黃瓜CsTTG1基因在調控植物表皮毛、果刺及刺瘤發育中的應用的製作方法

2023-06-19 17:11:33

本發明屬於農業生物技術領域，具體地說，涉及黃瓜CsTTG1基因在調控植物表皮毛、果刺及刺瘤發育中的應用。

背景技術：

黃瓜(cucumis sativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(cucumis)一年蔓生的草本植物。黃瓜具有產量高、效益好等特點，是世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一，佔全國蔬菜面積的10％左右。品質育種在黃瓜育種工作中具有非常重要的地位，其中黃瓜刺瘤是影響其外觀商品品質的重要指標之一。我國的華北類型黃瓜果實上的果瘤和果刺大且數目多，華南類型黃瓜果瘤和果刺大數目較少，歐洲溫室類型黃瓜無果瘤，且果刺小而且少，被稱為「水果」黃瓜，其市場價格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑的黃瓜汙染少，清洗方便，食用衛生，是無公害蔬菜的理想品種。經檢測表明：無瘤少刺黃瓜果肉農藥殘留量比有瘤多刺的黃瓜低27％左右，果皮農藥殘留量低18％左右。而我國目前黃瓜市場佔主導地位的品種多為密刺型，無刺瘤類型的黃瓜品種資源短缺。

表皮毛是大多數植物地上部分表皮組織所特有的一種特化結構，它由表皮細胞發育而來，形態多樣，有絲狀、螺狀、鱗片狀、盾狀、分枝狀、頭狀、塊狀等。按不同的分類方法，可分為單細胞和多細胞的表皮毛，有分支和無分支的表皮毛，有腺體和無腺體的表皮毛，植物表皮毛具有一系列功能，如抵禦UV的傷害，應對乾旱脅迫，降低輻射熱，保護植物免受毒素、草食動物、昆蟲和病原菌的侵害等。通過組織學觀察發現，黃瓜的表皮毛為多細胞、有腺體或無腺體表皮毛，果實上的果刺與葉片上的表皮毛在形態結構上類似，均是由杆和基座 兩部分構成的多細胞無腺體的表皮毛。

模式植物擬南芥的表皮毛是由單個表皮原細胞發育而成的單細胞無腺體表皮毛；在植物表面這種由表皮細胞到表皮毛的分化不是隨機發生的，有著嚴格的調控模式；擬南芥的許多與表皮毛分化相關的突變體的其他性狀並不發生變化。目前，擬南芥表皮毛的發生已經成為研究細胞形態建成的模式系統。擬南芥葉片表皮毛的發育是一個在時空上受到嚴格調控的過程,其發育涉及多個基因的參與。擬南芥表皮毛髮育的正調控因子包括3類蛋白：由TRANSPARENT TESTA GLABRA1(TTG1)基因編碼的WD40類蛋白，由GLABRA1(GL1)、MYB23和MYB5編碼的R2R3 MYB類轉錄因子以及由GLABRA3(GL3)和ENHANCER OF GLABRA3(EGL3)編碼的bHLH蛋白。這3類蛋白組成一個三聚體複合物，決定表皮毛髮育的起始。反向調控因子為由6個功能冗餘的家族基因編碼的R3MYB類轉錄因子，這些基因包括CAPRICE(CPC)、TRIPTYCHON(TRY)、ENHANCER OF TRY AND CPC 1(ETC1)、ETC2、ETC3和TRICHOMELESS1(TCL1)。

前期研究表明，擬南芥表皮毛起始發育模式的核心是TTG1和GL1分別與GL3/EGL3結合，形成一個GL1-GL3/EGL3-TTG1蛋白複合體驅動下遊基因GL2的表達，使表皮細胞分化成為表皮毛。當TTG1發生突變時，ttg1突變體表現為一種植株表面光滑無毛的表型。這表明TTG1在擬南芥表皮毛的啟動中發揮著重要作用。

黃瓜、菸草、矮牽牛和番茄的表皮毛是多細胞的，而擬南芥表皮毛是單細胞的。前期研究發現，黃瓜TTG1基因可以互補擬南芥ttg1突變體的表型；棉花TRY基因可以抑制菸草葉片表皮毛的發育；擬南芥GL1基因的過表達並不影響菸草表皮毛的形成；玉米中的R-like bHLH基因與玉米表皮毛的形成無關，它的過表達卻可以使擬南芥的葉和莖上的表皮毛數量增加，但對菸草、矮牽牛和番茄表皮毛的形成卻沒有 影響。這些研究結果說明單細胞和多細胞表皮毛的形成機制有著相似之處，但又不盡相同。與單細胞表皮毛相比，多細形成機制可能更為複雜，還需要在更多的其它植物種類上研究分析表皮毛形成的機制。

目前有關黃瓜果刺發育的相關基因及其應用研究的還很少，已報導的基因功能都不夠專一，不僅影響黃瓜刺瘤的發育，且影響黃瓜植株地上所有器官表面的表皮毛的形成，往往也影響了植株的抗性，而特異性影響黃瓜果實上表皮毛的起始和發育的基因尚未見報導。

技術實現要素：

本發明的目的是提供黃瓜CsTTG1基因在調控植物表皮毛、果刺及刺瘤發育中的應用。

為了實現本發明目的，本發明提供黃瓜CsTTG1基因在調控植物表皮毛、果刺及刺瘤發育中的應用，其中所述黃瓜CsTTG1基因的核苷酸序列為：

i)Seq ID No.1所示的核苷酸序列；

ii)在嚴格條件下與Seq ID No.1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；或

iii)與i)或ii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；

所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，並用該溶液洗膜。

前述的應用，所述植物為雙子葉植物。優選地，所述雙子葉植物為黃瓜。

前述的應用包括將黃瓜CsTTG1基因轉入目的植物中，得到與所述目的植物相比，表皮毛、果刺及刺瘤發育發生變化的轉基因植物。

前述應用具體為：在目的植物中過表達所述黃瓜CsTTG1基因，使轉基因植物的表皮毛、果刺及刺瘤數目增加。

優選地，過表達使用的表達載體為pCAMBIA1305.1。將黃瓜 CsTTG1基因插入載體pCAMBIA1305.1的多克隆位點間，即得重組過表達載體CsTTG1-pCAMBIA1305.1。

所述果刺發育發生變化體現為與目的植物相比，含有重組過表達載體CsTTG1-pCAMBIA1305.1的轉基因黃瓜果實上的果刺和有腺體表皮毛的數目明顯增加，果刺杆的長度明顯變長，杆的細胞組成個數明顯增多，且杆上單個細胞的平均長度也明顯增加，另外，果刺的基座明顯變大，果瘤也發生了明顯的變化。實驗證明CsTTG1基因的過量表達可引起黃瓜果刺的大量增加，單個果刺的性狀也會發生變化，且可使黃瓜中果瘤相關基因CsTU的表達量顯著提高。

本發明還提供黃瓜CsTTG1基因在黃瓜品質改良中的應用。

前述的應用包括利用基因工程的方法，通過幹擾或沉默黃瓜CsTTG1基因的表達，或者從黃瓜中敲除黃瓜CsTTG1基因，從而獲得果刺數目減少或無刺型黃瓜。

前述應用具體為：通過構建特異性靶向黃瓜CsTTG1基因的重組幹擾表達載體，並採用農桿菌介導的方法，將構建的重組幹擾表達載體轉入黃瓜中，獲得品質改良的轉基因黃瓜。

優選地，所述重組幹擾表達載體的出發載體為pFGC1008。

更優選地，所述重組幹擾表達載體的構建方法如下：

將黃瓜CsTTG1基因如Seq ID No.3所示DNA片段作為幹擾片段，設計一對引物F和R，在引物上分別加上不同的酶切位點擴增正義片段和反義片段，正義片段兩端引入酶切位點SpeI和BamHI，反義片段兩端引入酶切位點AscI和SwaI，然後將正、反義片段分別連接到載體pFGC1008的GUS兩端，即構建獲得重組幹擾表達載體CsTTG1-pFGC1008。含有重組幹擾表達載體CsTTG1-pFGC1008的轉基因植物果實上果刺呈現一種片狀不均勻減少的現象。

引物F和R序列如下：

F：5』-TCTTGGCGACCTACGAATC-3』

R：5』-GCTGTTGTTGAGGAGGGAGA-3』

本發明通過構建黃瓜CsTTG1基因的過表達載體和幹擾載體，並將其轉入黃瓜中，證明CsTTG1基因的過量表達可引起黃瓜果實上果刺的大量增加以及果刺細胞數目的變化，而幹擾CsTTG1基因的表達可引起黃瓜果實上果刺數目的減少。這表明黃瓜CsTTG1基因與擬南芥TTG1基因存在一定的功能冗餘性，在黃瓜上具有其功能的特異性，表現為其表達量的變化僅影響果實上表皮毛的起始，對黃瓜植株地上其他部位表皮毛的發生均不發生作用；其表達量的變化既改變了果刺的密度，也改變了果刺的細胞個數和單個細胞的大小。本發明首次驗證了黃瓜CsTTG1基因的功能，對於黃瓜品質的改良具有重要作用。

附圖說明

圖1為本發明實施例2中黃瓜過表達轉基因黃瓜株系鑑定及其表型觀察結果。

圖2為本發明實施例2中黃瓜過表達轉基因株系單個果刺杆長度、杆單個細胞平均長度和基座大小的統計結果。

圖3為本發明實施例2中幹擾表達轉基因黃瓜株系鑑定及其表型觀察結果。

圖4為本發明實施例2中黃瓜果刺相關基因CsTTG1正調控果瘤相關基因CsTu的表達量。

具體實施方式

以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照製造廠商說明書建議的條件。

實施例1黃瓜CsTTG1基因的克隆

1.1材料

以黃瓜3407、黃瓜3413(由中國農業大學農學與生物技術學院提 供)為試材，黃瓜3407表皮毛明顯、刺瘤密集，而黃瓜3413表皮毛稀少、刺瘤不明顯。將黃瓜種子播於日光溫室中，進行普通的栽培管理，待植株開始結瓜時，取雌花芽液氮速凍，存於-80℃冰箱保存，備用。

1.2總RNA的提取與cDNA合成

1.2.1總RNA的提取

採用柱式植物RNAout試劑盒(購自北京天恩澤基因科技有限公司，產品目錄號為71203)提取黃瓜果實的總RNA，並用DNase去除RNA樣品中殘留的DNA。步驟如下：

(1)在研缽中加入約200mg黃瓜果實，加入液氮研磨至粉末狀。將研磨物轉移至乾淨無RNA酶的1.5ml塑料離心管，加入1ml細胞裂解液(試劑盒自帶)，充分振蕩混勻。

(2)在離心管中加入300μl的去蛋白液(試劑盒自帶)和200μl自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。室溫12000rpm離心3-5min，兩相間有約5-10mm厚的細胞破碎物。

(3)將上清液(約600μl)轉移到另一乾淨的1.5ml塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質和其他雜質，避免觸及或吸取。最好留下100μL上清液不取。加入等體積的漂洗液，充分顛倒混勻。將一半的溶液轉移到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1min，棄穿透液。

(4)將剩下的一半溶液轉移到同一離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1min，棄穿透液。

(5)加700μl通用洗柱液，12000rpm室溫離心1min，棄穿透液。加300μl通用洗柱液，12000rpm室溫離心1min，棄穿透液。12000rpm室溫離心1min。此步十分重要，否則殘留的乙醇會影響RNA的使用。往吸附柱的中央加入50μl DNAase反應液，室溫靜置10-15min，加入500μl通用洗柱液，12000rpm室溫離心1min，棄穿透液。12000rpm 室溫離心1min。

(6)將離心吸附柱轉移到RNase-free收集管中，加入50μl RNA洗脫液，室溫放置1-2min。12000rpm室溫離心1min，離心管中溶液即為RNA樣品，存放於-80℃待用。

1.2.2cDNA第一鏈的合成

以1μg黃瓜果實RNA為模板，利用RTase合成cDNA第一鏈。反轉錄操作參照試劑盒說明進行[試劑盒名稱：1st Strand cDNA Synthesis Kit(50次量)；北京六合通經貿有限公司；產品目錄號：D6110A]。

cDNA第一鏈合成後於-20℃保存備用。

1.3黃瓜CsTTG1基因的克隆

對黃瓜的一對野生型和突變體材料進行轉錄組測序，根據測序結果的分析和基因的注釋，選擇其中的一個候選基因進行研究，暫命名為CsTTG1基因，根據CsTTG1的基因ID(Csa4G097650)在黃瓜基因組資料庫(http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp)中找到該基因的CDS序列，根據其CDS全長序列設計引物：

正向引物：5』-ATGGAACACGCAGCCTCCAG-3』(Seq ID No.5)

反向引物：5』-TCAAACTTTCAAAAGCTGCATTTTG-3』(Seq ID No.6)

以cDNA為模板，利用上述正、反向引物，通過PCR擴增獲得黃瓜CsTTG1基因。黃瓜CsTTG1基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，其編碼蛋白的胺基酸序列如Seq ID No.2所示。

PCR擴增反應體系：5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus)10.0μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4.0μL，正向引物(10μM)1.0μL，反向引物(10μM)1.0μL，模板cDNA 2.0μL，Prime STAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μL，無菌去離子水補足至總體積50.0μL。

PCR擴增程序：95℃預變性3min；95℃變性30sec，55℃復性30 sec，72℃延伸80sec，35個循環；72℃延伸5min。

1.4載體構建

1.4.1重組過表達載體的構建

使用的表達載體為pCAMBIA1305.1，選用酶切位點為BgI II和SPe I。在目的基因的ORF區兩端設計引物，並在引物(Seq ID No.5和6)5'端分別加上相應的酶切位點和保護鹼基，以黃瓜cDNA為模板進行PCR擴增。

PCR擴增反應體系：5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus)10.0μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4.0μL，正向引物(10μM)1.0μL，反向引物(10μM)1.0μL，模板cDNA 2.0μL，Prime STAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μL，無菌去離子水補足至總體積50.0μL。

PCR擴增程序：95℃3min；95℃10sec，54℃30sec，72℃80sec，共30個循環；72℃5min。

回收PCR擴增產物，與載體pCAMBIA1305.1分別用特異的限制性內切酶酶切。凝膠回收酶切產物，然後用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，PCR鑑定後的陽性菌液送深圳華大基因科技有限公司測序，測序正確則成功構建重組過表達載體，提取質粒(CsTTG1-pCAMBIA1305.1)備用。

1.4.2重組幹擾表達載體的構建

將黃瓜CsTTG1基因如Seq ID No.3所示DNA片段作為幹擾片段，設計一對引物F和R(Seq ID No.3和4)，在引物上分別加上不同的酶切位點PCR擴增正義片段和反義片段，正義片段兩端引入酶切位點SpeI和BamHI，反義片段兩端引入酶切位點AscI和SwaI，然後將正、反義片段分別連接到載體pFGC1008的GUS兩端，轉化大腸桿菌後，經PCR和測序鑑定獲得構建成功的重組幹擾表達載體。提取質粒(CsTTG1-pFGC1008)備用。

PCR擴增反應體系和程序同1.4.1中的描述。

實施例2轉基因植物的獲得及檢測

2.1黃瓜的遺傳轉化

2.1.1重組表達載體轉化農桿菌

將電轉儀打開預熱，同時預冷電轉杯若干。將80μl的大腸桿菌感受態細胞C58置於冰上融化，分別加入1-2μl構建好的重組過表達載體CsTTG1-pCAMBIA1305.1和重組幹擾表達載體CsTTG1-pFGC1008，以及兩個重組載體的空載體(對照)，輕彈混勻，轉移到電轉杯的底部。將電轉杯放在電轉儀的座上，電擊。快速加入1mL不含抗生素的液體YEB培養基至電轉杯中，輕柔吹打懸浮細胞。將細胞吸出至Eppendorf管中，28℃緩慢振蕩培養1h。吸取含有過表達重組質粒的菌液100μl加到含有卡那黴素和利福平的YEB固體培養基上，含有幹擾重組質粒的菌液吸取100μl加到含有氯黴素和利福平的YEB固體培養基上，分別用無菌的彎頭玻棒輕輕將細胞均勻塗開，室溫放置待平板表面乾燥後，用封口膜封好平板。倒置平板，28℃培養36-48hr。PCR鑑定篩選陽性菌，PCR鑑定所用的引物為：

重組過表達載體CsTTG1-pCAMBIA1305.1的PCR鑑定用引物見Seq ID No.5和6。

重組幹擾表達載體CsTTG1-pFGC1008的PCR鑑定用引物見Seq ID No.7和8。

結果分別獲得了含有過表達空載體pCAMBIA1305.1、幹擾空載體pFGC1008，以及構建成功的重組過表達載體CsTTG1-pCAMBIA1305.1和重組幹擾表達載體CsTTG1-pFGC1008的陽性農桿菌。

2.1.2黃瓜轉化

利用Wang等優化的農桿菌介導的黃瓜遺傳轉化技術，經外植體製備、農桿菌侵染和共培養、不定芽的誘導分化、不定芽的伸長和生根、再生植株的馴化、PCR鑑定等步驟獲得轉基因陽性植株。

2.2轉基因黃瓜植株的表型檢測

2.2.1螢光定量PCR檢測

(1)對所有轉基因黃瓜植株取雌花芽進行RNA提取及cDNA合成，同實施例1中的描述。

(2)螢光定量分析所用試劑盒為SYBR Premix Ex Taq(TaKara，DRR041S)，螢光定量PCR儀為ABI 7500，設計如下引物：

CsTTG1-F:5′-CTCCTCAACAACAGCAAAACCA-3′(Seq ID No.9)

CsTTG1-R:5′-CCCCAAGCAATGTCATAAACC-3′；(Seq ID No.10)

螢光定量PCR的反應體系為：

擴增程序為：95℃,30sec；95℃,5sec；60℃,40sec,40個循環。以UBI基因為內參，利用2-△△Ct算法計算各基因表達量變化。

結果如圖1E和圖3B所示，共得到15個過表達CsTTG1基因的轉基因黃瓜株系，10個幹擾轉基因黃瓜株系。

2.2.2過表達基因CsTTG1植株的表型檢測

待上述轉CsTTG1基因黃瓜植株、轉空載體對照植株及野生型對照植株長至結果期時，取不同發育階段的果實觀察其表型，結果如圖1所示：CsTTG1基因過表達的轉基因株系黃瓜果實上的果刺的數量明顯比轉空載體的對照植株多，且果刺明顯變長，基座也明顯的變大(圖1中A，B，C)。這種表型的變化與CsTTG1基因過表達的量曾正相關性，當CsTTG1基因在稀刺品種(3413)中過表達，使其表達量達到 密刺品種(3407)中CsTTG1基因本身的表達量時，稀刺品種(3413)的過表達株系中果實上果刺的表型和密刺品種(3407)基本一致(圖1中D和E)。

統計過表達轉基因黃瓜株系ox-Line1、ox-Line2和ox-Line3中黃瓜開花當天果實上果刺杆的細胞個數，結果如表1所示。

表1 空載體對照與ox-Line1、2和3開花當天黃瓜果實上果刺杆細胞個數統計結果

此外，對ox-Line1、2和3三個過表達轉基因株系開花當天黃瓜果實上單個果刺的杆長度和基座的大小進行了量化統計，結果如圖2所示，過表達株系中果刺的杆變長，且基座變大。同時對其杆上單個細胞的平均長度進行了量化，杆上單個細胞的平均長度變長。

另外，當CsTTG1過量表達時，不僅果刺的表型發生變化，果瘤也會變大，對果瘤相關基因CsTu表達量進行分析，引物設計如下：

CsTU-F:5′-ATGAAGCTCGTCGGCATGAGTGGG-3′(Seq ID No.11)

CsTU-R:5′-TGGATTGCCACTGAGTTGCCTCTG-3′(Seq ID No.12)

螢光定量PCR的反應體系、程序和算法同2.2.1中的描述。結果如圖4所示，結果顯示黃瓜基因CsTTG1對果瘤發育相關基因CsTu具有正調控作用。這也間接證明了果刺的決定基因對果瘤的發育具有上位性的調控作用。

2.2.3幹擾表達植株的表型檢測

待上述轉CsTTG1-pFGC1008黃瓜植株、轉空載體對照植株及野生型對照植株植株長至結果期時，取不同發育階段的果實觀察其表型，結果如圖3所示，幹擾轉基因植物果實上果刺呈現一種片狀不均勻減 少的現象。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。

參考文獻

Wang,H.,Sui,X.,Guo,J.,Wang,Z.,Cheng,J.,Ma,S.,Li,X.,&Zhang,Z.2014.Antisense suppression of cucumber(Cucumis sativus L.)sucrose synthase 3(CsSUS3)reduces hypoxic stress tolerance.Plant,Cell and Environment,37(3):795-810.