一種禽流感h5n6亞型的雙色螢光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法

2023-06-19 10:50:51

一種禽流感h5n6亞型的雙色螢光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法。本發明檢測試劑盒含有特異性引物和探針，通過反應體系和條件的優化，一次試驗可同時高靈敏、高特異地檢測出H5N6的H5基因和N6基因，具有很好的特異性、敏感性和重複性；可特異性地檢測H5N6，與SIV-H1N1、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2等病毒的不發生交叉反應；檢測限達102拷貝/μl；重複性較好；本發明的檢測方法是H5N6亞型禽流感病毒快速初篩及初步確認定型的良好方法。
【專利說明】一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法。

【背景技術】
[0002]禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬A型病毒(AIV)引起的一種禽類感染或疾病症候群。禽流感的發病情況取決於病毒的致病性及一級宿主的易感性，也受環境因素、飼養管理條件及並發疾病等因素的影響，可表現為無症狀感染、輕度上呼吸道症狀、產蛋量下降及急性的致病性死亡。
[0003]根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同，禽流感病毒分為不同的亞型。迄今為止，HA已發現16種，NA已發現9種。
[0004]H5亞型中，常見的H5N1、H5N2亞型為高致病性禽流感，而H5N6在以往一直被認為是低致病性的禽流感。2014年5月9日，在不明原因肺炎的監測中，在一個因重症肺炎去世的病例標本中監測出H5N6禽流感病毒核酸陽性，經過中國疾控中心進一步確認為H5N6禽流感病毒。而後這次根據病毒基因的序列分析，最後證明它對禽是高致病性的。儘管這是個案，H5N6感染人的風險並不是很高，但是動物疫病監控機構和疾控機構還是需要對其具備足夠的重視。
[0005]基於Taqman探針法的一步法突光定量實時PCR ( Realtime FluorescenceRT-PCR)可以快速、靈敏、特異地檢出目的RNA片段，已經逐漸成為RNA病毒檢測的一個重要發展方向。通過實時記錄探針標記基團受激發產生的螢光，實現了對PCR擴增過程實時監測，無需電泳檢測，有效減少了 PCR產物的氣溶膠汙染和EB對環境的汙染。而配合適當的buffer、引物、探針，可以使靈敏度達到低至10個以內拷貝的檢測。
[0006]多色螢光定量PCR技術是指在同一個螢光定量PCR擴增試驗中同時擴增多個目的基因，而每個目的基因採用的不用波長的螢光探針進行檢測。螢光標記的探針有多種，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種螢光標記的探針在PCR擴增過程中所產生的螢光信號不同。


【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供一種禽流感病毒H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒。
[0008]本發明的另一目的在於提供一種禽流感病毒H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測方法。
[0009]本發明所採取的技術方案是:
一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:病毒RNA核酸提取液、酶混合液、雙色螢光定量PCR Mix、陽性質控品、陰性質控品，所述雙色螢光定量PCRMix中含有2 X雙色螢光定量PCR buffer、dNTPs、及禽流感病毒H5N6亞型的H5基因和N6基因的特異性引物及探針，序列分別為:
H5基因的
上遊引物:H5-F:5』 - CACATGCTCAGGACATACTGGA-3』 (SEQ ID N0.1)；
下遊引物:H5-R:5，- ACACATTGGGTTTCCGAGGA-3』 (SEQ ID N0.2)；
螢光探針:H5-P:5』 -Fam-AGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATC-3』 BHQl (SEQ ID N0.3)；
N6基因的
上遊引物:N6-F:5』 -TATGTAGAACTAATCAGAGGGAGGCC-3』 (SEQ ID N0.4),
下遊引物:N6-R:5，-CCGTCATGCCAGGACCA-3，(SEQ ID N0.5),
螢光探針:N6-P:5』 -CY5-GTAGCACTCTGTGGATCCAAGGAGCGATT-3』 BHQ2 (SEQ ID N0.6)；H5基因的螢光探針報告基團為Fam，淬滅基團為BHQl ；N6基因的螢光探針報告基團為CY5，淬滅基團為BHQ2。
[0010]進一步的，上述2 X雙色螢光定量PCR buffer含有pH為7.8的64mM HEPES、8mMMgCl2UOOmM KC1、4%DMS0、0.2mM 甜菜鹼、0.2mg/mL 海藻糖。
[0011]進一步的，上述病毒RNA提取液中每2L中含有異硫氰酸胍250g，重蒸苯酚500ml，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液26.4mL, 0.75M檸檬酸鈉溶液17.6mL, 2M醋酸鈉溶液50mL，餘量為雙蒸水，pH值為4.8?5.2。
[0012]進一步的,上述酶混合液中含有Taq酶和逆轉錄酶。
[0013]一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測方法，包括以下步驟:
1)提取病毒RNA；
2)雙色螢光定量PCR擴增:將雙色螢光定量PCRMix 20μ1中加入酶混合液?μ?，瞬時離心混勻後，再加入病毒RNA 4μ1 ;放入定量PCR儀器的反應槽內，設置各檢測的名稱和螢光基團種類，設定循環條件:42°C 20分鐘；95°C 10分鐘；95°C 10秒，58°C 20秒，採集螢光信號，40個循環；
3)結果分析:根據信噪情況設定和調整基線和閾值，通過收集的螢光曲線和CT值判定結果;
①陽性:當陰性對照無擴增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時，檢測樣本的Ct值(35.0且曲線有明顯的指數增長期時，樣本判為陽性；
②可疑:檢測樣本Ct值大於35.0且小於40.0,重複一次實驗，如果Ct值仍小於40.0，且曲線有明顯的指數增長期，為陽性，否則為陰性；
③陰性:當陰性對照無擴增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時，檢測樣本無Ct值且曲線無明顯的指數增長期時，樣本判為陰性。
[0014]進一步的，上述雙色螢光定量PCR Mix含有以下成份:
2 X雙色螢光定量PCR buffer12.5μ1
H5-F (ΙΟμΜ)?μ?
H5-R (ΙΟμΜ)?μ?
N6-F (ΙΟμΜ)?μ?
N6-R (ΙΟμΜ)?μ?
Η5-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1
Ν6-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1 dNTPs (1mM)?μ?
ddH20 (Rnase free)補足 20μ1。
[0015]本發明的有益效果是:
I)本發明方法通過對所設計的引物和探針做大量的實驗篩選，篩選出一組能夠同時高靈敏、高特異地檢測出待測標本中禽流感病毒H5N6的H5基因和N6基因。由於本發明方法引入了特異性擴增引物和螢光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性不高容易漏診和誤診的問題。同時，本發明試劑盒為根據本發明方法原理製得的試劑盒，可方便地同時檢測出禽流感病毒H5N6的HA基因和NA基因，準確率高。因此該試劑盒具有廣泛的應用前景，適合在各級動物衛生監督機構、疾病控制單位等大規模篩查的推廣應用。
[0016]2)本發明建立的H5N6亞型禽流感病毒雙色螢光定量PCR檢測方法具有特異、敏感、重複性好、快速、費用低廉，一次試驗即可完成H5N6亞型禽流感病毒H5基因和N6基因的檢測等優點，是H5N6亞型禽流感病毒快速初篩及初步確認定型的良好方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為雙色螢光PCR體系中禽流感病毒H5基因檢測的敏感性實驗，從左到右依次為 I X 108、I X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X 12拷貝 /μι 的標準品的擴增結果；
圖2為雙色螢光PCR體系中禽流感病毒Ν6基因檢測的敏感性實驗，從左到右依次為
IX 108、I X 107、I X 16、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷貝 /μι 的標準品的擴增結果；
圖3為雙色方法PCR體系中禽流感病毒Η5基因檢測的特異性實驗結果，AIV-H5N1(右側的曲線)、AIV-H5N6標本(左側的曲線)為陽性，SIV-HlNl、NDV, AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2及不含有病毒的陰性對照品為陰性；
圖4為雙色方法PCR體系中禽流感病毒Ν6基因檢測的特異性實驗結果，AIV-H5N6為陽性，AIV-H5N1、SIV-HlNl、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2 及不含有病毒的陰性對照品為陰性。

【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。
[0019]實施例1檢測禽流感Η5Ν6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒 (I)特異性引物及探針
本發明根據禽流感病毒(Avian influenza virus) H1~H16、N1~N9的核酸序列，分別設計用於檢測禽流感病毒H5基因、N6基因的引物和探針；本發明通過對所設計的引物和探針做大量的實驗篩選，篩選出一組同時對H5N6的H5基因和N6基因具有高靈敏性和高特異性的引物和探針序列，其序列如下:
H5基因的
上遊引物:H5-F:5』 - CACATGCTCAGGACATACTGGA-3』 (SEQ ID N0.1)；
下遊引物:H5-R:5』 - ACACATTGGGTTTCCGAGGA-3』 (SEQ ID N0.2)；
螢光探針:H5-P:5』 -Fam-AGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATC-3』 BHQl (SEQ ID N0.3)，擴增片段長度122bp。
[0020]N6基因的
上遊引物:N6-F:5』 -TATGTAGAACTAATCAGAGGGAGGCC-3』 (SEQ ID N0.4)；
下遊引物:N6-R:5，-CCGTCATGCCAGGACCA-3，(SEQ ID N0.5),
螢光探針:N6-P:5』 -CY5-GTAGCACTCTGTGGATCCAAGGAGCGATT-3』 BHQ2 (SEQ ID N0.6),擴增片段長度116bp。
[0021 ] 用於檢測H5基因的螢光探針報告基團為Fam，淬滅基團為BHQl ;用於檢測N6基因的螢光探針報告基團為CY5，淬滅基團為BHQ2。
[0022](2)禽流感病毒H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:
禽流感病毒H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:
I)雙色螢光定量PCR Mix:
雙色螢光定量PCRMix中含有:
2X雙色螢光定量PCR buffer12.5μ1
H5-F (ΙΟμΜ)?μ?
H5-R (ΙΟμΜ)?μ?
N6-F (ΙΟμΜ)?μ?
N6-R (ΙΟμΜ)?μ?
Η5-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1
Ν6-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1
dNTPs (1mM)?μ?
ddH20 (Rnase free)補足 20μ1 ；
其中，2Χ 雙色螢光定量PCR buffer含有64mM HEPES (pH7.8)、8mM MgCl2、10mM KCl、 4%DMS0、0.2mM 甜菜喊、0.2mg/mL 海藻糖。
[0023]2)病毒RNA提取液；
每2L病毒RNA提取液中含有:異硫氰酸胍250g，重蒸苯酚500ml，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液26.4mL，0.75M檸檬酸鈉溶液17.6mL，2M醋酸鈉溶液50mL，餘量為雙蒸水，pH值為
4.8 ?5.2。
[0024]3)酶混合液:含有Taq酶和逆轉錄酶；
4)陽性質控品:將含有目的基因的重組質粒轉染腺病毒包裝成RNA，經RNA提取，測其A260nm和A280nm吸光度值，計算其濃度並換算成絕對拷貝數，稀釋成1.0X 17拷貝/ μ 1，作為雙色螢光定量PCR的陽性質控品。
[0025]陽性質控品的製備:以提取的禽流感Η5Ν6標本RNA為模版，進行擴增，將產物挑取TA克隆，其中PCR擴增的步驟如下:
反轉錄體系:
Oligo dT Primer (50 μ Μ) I μΙ,?ΝΤΡ Mixture (10 mM ) I μ? 以及總RNA 2μ g,65°C5min,激冷，然後加入 5XPrimeScript Buffer 4M-1 (TAKARA 公司)、RNase Inhibitor (40U/μΙ) 0.5μ1、PrimeScript RTase (200 U/ μ?) ?μ? 和 RNase free H2O 4.5μ1。
[0026]反轉錄條件:
30°C 1min,然後42°C，30min,進行逆轉錄和成cDNA。
[0027]PCR 體系:
1XPCR Buffer 5μ?,TaKaRa Taq (5 υ/μ1)?μ1、dNTP Mixture (各 2.5 πιΜ)4μ1、上述 Η4 和 Η6 上下遊引物(10 μ M)各 0.5μ1、上述 cDNA0.5μ1 和 RNase free Η2039.25μ1,
PCR條件:
按照94°C 3分鐘預變性，94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 45秒，共35個循環，72°C延伸10分鐘。
[0028]反應後取5μ1 PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，將切膠純化的PCR產物與載體連接，重組質粒塗布於培養皿上，轉化感受態DH5 α細胞，挑取陽性菌落抽提質粒。用質粒轉染腺病毒包裝成RNA，作為雙色螢光定量PCR的陽性質控品。
[0029]所得陽性質控品稀釋之後，經RNA提取，測其A260nm和A280nm吸光度值，計算其濃度並換算成絕對拷貝數。
[0030]5)陰性質控品。
[0031]實施例2檢測禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR的檢測方法
(I)提取待測樣品中的病毒RNA
I)標本採集和預處理
本發明方法及試劑盒適用標本類型包括禽類的組織、血清、咽拭子、分泌排洩物等。
[0032]組織標本:無菌條件下取組織約100?200mg左右，置入1.5ml潔淨EP管中，保存待檢。
[0033]血清:用一次性無菌注射器抽取受檢鳥靜脈血3_5ml，留取血清，保存待檢。
[0034]咽及洩殖腔等拭子:用棉拭子取咽或洩殖腔分泌物，將拭子放入盛有1.0ml PBS的離心管中,立即送檢。
[0035]分泌排洩物:無菌條件下採集，保存待檢。採集的標本應該儘快送檢，或者保存於-20。。。
[0036]2) RNA 提取
用上述病毒RNA提取液對標本進彳了核酸提取,步驟為:每300Μ.1標本加入700Μ.1 RNA提取液，室溫靜止Imin ;加入200μ1氯仿,振蕩混勻；12000rpm離心5分鐘,吸取上層水相；力口入等體積異丙醇，振蕩混勻；12000rpm離心5分鐘，棄上清；加入ImL 75% DEPC處理水，振蕩混勻；12000rpm離心5分鐘，棄上清；室溫乾燥1min後，以適量DEPC處理水溶解(視標本濃度和檢測要求，一般為30-50μ1)。
[0037](2 )雙色螢光定量PCR擴增
每個測試反應體系(25μ1)配製如下，雙色螢光定量PCR Mix 20μ1、酶混合液?μ?，瞬時離心，然後加入待檢測樣品的RNA 4μ1 ;同樣按照上述體系設置陽性和陰性對照，加入陽性質控品或陰性質控品4μ1進行擴增。
[0038]將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，設置各檢測的名稱和螢光基團種類(檢測Η5的報告基團選擇FAM,檢測Ν6的報告基團選擇CY5,淬滅基團選擇none),設定循環條件:42°C 20分鐘；95°C 10分鐘；95°C 10秒，58°C 20秒，採集螢光信號，40個循環。
[0039](3)結果分析和判定 O結果分析條件設定:
①設置基線(baseline):根據機型不同，設置3_15循環，6_15循環，特殊情況可對基線適當調整。
[0040]②設置閾值(threshold):以閾值線剛超過陰性對照擴增曲線(無規則的噪音線)的最聞點。
[0041]2)結果判斷
①陽性:當陰性對照無擴增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時，檢測樣本的Ct值(35.0且曲線有明顯的指數增長期時，樣本判為陽性；
②可疑:檢測樣本Ct值大於35.0且小於40.0,重複一次實驗，如果Ct值仍小於40.0，且曲線有明顯的指數增長期，為陽性，否則為陰性；
③陰性:當陰性對照無擴增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時，檢測樣本無Ct值且曲線無明顯的指數增長期時，樣本判為陰性。
[0042]下面對本發明檢測試劑盒及其檢測方法作進一步的效果檢測。
[0043]一、靈敏度實驗
將上述陽性質控品，依次稀釋為 1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103、1.0XlO2、1.0 X 11、1.0 X 10°拷貝/μι，進行靈敏度實驗。
[0044]雙色螢光定量PCR體系中Η5基因檢測的敏感性實驗見圖1，雙色螢光定量PCR體系中Ν6基因檢測的敏感性實見圖2。圖1為雙色螢光PCR體系中Η5基因檢測的敏感性實驗，從左到右依次為 I X 18、I X 107、I X 16、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷貝 /μ? 的標準品的擴增結果。圖2為雙色螢光PCR體系中Ν6基因檢測的敏感性實驗，從左到右依次為I X 108、I X 107、I X 16、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷貝 /μι 的標準品的擴增結果。
[0045]從圖1和圖2中可以看出本試劑盒檢測靈敏度可以達到100 copies/mL,該雙色突光定量PCR的方法敏感度為普通PCR的200倍，精確性優於普通PCR方法。
[0046]二、特異性實驗
根據上述的雙色螢光定量PCR檢測方法，用禽流感病毒H5N6陽性標本(AIV-H7N2)以及其它病毒如豬流感HlNl (SIV-HlNl)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H5N1亞型(AIV-H5N1 )、禽流感病毒H7N2亞型(AIV-H7N2 )、禽流感病毒H7N9亞型(AIV-H7N9 )、禽流感病毒H9N2(AIV-H9N2)、陰性對照進行驗證實驗並對產物進行測序驗證，結果證實，本發明方法及試劑盒特異性好，未出現假陽性，吻合度為100%，實驗結果見圖3和圖4。
[0047]圖3為雙色方法PCR體系中禽流感病毒H5基因的特異性實驗結果，AIV-H5N1、AIV-H5N6 標本為陽性，SIV-H1N1、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2 及不含有病毒的陰性對照品為陰性。
[0048]圖4為雙色方法PCR體系中禽流感病毒N6基因的特異性實驗結果，AIV-H5N6為陽性，AIV-H5N1、SIV-HlNl、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2 及不含有病毒的陰性對照品為陰性。
[0049]三、重複性試驗
將8次獨立重複提取含陽性質控品的RNA分別進行雙色螢光定量PCR擴增，均出現一至的曲線，表明本發明的雙色螢光定量PCR檢測方法具有良好的重複性和穩定性。
[0050]為本領域的專業技術人員容易理解，以上所述僅為本發明專利的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均落在本發明要求的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:病毒RNA核酸提取液、酶混合液、雙色螢光定量PCR Mix、陽性質控品、陰性質控品，其特徵在於:所述雙色螢光定量PCR Mix中含有2 X雙色螢光定量PCR buffer, dNTPs、及禽流感病毒H5N6亞型的H5基因和N6基因的特異性引物及探針，序列分別為: H5基因的
上遊引物:H5-F:5』 - CACATGCTCAGGACATACTGGA-3』 (SEQ ID N0.1)； 下遊引物:H5-R:5，- ACACATTGGGTTTCCGAGGA-3』 (SEQ ID N0.2)；
螢光探針:H5-P:5』 -Fam-AGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATC-3』 BHQl (SEQ ID N0.3)； N6基因的
上遊引物:N6-F:5』 -TATGTAGAACTAATCAGAGGGAGGCC-3』 (SEQ ID N0.4), 下遊引物:N6-R:5，-CCGTCATGCCAGGACCA-3，(SEQ ID N0.5),
螢光探針:N6-P:5』 -CY5-GTAGCACTCTGTGGATCCAAGGAGCGATT-3』 BHQ2 (SEQ ID N0.6)； H5基因的螢光探針報告基團為Fam，淬滅基團為BHQl ;N6基因的螢光探針報告基團為CY5，淬滅基團為BHQ2。
2.根據權利要求1所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於:所述2X雙色螢光定量PCR buffer含有pH為7.8的64mM HEPES、8mM MgCl2、10mM KC1、4%DMS0、0.2mM 甜菜鹼、0.2mg/mL 海藻糖。
3.根據權利要求1所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於:所述病毒RNA提取液中每2L中含有異硫氰酸胍250g，重蒸苯酚500ml，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液26.4mL, 0.75M檸檬酸鈉溶液17.6mL, 2M醋酸鈉溶液50mL，餘量為雙蒸水，pH值為4.8?5.2。
4.根據權利要求1所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於:所述酶混合液中含有Taq酶和逆轉錄酶。
5.一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於:包括以下步驟: 1)提取病毒RNA； 2)雙色螢光定量PCR擴增:將雙色螢光定量PCRMix 20μ1中加入酶混合液?μ?，瞬時離心混勻後，再加入病毒RNA 4μ1 ;放入定量PCR儀器的反應槽內，設置各檢測的名稱和螢光基團種類，設定循環條件:42°C 20分鐘；95°C 10分鐘；95°C 10秒，58°C 20秒，採集螢光信號，40個循環； 3)結果分析:根據信噪情況設定和調整基線和閾值，通過收集的螢光曲線和CT值判定結果; ①陽性:當陰性對照無擴增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時，檢測樣本的Ct值(35.0且曲線有明顯的指數增長期時，樣本判為陽性； ②可疑:檢測樣本Ct值大於35.0且小於40.0,重複一次實驗，如果Ct值仍小於40.0，且曲線有明顯的指數增長期，為陽性，否則為陰性； ③陰性:當陰性對照無擴增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時，檢測樣本無Ct值且曲線無明顯的指數增長期時，樣本判為陰性； 上述所用到的所有試劑均來自權利要求1~4任一所述的檢測試劑盒。
6.根據要利要求5所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於:所述雙色螢光定量PCR Mix含有以下成份: 2X雙色螢光定量PCR buffer12.5μ1 H5-F (ΙΟμΜ)?μ? H5-R (ΙΟμΜ)?μ? N6-F (ΙΟμΜ)?μ? N6-R (ΙΟμΜ)?μ? Η5-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1 Ν6-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1 dNTPs (1mM)?μ?ddH20 (Rnase free)補足 20μ1。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498626SQ201410734968
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】張曉瑋, 徐貴峰 申請人:廣州維伯鑫生物科技有限公司