具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架及其製備方法與應用的製作方法

2023-06-19 20:00:16 2

專利名稱：具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於組織工程材料領域，具體是涉及一種具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架及其製備方法與應用。
背景技術：
關節軟骨損傷是骨科臨床上的常見疾病，關節軟骨由於其特殊的生理學特點，在損傷後一般難以自行修復，臨床上常表現為疼痛、行動困難等症狀，臨床對關節軟骨損傷治療的手段不多，目前對損傷關節軟骨進行治療的方法主要有兩類刺激關節軟骨自身修復和組織細胞移植，總體來說治療效果欠佳，預後不是太理想。
軟骨組織工程為軟骨損傷的治療提供了一種新的方法。軟骨組織工程是通過在體外將軟骨細胞同三維支架進行複合，然後再構建結構和生理特性都同軟骨組織類似的組織，再移植到病損部位的方法來修補病損組織，從而在一定程度來解決軟骨損傷的問題。
採用軟骨組織工程的方式，對移植物在體內的固定是需要解決的一個重要的問題，傳統的軟骨組織的固定通常採用的手術固定移植物的方式，不僅操作困難，時間長，而且易損傷正常組織，影響關節面光滑，創面出血不利於移植物貼覆缺損面，影響癒合及修復組織的增殖轉化。採用化學粘合對植入材料及修復部位都會產生損傷作用，容易導致受損傷部位組織細胞死亡。採用生物粘合劑由於生物製品容易感染或傳染各種疾病並受來源的限制，且其粘合強度也難以令人滿意。因此需要一種能夠解決軟骨體內固定的材料以解決軟骨組織工程說面臨的問題，本發明通過設計一種層狀分布的一體化結構的細胞支架系統，支架的上部結構能同軟骨細胞產生良好的結合，支架下部系統加入能進行骨傳導的生物活性物質，使下層結構能夠同軟骨下骨及骨產生良好的結合，使支架在植入體內短時間內達到同周圍組織良好的固位，從而同時解決軟骨組織工程支架材料的以及體內固定的問題。
該支架材料可以同時提供體外或者體內組織構建時對支架材料的需要，以及構建組織的體內固位的需要。可以用於體外單一軟骨組織構建或者複合軟骨—骨組織構建，也可用於體內單一軟骨組織的構建修復或者複合軟骨-骨組織的構建，以及通過體外方式構建好的單一軟骨組織或者複合的軟骨—骨組織的體內修復時的固定。
以往有採用單獨的高分子為一體化支架，由於軟骨和骨的對生長環境要求的不同特點，單一支架難以同時滿足二種細胞的生長要求，支架只能良好滿足一種細胞的生長需要，在植入體內後難以短期內迅速同周圍複雜的組織產生良好的結合，其固定效果受到影響；也有採用多孔生物陶瓷上吸附一層天然高分子，但吸附上的高分子結合強度不高，過度不連續，存在有機無機的界面，影響細胞的生長遷移，從而影響修復治療效果。
技術方案本發明的目的在於克服已有技術存在的缺點，提供一種具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架。本發明主要採用了層狀複合的技術得到能夠進行生物自固定的複合支架材料，從而解決組織工程軟骨組織的體內固定的問題。
本發明的另一個目的在於提供具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法。
本發明還有一個目的是將具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架應用於關節軟骨修復領域上。
為達到上述發明目的，本發明採取了如下技術方案具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，包括如下技術步驟1、天然高分子溶液(A液)製備不同濃度的A液均可用於製備複合支架。將分子量為3～40萬的天然高分子試劑(膠原、殼聚糖純物質)溶於經消毒處理0.1～2mol/L的稀鹽酸溶液中，製成0.5mg/ml～20mg/ml濃度的溶液，製得A液，放入4℃冰箱保存；2、生物活性粉體(羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物玻璃)懸浮液(B液)的製備將新製備的生物活性無機粉體充分研磨過50～500目篩後，加入經過消毒的純水(電阻大於3兆歐)，在功率為30～600瓦的超聲分散儀器上超聲超聲分散10～90min後，製得濃度為70～95％(Wt)的B液；3、A/B液的混合溶(C溶液)的製備將B溶液加入A溶液中(A與B的質量比範圍是400∶1～1∶1)，充分攪拌後1～20min後，再在功率為30～600瓦的超聲分散儀器上超聲分散10～90min至均勻，可製備出生物活性無機粉體濃度為0％～50％的C液；4、採用第3步的步驟可以配製出濃度值為0％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、10％、20％、30％、40％、50％的C溶液，或在該範圍內的任一濃度的溶液，按照濃度從高到低依次順序加入預先準備好的消毒的模具中，先加最高濃度(或最低濃度)，放入低溫冰箱(-10℃～-120℃)中，待固化後再加入下一濃度的C液，再放入低溫冰箱中固化，重複該步驟可製得2～15層結構的層狀複合支架，層的高低通過加入C液的量來調節；5、待模具中的溶液完全固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理2～24小時，待溶劑完全升華後就得到層狀的複合支架體系。
用上述製備方法可製得生物活性無機粉體在體形中分散良好，支架孔徑在5～500微米的三維複合支架。
用上述製備方法製得的具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架可應用於關節軟骨修復領域。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果在本發明中製備了一體化支架，支架上層結構為生物相容性能良好的膠原材料，並逐漸過渡到高分子—羥基磷灰石的下層，使得下層的羥基磷灰石/高分子複合支架體系具有骨誘導性，可促使與植入人工軟骨相連接骨面的骨組織向軟骨材料內部生長，形成牢固的生物自鎖固定，可以有效防止植入體隨著時間的推移而發生移動錯位等等，大大提高軟骨假體的穩定性和功能，提供的固定方式為生物型固定，非機械型固定，避免了以往組織固定時需要通過縫合或者粘接的方法來固位時帶來的副作用，以及單純結構支架對不同組織細胞得親和性難以協調以及簡單複合一體化支架存在明顯得界面，不利於組織細胞得遷移生長的缺點。
具體實施例方式
以下通過具體實施例來對本發明作進一步說明，但本發明所要求保護的範圍並不局限於實施例所描述的範圍。
實施例1具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，包括如下技術步驟(1)將膠原溶於0.1當量的經消毒處理的稀鹽酸溶液中，製成20mg/ml濃度的溶液，製得A液，放入4℃冰箱保存；(2)將1克新製備的羥基磷灰石無機粉體充分研磨過400目篩後，加入0.5ml消毒超純水，超聲分散30min，製得B液；(3)分別製備不同比例的A/B液的混合溶(C溶液)，製備時將B溶液加入A溶液中，充分攪拌5分鐘後，再超聲分散10min至均勻，採用該法配製出羥基磷灰石含量分別為0％、5％、10％、30％、50％的C液；(4)將配製好的上述C溶液，按照濃度從高到低依次順序加入預先準備好得消毒得模具中，再放入-10℃低溫冰箱中；(5)待模具中得溶液固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理12小時後就得到層狀的複合支架體系。掃面電鏡顯示羥基磷灰石能夠在膠原中均勻分散，得到膠原支架材料的孔徑範圍在100～500微米之間。
實施例2具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，包括如下技術步驟(1)殼聚糖溶於1當量的經消毒處理的稀鹽酸溶液中，製成7mg/ml濃度的溶液，製得A液，放入4℃冰箱保存；(2)將1克新製備的生物活性玻璃無機粉體充分研磨過150目篩後，加入.0.3ml消毒超純水，超聲分散40min，製得B液；(3)分別製備不同比例的A/B液的混合溶(C溶液)，製備時將B溶液加入A溶液中，充分攪拌5分鐘後，再超聲分散10min至均勻，採用該法配製出生物玻璃含量分別為0％、1％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、10％的C液；(4)將配製好的上述C溶液，按照濃度從高到低依次順序加入預先準備好得消毒得模具中，再放入-20℃低溫冰箱中；(5)待模具中得溶液固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理18小時後就得到層狀的複合支架體系。掃面電鏡顯示生物玻璃能夠在膠原中均勻分散，得到膠原支架材料的孔徑範圍在100～500微米之間。
實施例3具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，包括如下技術步驟(1)將膠原溶於0.2當量的經消毒處理的稀鹽酸溶液中，製成10mg/ml濃度的溶液，製得A液，放入4℃冰箱保存；(2)將1克新製備的磷酸三鈣無機粉體充分研磨過300目篩後，加入0.5ml消毒超純水，超聲分散20min，製得B液；(3)分別製備不同比例的A/B液的混合溶(C溶液)，製備時將B溶液加入A溶液中，充分攪拌5分鐘後，再超聲分散10min至均勻，採用該法配製出磷酸三鈣含量分別為0％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、10％的C液；(4)將配製好的C溶液，按照濃度從高到低依次順序加入預先準備好得消毒得模具中，再放入-90℃低溫冰箱中；(5)待模具中得溶液固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理16小時後就得到層狀的複合支架體系。掃面電鏡顯示磷酸三鈣能夠在膠原中均勻分散，得到膠原支架材料的孔徑範圍在10～200微米之間。
實施例4具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，包括如下技術步驟(1)將殼聚糖溶於1.5當量的經消毒處理的稀鹽酸溶液中，製成20mg/ml濃度的溶液，製得A液，放入4℃冰箱保存；(2)將1克新製備的羥基磷灰石無機粉體充分研磨過100目篩後，加入0.5ml消毒超純水，超聲分散20min，製得B液；(3)分別製備不同比例的A/B液的混合溶(C溶液)，製備時將B溶液加入A溶液中，充分攪拌5分鐘後，再超聲分散10min至均勻，採用該法配製出羥基磷灰石含量分別為0％、2％、4％、6％、8％、12％的C液；(4)將配製好的C溶液，按照濃度從高到低依次順序加入預先準備好得消毒得模具中，再放入-60℃低溫冰箱中；(5)待模具中得溶液固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理10小時後就得到層狀的複合支架體系。掃面電鏡顯示羥基磷灰石能夠在膠原中均勻分散，得到膠原支架材料的孔徑範圍在50～300微米之間。
權利要求
1.具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，其特徵在於包括如下技術步驟(1)天然高分子溶液(A液)製備將分子量為3～40萬的天然高分子試劑溶於經消毒處理0.1～2mol/L的稀鹽酸溶液中，製成0.5mg/ml～20mg/ml濃度的溶液，製得A液，放入4℃冰箱保存；(2)生物活性粉體懸浮液(B液)的製備將新製備的生物活性無機粉體充分研磨過50～500目篩後，加入經過消毒的純水，在功率為30～600瓦的超聲分散儀器上超聲超聲分散10～90min後，製得濃度為70～95％(Wt)的B液；(3)A/B液的混合溶(C溶液)的製備將B溶液加入A溶液中，充分攪拌後1～20min後，再在功率為30～600瓦的超聲分散儀器上超聲分散10～90min至均勻，可製備出生物活性無機粉體濃度為0％～50％的C液；A與B的質量比範圍是400∶1～1∶1；(4)採用第3步的步驟可以配製出濃度值為0％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、10％、20％、30％、40％、50％的C溶液，或在該範圍內的任一濃度的溶液，按照濃度從高到低依次順序加入預先準備好的消毒的模具中，先加最高濃度，放入-10℃～-120℃的低溫冰箱中，待固化後再加入下一濃度的C液，再放入低溫冰箱中固化；重複該步驟可製得2～15層結構的層狀複合支架，層的高低通過加入C液的量來調節；(5)待模具中的溶液完全固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理2～24小時，待溶劑完全升華後就得到層狀的複合支架體系。
2.根據權利要求1所述的具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，其特徵在於(1)步驟所述的天然高分子試劑為膠原或殼聚糖純物質。
3.根據權利要求1所述的具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法，其特徵在於(2)步驟所述的生物活性粉體為羥基磷灰石、磷酸三鈣或生物玻璃。
4.權利要求1或2或3所述的具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架的製備方法所製備的具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架。
5.權利要求4所述的具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架在關節軟骨修復領域上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有生物自固定功能的層狀軟骨細胞支架及其製備方法與應用。本發明的製備方法包括如下步驟1.天然高分子溶液(A液)製備；2.生物活性粉體懸浮液(B液)的製備；3.A/B液的混合溶(C溶液)的製備；4.採用第3步的步驟可以配製出不同濃度的C溶液；5.待模具中的溶液完全固化後脫模，再放入冷凍乾燥機中，處理2～24小時，待溶劑完全升華後就得到層狀的複合支架體系。用本發明的方法可製得生物活性無機粉體在體形中分散良好，支架孔徑在5～500微米的三維複合支架。
文檔編號C12N3/00GK1727012SQ200510034869
公開日2006年2月1日 申請日期2005年5月27日 優先權日2005年5月27日
發明者吳剛, 王迎軍, 陳曉峰, 葉建東, 寧成雲, 趙娜如 申請人:華南理工大學