交瘤產生470μg/ml的IgG，而與血液淋巴細胞融合後形成的雜交瘤產生210μg/ml和150μg/ml IgG)。這與以下事實相關與小鼠雜交瘤中稀少的粗面內質網(RER)相比，在人雜交瘤中存在大量RER。
不偏離本發明範圍和精神對本發明所述方法和系統的各種修改和變化對於本領域內技術人員是顯而易見的。雖然已經結合特定優選實施方案描述本發明，但應當理解所要求保護的本發明不應當不適當地受到所述特定實施方案的限制。事實上，對化學和生物或相關領域內技術人員顯而易見的所述實施本發明的模式的各種修改將包括在本發明內。上面說明書中提到的所有出版物都通過引用結合到本文中。
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權利要求
1.一種用於產生人單克隆抗體的方法的人骨髓瘤細胞系，所述細胞系已經通過多輪連續體外培養選擇生長優勢。
2.一種用於產生人單克隆抗體的方法的人骨髓瘤細胞系，所述細胞系具有選自以下的一種或多種特性a)PEG抗性；b)HAT敏感性；c)Ouabain抗性。
3.權利要求2的人骨髓瘤細胞系，所述細胞系具有a、b和c所有特性。
4.任一項前述權利要求的骨髓瘤細胞系，所述細胞系的染色體數目增加和或一種或多種染色體異常。
5.權利要求4的骨髓瘤細胞系，所述細胞系接近四倍體。
6.權利要求4或5的骨髓瘤細胞系，其中染色體2、14和22中的一個或多個染色體是二倍體並且沒有染色體異常。
7.任一項前述權利要求的骨髓瘤細胞系，所述細胞系基本如本文所述，在本發明中稱為Karpas707，所述細胞系與以保藏號ECACC00071108保藏的樣品相同，或者可用所述樣品衍生獲得。
8.一種產生人骨髓瘤細胞系的方法，所述方法包括下列步驟a)從骨髓瘤患者分離初級人骨髓瘤細胞；b)通過多輪體外培養在體外培養擴增所述細胞，以便選擇與初級骨髓瘤細胞相比的生長優勢；c)將所述細胞暴露於使得能夠選擇一種或多種HAT敏感細胞的試劑；d)任選將所述細胞暴露於Ouabain並選擇一種或多種抗Ouabain的細胞；e)將所述細胞暴露於聚乙二醇(PEG)，然後選擇一種或多種抗PEG細胞；其中上述步驟c-e可以單獨進行或以任何順序連續進行。
9.權利要求8的方法，所述方法包括下列步驟f)將一種標記引入所述細胞，所述標記能夠賦予對除HAT、Ouabain和PEG以外試劑的敏感性或抗性；其中步驟f)可在該方法步驟a)後的任一點進行。
10.一種產生人雜交瘤的方法，所述方法包括將權利要求1到7中任一項的人骨髓瘤細胞系與人白細胞進行融合的步驟。
11.權利要求10的方法，所述方法包括下列步驟a)在聚乙二醇(PEG)、失活仙臺病毒存在下、或者在電融合條件下，將權利要求1到7中任一項的骨髓瘤細胞系與人白細胞溫育；b)選擇雜交細胞。
12.權利要求11的方法，其中步驟b)包括i)在存在HAT、存在或不存在Ouabain的條件下繼續溫育；ii)選擇抗HAT、任選抗Ouabain的細胞；iii)培養所述抗HAT、任選抗Ouabain的細胞，然後選擇單個雜交瘤克隆。
13.權利要求10到12中任一項的方法，其中所述白細胞是產生抗體的淋巴細胞、淋巴母細胞如EBV無限增殖化的淋巴細胞或者產生淋巴因子的白細胞。
14.權利要求10到13中任一項的方法，其中所述白細胞新鮮分離自人類受試者。
15.權利要求10到12中任一項的方法，其中所述人白細胞是不同程度抗原激活的淋巴細胞，所述人骨髓瘤細胞系優選與所述抗原激活淋巴細胞融合。
16.一種人雜交瘤細胞系，所述細胞系通過權利要求10到15中任一項的方法製得。
17.權利要求16的人雜交瘤細胞系，所述細胞系具有大量粗面內質網。
18.一種人單克隆抗體，所述抗體由權利要求16或17的雜交瘤細胞系製得。
19.權利要求18的人單克隆抗體，所述抗體用於治療或預防疾病的方法。
20.權利要求19的人單克隆抗體，所述抗體用於使人類受試者獲得體液免疫。
21.一種產生抗體的方法，所述方法包括下列步驟(i)從人類受試者分離淋巴細胞；(ii)將所述淋巴細胞用於權利要求10到15中任一項的方法中，從而產生人雜交瘤；(iii)分離所述雜交瘤分泌的抗體。
22.權利要求21的方法，其中所述抗體能夠治療和/或預防疾病。
23.權利要求22的方法，其中所述淋巴細胞是腫瘤浸潤淋巴細胞，所述抗體可用於治療或預防癌症。
24.一種鑑定疾病特異性抗原的方法，所述方法包括下列步驟(i)通過權利要求22或23的方法產生疾病特異性抗體；(ii)推導所述抗體特異性識別的抗原。
25.一種監測人體免疫反應的方法，所述方法包括下列步驟(i)從人類受試者分離不同階段免疫反應的淋巴細胞；(ii)將所述淋巴細胞用於權利要求10-15中任一項的方法中，從而產生人雜交瘤；(iii)分離各雜交瘤所分泌的抗體。
26.一種產生人抗體的方法，所述方法包括以下步驟(i)用一種或多種抗體編碼基因轉染權利要求1到7中任一項的人骨髓瘤細胞系；(ii)用所述轉染骨髓瘤細胞系產生所述抗體。
27.一種產生體液因子的方法，所述方法包括下列步驟將權利要求1到7中任一項的骨髓瘤細胞系細胞與能夠產生所述體液因子的白細胞融合。
28.權利要求16的人雜交瘤細胞系在選擇能夠產生雜種雜交瘤的突變體的方法中的應用。
全文摘要
提供用於產生人單克隆抗體的方法的人骨髓瘤細胞系。
文檔編號C07K16/18GK1455813SQ0181505
公開日2003年11月12日 申請日期2001年7月9日 優先權日2000年7月7日
發明者A·卡帕斯 申請人:劍橋大學技術服務有限公司