基於adp檢測的發光磷酸轉移酶或atp水解酶測定的製作方法

2023-06-19 17:10:11

專利名稱：基於adp檢測的發光磷酸轉移酶或atp水解酶測定的製作方法
基於ADP檢測的發光磷酸轉移酶或ATP水解酶測定相關申請的交叉引用本申請要求於2008年7月22日申請的美國專利申請順序號61/082，775和2009 年4月17日申請的美國專利申請順序號61/170，308和2009年5月四日申請的美國專利申請順序號61/182，372的權益，這些申請的公開內容通過引用結合到本文中因為轉移酶、尤其是激酶的生理相關性、多樣性和普遍存在，它們成為生化和醫學研究中最重要並被廣泛研究的一類酶家族。研究表明蛋白激酶和脂質激酶是許多細胞功能的關鍵性調節劑，所述功能包括信號轉導、轉錄調節、細胞運動、細胞分裂以及細胞對藥物、 毒素和病原體的反應。蛋白激酶在多種細胞事件的調節中起到至關重要的作用。這些酶的作用是通過將磷酸殘基轉移至某些胞內多肽的胺基酸，使這些蛋白質底物活化並發動包括生長、分化和細胞分裂在內的活化控制事件級聯。在腫瘤生物學領域已經深入研究了蛋白激酶。據信， 細胞中激酶受控活性的缺失導致形成腫瘤。製藥業一直在研究靶向這些激酶的藥物，以有助於治療各種腫瘤。有超過500種蛋白激酶(大約佔2-2. 5%的人類基因組)涉及細胞功能的調節。它們以跨膜酶和胞質溶膠酶形式存在，並且它們使絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸胺基酸殘基磷酸化。根據這樣的底物特異性，可將激酶分為2組絲氨酸/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶。絲氨酸/蘇氨酸激酶包括環狀AMP和環狀GMP依賴型蛋白激酶、鈣和磷脂依賴型蛋白激酶、鈣和鈣調蛋白依賴型蛋白激酶、酪蛋白激酶、細胞周期蛋白激酶等。這些激酶通常是胞質酶或可能通過錨定蛋白與特定細胞部分締合。酪氨酸激酶使酪氨酸殘基磷酸化。這些特定激酶的存在數量非常少，但在細胞調節中卻起到同樣重要的作用。這些激酶包括某些可溶性酶例如蛋白激酶src家族和生長因子受體，例如表皮生長因子受體、胰島素受體、血小板衍生的生長因子受體等。研究表明，許多酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其受體結構域位於胞外，而其激酶結構域在胞內。脂質激酶在胞內信號轉導中也起到重要作用，可以分為4大類。示例性的脂質激酶包括PI3激酶和磷脂醯肌醇4-激酶。糖激酶和其它磷酸轉移酶在細胞代謝、增殖和細胞凋亡中也起到主要作用。因為磷酸化事件涉及如此之多的細胞功能和疾病，所以鑑定激酶活性就特別重要。目前用於檢測激酶活性的測定類型包括螢光共振能量轉移(FRET)測定、螢光偏振(FP) 測定和基於放射性的測定例如閃爍親近測定(SPA)。用於檢測激酶活性的FRET測定是利用與螢光分子連接的蛋白質或肽底物和另一螢光標記的探針。這兩個螢光分子僅當底物被磷酸化並被標記探針識別後，才會鄰近。因此，當被激酶磷酸化時，標記的能量通過共振傳遞給螢光分子(受體)。能量從較高能量供體螢光團直接傳遞到較低能量受體分子的能力，導致受體分子的敏化螢光並同時猝滅供體螢光。在此情況下，供體螢光因鄰近受體被「猝滅」， 而供體能量以非放射性方式傳遞給受體。依照福斯特方程，能量轉移效率取決於供體和受體生色團之間的距離。在大多數情況下，在距離大於100埃時，未觀察到FRET，因此FRET的存在是鄰近的良好指示。因此，在利用與螢光分子連接的蛋白質或肽底物和另一螢光標記的探針而檢測激酶活性的FRET測定中，如果激酶被抑制，兩個螢光分子仍然分開，則不發生 FRET。基於FRET的測定有很多缺陷，包括大量的假命中，例如因為對所測化合物的螢光幹擾、狹窄的動態範圍和測定所用抗體相關的表現情況。FP測定是基於高親和力結合劑(例如抗體、螯合原子等)與螢光標記分子的結合。 例如，與磷酸化螢光標記肽結合、而不與非磷酸化螢光標記肽結合的抗體可用於激酶測定。 其它方法利用與ADP(其它激酶反應的產物)結合的螢光標記抗體監測激酶活性。當螢光標記被平面偏振光激發，就以同一偏振面發射光，只要螢光標記在整個激發態保持穩定(激發態的持續時間隨螢光團的不同而不同，對於螢光素(fluoroscein)為4毫微秒)。如果偏振光用於激發螢光團，可同時在與偏振面平行的平面(激發麵)和與偏振面垂直的平面上監測發射光強度。FP測定需要能夠以高特異性與螢光標記分子結合的高親和性結合劑，例如抗體。當使用抗體時，抗體與特異性螢光標記分子例如肽結合所耗費的時間和成本優化是需要的。另外，在FP測定中，對於磷酸化蛋白和其它反應組分例如脂質和去垢劑而言，具有幹擾偏振的潛力。採用放射性標記的激酶測定包括SPA。在SPA中，修飾的配體特異性分子或配體捕獲分子偶聯於螢光微球體(fluoromicrosphere)，其是灌注有物質的固相支持顆粒或小珠， 所述物質當被放射性標記分子激發時可發射能量。當加入到在含有非磷酸化肽的混合物中的修飾配體例如放射性標記的磷酸肽時，僅磷酸肽被捕獲到螢光微球體上，使任何結合的放射性標記肽足夠鄰近，以允許輻射能發射而激化螢光微球體並發射光能。如果螢光微球體的濃度是優化的，僅來自與靶標結合的放射性標記配體的信號被檢測到，而無需對結合配體和游離配體進行任何分離。可在液體閃爍計數器上測量所發射的光能水平，並且該水平表示配體與靶標的結合程度。SPA需要螢光微球體因重力或經離心而沉降，為測定增加了額外的步驟和時間。另外，因為該測定所用的高能量，所以大部分放射性穿過而未被螢光微球體捕獲。也已經開發了其它方法用於檢測激酶活性，所述方法是基於發光檢測，無論是生物發光還是化學發光。通常，這些方法依賴於特異性底物和抗體、微晶片和螢光標記探針的使用、樣品中的底物濃度、多步驟和試劑的使用(美國專利號6，599，711)或局限於特定激酶(Sala-Newby 等，1992)。許多目前可用的激酶測定使用在反應期間消耗大量ATP的酶而運行良好，但對檢測ATP量的少量變化而言則不夠靈敏，這限制了具有低ATP周轉率的激酶，例如生長因子受體激酶。相比之下，可分析這類酶的可用的測定對於激酶亞類是特異性的和/或不夠敏感而不能用於大範圍的激酶。發明概述本發明提供用於測定或檢測酶活性的組合物和方法，所述酶包括磷酸轉移酶例如激酶(例如蛋白激酶、脂質激酶和糖激酶)和ATP水解酶(例如ATP酶，例如HSP90)，所述方法使用ATP作為底物而形成ADP作為產物通過監測ADP的變化來測定或檢測酶活性。為了監測ADP的形成，ADP轉化為ATP並使用ATP依賴型生物發光反應例如螢光素酶/螢光素反應，以檢測ATP。在需要ATP的生物發光反應例如螢光素酶介導的反應，以及通過核苷酸激酶例如ADP到ATP轉化酶催化的ADP到ATP的轉化之前，在激酶或ATP酶反應之後的 ATP剩餘量基本上減少到例如是所形成的ADP或反應混合物最初存在的ATP量的小於2%、 1 %,0. 75%,0. 5 %,0. 25 %,0. 1 %,0. 075 %,0. 05 %,0. 025 %,0. 02 %,0. 01 %,0. 001 0. 0001%或以下，或消除。在一個實施方案中，使用腺苷酸環化酶例如細菌腺苷酸環化酶以將剩餘ATP轉化為cAMP，cAMP是對ADP轉化酶反應或ATP依賴型生物發光反應沒有作用或沒有明顯作用的一種產物。一旦剩餘ATP減少到最少量或消除時，使用能將ADP轉化為 ATP的酶例如腺苷酸激酶(肌激酶)、肌酸激酶或丙酮酸激酶等，將激酶或ATP酶反應中所形成的ADP轉化為ATP。在某些實施方案中，在將溶液中的ADP轉化為ATP或進行生物發光反應之前，將ATP轉化為非ADP產物的酶的活性受到抑制。當在此情況下，將ATP轉化為非 ADP產物的酶將不會干擾從ADP生成ATP或用生物發光反應來檢測ATP。然後使用由生物發光反應所生成的光來檢測新形成的ATP，例如用發光計來測量。一般而言，將ADP轉化為 ATP、再將ATP轉化為光的方法包括將包含生物發光產生酶、生物發光底物、ADP到ATP轉化酶和任選(如果需要的話)ADP到ATP轉化酶的底物的組合物，加入到具有由激酶或ATP 酶反應所產生的ADP的反應混合物中；所述生物發光產生酶例如螢光素酶例如天然或重組螢光素酶例如螢火蟲或叩頭蟲的螢光素酶，所述生物發光底物例如作為螢光素酶底物的螢光素或螢光素衍生物，所述ADP到ATP轉化酶例如激酶。在使用前，通過將包含並非螢光素酶的試劑的溶液加入到凍幹螢光素酶中，來混合所述組合物。在另一個實施方案中，在使用前，通過將包含並非螢光素酶和螢光素或螢光素衍生物的試劑的溶液加入到凍幹螢光素酶和凍幹螢光素或其衍生物中，來混合所述組合物。本領域技術人員知道，生物發光反應表明溶液中ADP的存在與否或者提供溶液中 ADP的度量。當需要檢測溶液中的ADP時，可將生物發光反應結果與一個或多個標準或對照反應進行比較。本發明也提供用於檢測樣品中磷酸轉移酶活性例如激酶活性或ATP水解酶活性例如ATP酶活性的組合物和試劑盒。在一個實施方案中，本發明提供組合物或試劑盒，所述組合物或試劑盒包含將ATP轉化為非ADP底物的分離的酶，例如將ATP轉化為cAMP的腺苷酸環化酶和焦磷酸酶。所述試劑盒還可包含一種或多種激酶、激酶的底物、將ADP轉化為 ATP的酶例如丙酮酸激酶、可被將ADP轉化為ATP的酶使用的磷酸供體例如磷酸烯醇式丙酮酸、螢光素酶和/或螢光素酶的底物例如螢光素或其衍生物。所述試劑盒可任選包含將ATP轉化為ADP的磷酸轉移酶或ATP水解酶的一種或多種抑制劑、或有效量的腺苷酸環化酶活化劑。可用於本文所述的方法、試劑盒或組合物的示例性的腺苷酸環化酶包括但不限於細菌腺苷酸環化酶，例如來自以下細菌的那些百日咳博德特氏菌(Bortedella pertussis)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、大腸桿菌(Escherchia coli)、 蛭弧菌(Bdellovibrio spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、耶爾森菌(Yersinia spp.)、歐文氏菌 (Erwinia spp.)、腸桿菌(Enterobacter spp.)或希瓦氏菌(Shewanella spp.)或具有腺苷酸環化酶活性的全長細菌腺苷酸環化酶的片段，例如具有腺苷酸環化酶活性的細菌腺苷酸環化酶的重組片段(例如參見圖4)；真核生物腺苷酸環化酶，例如鈣調蛋白激活的真核腺苷酸環化酶；藻類腺苷酸環化酶，例如鈍頂螺旋藻(Spirulina platenis)腺苷酸環化酶；豬、非人類靈長類、狗、牛、嚙齒類或人類的腺苷酸環化酶，例如ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、 ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9 或 ADCYlO 或腺苷酸環化酶同種型 I、III 和 VIII (其受 Ca2+/鈣調蛋白的刺激)或同種型V和VI (其被Ca2+以鈣調蛋白非依賴型方式抑制)，或其具有腺苷酸環化酶活性的片段。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒包含一種或多種激酶抑制劑。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒包含一種或多種ATP酶抑制劑。在另一個實施方案中，如果所述組合物不包含磷酸轉移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的抑制劑時，可通過其它方式使磷酸轉移酶或ATP水解酶的活性失活，例如在添加腺苷酸環化酶之前加熱。然而，可無需讓磷酸轉移酶或ATP水解酶失活，以便進行本發明。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒包含分離的細菌腺苷酸環化酶，例如可被活化劑例如鈣調蛋白活化的一種酶。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒包含分離的鈣調蛋白刺激的細菌腺苷酸環化酶、星孢素、焦磷酸酶和任選鈣調蛋白。合適的焦磷酸酶包括酵母焦磷酸酶。在另一個實施方案中， 所述組合物或試劑盒包含一種或多種激酶或ATP酶的抑制劑、焦磷酸酶和腺苷酸環化酶活化劑。在一個實施方案中，所述試劑盒可包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含一種或多種激酶或ATP酶的抑制劑、焦磷酸酶和腺苷酸環化酶活化劑，而所述第二組合物包含腺苷酸環化酶。所述試劑盒可在單獨容器中裝有各種試劑或可在容器中合併兩種以上試劑。還提供包含腺苷酸環化酶抑制劑和任選分離的將ADP轉化為ATP的ADP到ATP轉化酶的組合物或試劑盒，所述抑制劑即ATP結合位點競爭者例如ATP類似物，或催化結構域抑制劑例如PMEA(9-(2-磷醯甲氧基乙基)-腺嘌呤)或PMEApp類似物。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒包含活化細菌腺苷酸環化酶的抑制劑，例如鈣調蛋白活化的細菌腺苷酸環化酶或其具有腺苷酸環化酶活性的片段的抑制劑，以及至少一個ADP到ATP轉化酶、例如腺苷酸激酶、肌酸激酶或丙酮酸激酶。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒包含腺苷酸環化酶抑制劑和分離的ADP到ATP轉化酶的底物。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒還包含分離的ADP到ATP轉化酶。在一個實施方案中，所述組合物或試劑盒還包含生物發光酶例如螢光素酶和生物發光酶的底物例如D-螢光素。另外，本發明提供這樣的組合物所述組合物包含ADP到ATP轉化酶、包括去垢劑在內的並能使腺苷酸環化酶失活的有效量的用於生物發光酶介導反應的試劑以及任選的 ADP到ATP轉化酶的底物。還提供在包含ADP和ATP的混合物中將ATP轉化為cAMP和PPi或cAMP和Pi的方法。在一個實施方案中，所述方法包括提供用於將ATP轉化為ADP的磷酸轉移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的第一反應混合物，所述第一反應混合物包含ATP和懷疑具有磷酸轉移酶或ATP水解酶的樣品；並且使第一反應混合物與一定量的分離的活性腺苷酸環化酶和焦磷酸酶以及任選的磷酸轉移酶或ATP水解酶的一種或多種抑制劑接觸，其數量能有效得到第二反應混合物，所述第二反應混合物包含cAMP、Pi和如果所述樣品中存在磷酸轉移酶或ATP水解酶的話，ADP0在一個實施方案中，所述方法包括提供用於將ATP轉化為ADP的激酶或ATP酶的第一反應混合物，所述第一反應混合物包含ATP和懷疑具有激酶或ATP酶的樣品；並且使第一反應混合物與一定量的分離的活性腺苷酸環化酶和任選的激酶或ATP酶的一種或多種抑制劑接觸，其數量能有效得到第二反應混合物，所述第二反應混合物包含cAMP、PPi和如果所述樣品中存在激酶或ATP酶的話，ADP。所產生的Pi或PPi 的量基本上不抑制ADP到ATP轉化酶反應或ATP依賴型生物發光酶反應。在一個實施方案中，使所述第二反應混合物與腺苷酸環化酶抑制劑、ADP到ATP轉化酶、任選ADP到ATP轉化酶的底物、還任選生物發光酶及其底物接觸，而得到第三反應混合物。因此，在加入生物發光酶及其底物例如螢光素酶和螢光素之後，或者在腺苷酸環化酶抑制劑和ADP到ATP轉化酶的同時，或者在加入腺苷酸環化酶抑制劑和ADP到ATP轉化酶之後，檢測第三反應混合物中的發光。在一個實施方案中，將用於將ADP轉化為ATP的反應混合物和生物發光酶合併在一個溶液中。對照反應包括不含磷酸轉移酶或ATP水解酶的反應。另外，本發明提供用於將ATP轉化為ADP的磷酸轉移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的調節劑的鑑定方法。所述方法包括提供第一反應混合物，所述混合物包含一種或多種測試劑、一種或多種將ATP轉化為ADP的磷酸轉移酶或ATP水解酶例如一種或多種分離的激酶或細胞表達的重組激酶或其裂解物、以及ATP ；使第一反應混合物與一定量的至少一種分離的活性腺苷酸環化酶和至少一種焦磷酸酶、和任選一種或多種磷酸轉移酶或 ATP水解酶的一種或多種抑制劑接觸，得到包含cAMP、Pi和ADP的第二反應混合物。使第二反應混合物與腺苷酸環化酶的一種或多種抑制劑、一種或多種ADP到ATP轉化酶、生物發光酶及其底物例如螢光素酶和螢光素接觸，得到第三反應混合物。因此，在加入生物發光酶及其底物之後，或者在腺苷酸環化酶抑制劑和ADP到ATP轉化酶的同時，或者在加入腺苷酸環化酶抑制劑和ADP到ATP轉化酶之後，檢測第三反應混合物中的發光。在一個實施方案中，將用於將ADP轉化為ATP的反應混合物和生物發光酶反應合併在一個溶液中。對照反應包括不含磷酸轉移酶或ATP水解酶的反應或者可包含磷酸轉移酶或ATP水解酶的已知抑制劑或活化劑的反應。例如，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性小於所述試劑不存在時激酶或 ATP酶活性，則在所述方法中測試的試劑就可鑑定為激酶或ATP酶的抑制劑。在一個實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性小於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性的95%，則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的抑制劑。在一個實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性小於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性的80^^70^^60%, 50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%或以下時，則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的抑制劑。在還一個實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性小於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性的50%，則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的抑制劑。在另一個實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性大於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性，則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的活化劑。在一個實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性大於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性的 10 %，則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的活化劑。在一個實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性大於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性的20 %、30 %、40 %、50 %、 75%、100%或200%，則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的活化劑。在又一實施方案中，如果在所述試劑存在時激酶或ATP酶活性大於所述試劑不存在時激酶或ATP酶活性的至少 50%,則所測試劑就鑑定為激酶或ATP酶的活化劑。本發明因此提供用於檢測樣品中的磷酸轉移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶活性的方法、組合物和試劑盒。在某些實施方案中，方法、組合物和試劑盒是不含抗體的，並且本文所述的均質方法是快速、靈敏、簡便和非放射性的。所述方法是方便的並可與任何儀器平臺一起使用。可以相對容易地設計並可容易地合成所需試劑。所述試劑可便於在許多樣品中以高通量模式、長時間測定活性，因為發光反應產生高的信號穩定性，因此無需具有試劑注射器的發光計並且允許以分批模式處理多個樣品。 在一個實施方案中，本發明的方法可在多孔板中的單個孔中進行，使其適用於高通量篩選方法。所述方法可在不同反應溫度下用於不同量的ATP、激酶或ATP酶、測試劑或其任何組合。本發明的方法可用於檢測寬範圍的ADP或ATP濃度的活性，通常從大約ΙμΜ 以下至大約5mM以上的ADP或ATP。在某些實施方案中，採用本文所述的方法、組合物或試劑盒可檢測低至 0. 5 μ M、0. 25 μ M、0. 1 μ M、0. 01 μ Μ、1ηΜ、0. 1ηΜ、0. OlnM, IpicoM 以下的 ADP 或ATP濃度。在某些實施方案中，可檢測在IOmicoliters溶液中的20ηΜ ADP (0. 2pM ADP)。 例如所述方法可用於在通常低於5 μ M ATP的低濃度ATP以及大約ImM至大約5mM ATP的範圍內檢測激酶活性。儘管本發明的方法可用於實際含有任何量的ADP或ATP樣品。
本發明的試劑盒經設計用於檢測和定量檢測樣品中的磷酸轉移酶例如激酶或ATP 水解酶例如ATP酶的活性，或者檢測測試劑例如文庫例如組合文庫中的那些對磷酸轉移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的活性的作用。在一個實施方案中，用於檢測樣品中的激酶或ATP酶活性的試劑盒可在一個容器中包含凍幹的螢光素酶或凍幹的螢光素酶和螢光素，而另一容器含有一種或多種ADP到ATP轉化酶或其底物、或腺苷酸環化酶抑制劑或其組合的重配緩衝液。所述試劑盒也可提供鎂或其它陽離子例如錳或鈣。為了便於使用已知濃度的ADP或ATP或者激酶或ATP酶的對照試驗，在所述試劑盒中還可提供裝有ADP、ATP、 分離的激酶或分離的ATP酶的容器。所述試劑盒也可提供例如在溶液中抑制激酶或ATP酶活性的化合物(例如星孢素)。包含激酶或ATP酶抑制劑的組合物可包含不止一種抑制劑。 因此，所述試劑盒可提供一種或多種分離的ADP到ATP轉化酶及任選底物，其是磷酸基團供體(例如磷酸肌酸、磷酸烯醇式丙酮酸或多磷酸)或其它分離的酶例如分離的腺苷酸環化酶，或焦磷酸酶。在一個實施方案中，所述試劑盒包含裝有緩衝液的容器，所述緩衝液例如大約pH 6. 0至大約pH 8. 0，具有分離的腺苷酸環化酶、任選一種或多種激酶或ATP酶抑制劑和任選焦磷酸酶。所述試劑盒還可額外包含裝有凍幹螢光素酶的單獨容器，或任選包含裝有腺苷酸環化酶抑制劑、激酶和任選ADP到ATP轉化酶的底物的單獨容器。在一個實施方案中，裝有凍幹螢光素酶的容器還裝有作為螢光素酶底物的凍幹螢光素或其衍生物。任選所述試劑盒還包含用於測定ADP的試劑盒使用說明書。附圖簡述

圖1是ADP檢測測定方案，其中在檢測步驟之前使用腺苷酸環化酶(AC)以除去 ADP形成反應之後剩餘的ATP。圖2顯示AC耗盡反應中存在的所有ATP的效力。圖3顯示用兩種細菌百日咳博德特氏菌和炭疽芽孢桿菌的AC耗盡ATP。圖4顯示重組全長AC(170Kd)和催化結構域Gld)具有類似活性。圖5顯示4種鈣調蛋白拮抗劑對AC的抑制。圖6顯示卡米達佐(calmidazolium)對AC的抑制結果。圖7顯示在ATP存在下，對檢測不同濃度ADP的測定靈敏度。
圖8顯示在PKA激酶反應之後，當來自兩種不同細菌的AC用於ADP檢測測定所得的結果。圖9顯示激酶或ATP酶抑制劑的任選使用，以終止激酶或ATP酶反應。圖10顯示使用本發明組合物的蛋白激酶PKA滴定結果。圖11顯示使用本發明組合物的PKA底物(肯普肽(kemptide))滴定結果。圖12顯示使用本發明組合物，在PKA激酶反應中的ATP滴定結果。圖13顯示不同抑制劑對PKA活性的作用結果。圖14顯示使用本發明組合物的脂質激酶PI3滴定結果。圖15顯示在使用本發明組合物的PI3脂質激酶反應中的ATP滴定結果。圖16顯示使用本發明組合物的PI3脂質激酶底物(磷脂醯肌醇)滴定結果。圖17顯示使用本發明組合物，渥曼青黴素(wortmanin)誘導的對PI3脂質激酶抑制的結果。圖18顯示使用本發明組合物的鞘氨醇激酶(SPHK)滴定結果。圖19顯示使用本發明組合物的受體酪氨酸激酶EGFR滴定結果。圖20顯示使用本發明組合物，在EGn 激酶反應中的ATP滴定結果。圖21顯示使用蛋白底物(MBP)和本發明組合物的MAP激酶ERK2滴定結果。圖22顯示使用葡萄糖作為底物和本發明組合物的糖激酶己糖激酶滴定結果。圖23顯示在使用本發明組合物的Hsp70ATP酶反應中的ATP和酶滴定結果。圖M顯示在使用本發明組合物的ATP依賴型DNA酶反應中的線狀DNA底物滴定研究結果。圖25顯示使用本發明組合物的Na+/K+ATP酶滴定研究結果。圖沈-27顯示使用本發明組合物，在抑制劑和活化劑藥物存在下，P-糖蛋白(Pgp) 活性滴定研究結果。圖觀顯示使用本發明組合物的SV40大T抗原固有的解螺旋酶活性滴定的結果。圖四顯示在2或3步驟中進行測定的能力並具有類似結果。圖30顯示在ADP到ATP轉化步驟中，肌酸磷酸激酶的使用。圖31顯示在ADP到ATP轉化步驟中，腺苷酸激酶(肌激酶)的替代使用。圖32顯示本發明的替代使用，以便在檢測細胞ATP含量之前，耗盡溶液中汙染的游離ATP。圖33提供腺苷酸環化酶的示例性序列(SEQ ID NO :1_9 ；NCBI檢索號.Y00545、 M24074、YP016473、NP652900、AP003604、AAO1202, P15318 和 Q57506)，以及 ADP 到 ATP 轉化酶的示例性序列(SEQ IDNO 10-15 ；NP_067248、NP_031736、AAC31758、AAF06820 和 NP_077352)。發明詳述^X除非另有說明，否則所有科技術語都具有本發明所屬領域的技術人員公知的含義。所有引用的專利和出版物都通過引用全部結合到本文中，除非另有說明。「分離的」或「純化的」酶例如腺苷酸環化酶、激酶、ATP酶或螢光素酶是已經鑑定和分離和/或從其天然環境的成分中回收的那些。
本文所用的術語「樣品」以其最廣泛的含義加以使用。樣品是使用本發明來分析的懷疑具有激酶或ATP酶活性的組合物。儘管通常樣品是已知含有或懷疑含有激酶或ATP 酶活性，任選在生長培養基或細胞裂解物中，但樣品也可以是懷疑具有激酶或ATP酶活性的固體表面(例如拭子、膜、濾器、顆粒)。已經提出，對於所述固體樣品，通過將固體加入到本發明的試劑組合物或另一種添加本發明試劑組合物的含水溶液中，製備含水樣品。本文所用的術語「檢測」是指定量或定性檢測樣品中某組分的存在與否。「 ％胺基酸序列同一性」定義為當兩個序列最佳比對時，一個序列中的胺基酸殘基與第二序列中的胺基酸殘基在重疊區域內的相同、一致或相對的百分數。為了測定％胺基酸同一性，局部比對序列並在必要時引入空位以達到最大％的序列同一性；當計算序列同一性時，保守取代不計。測定％同一性的胺基酸序列比對程序是本領域技術人員眾所周知的。公眾可得的計算機軟體例如BLAST軟體(NCBI在www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)可用於比對肽序列。本領域技術人員可確定用於測定比對的合適算法和參數，包括得到兩個胺基酸序列最佳比對所需的任何算法和參數。當進行胺基酸序列比對時，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B的％胺基酸序列同一性(也可表示為給定胺基酸序列A具有或包括與給定胺基酸序列B的％胺基酸序列同一性)可計算如下%胺基酸序列同一性=(X/Y) · 100其中X是通過序列比對程序或算法而在A和B最佳比對中記為相同匹配的胺基酸殘基數，Y是所比對的總胺基酸位數。本文所用的術語「發光」包括生物發光(即由活體產生光)、化學發光(當進行化學反應時產生光)和電化學發光。當所涉及的酶為發光而通過自然選擇在生物體中進化， 或者所涉及的酶是所述酶的突變衍生物時，發光反應也稱為「生物發光反應」，所涉及的酶也稱為「生物發光酶」。生物發光酶的實例包括但不限於螢火蟲螢光素酶、花蟲(Renilla) 螢光素酶、海螢(Cypridina)螢光素酶、水母(Aequorin)發光蛋白、Gaussia螢光素酶、 Oplophorus螢光素酶、奧貝林(Obelin)發光蛋白等。本文所用的術語「發光分子(luminogenic molecule) 」是指能通過化學或生化反應而發光的分子(例如螢光素、腔腸螢光素(coelenterazine)或其功能類似物)。螢光素酶的合適的發光分子或底物包括螢光素、腔腸螢光素以及螢光素和腔腸螢光素的功能類似物。在某些實施方案中，螢光素和腔腸螢光素的功能類似物包括修飾的螢光素和腔腸螢光素，包括這些化合物的衍生物。示例性的化合物包括公開於WO 03/040100、WO 2004/027378 和美國公開申請2009-0075309中的那些。通常，發光分子是高能分子(例如穩定的二氧雜環丁烷)或它可通過化學反應轉化成高能分子。化學反應通常是通過氧、超氧化物或過氧化物的氧化。在每種情況下，發光分子內的能量通過化學反應而釋放。儘管這些能量中的至少某些是作為光的光子而釋放， 能量也可以其它形式例如熱的形式釋放出來。不發光的發光分子通過通常稱為「暗途徑」的替代方式而分散其能量。本文所用的術語「螢光素衍生物」是指具有D-螢光素基本結構並作為螢光素酶底物的一類發光分子或化合物，例如在美國申請順序號11/444，145，Branchini等(1989)中公開的氨基螢光素或螢光素酶底物，例如在Branchini等(2002)，和Branchini (2000)中公開的萘基和喹啉基衍生物，所述文獻的公開內容都通過引用結合到本發明中。術語「抑制劑」是指能通過包括但不限於直接或間接滅活、抑制、變性或掩蔽等的任何機制而基本上減少或終止樣品中的酶活性的分子、化合物或物質。本文所用的術語「基本上將溶液中的所有ATP減少成非ADP底物」是指溶液中ATP 的量減少到這樣的量允許檢測溶液中從ADP產生的ATP的存在與否或測定ATP的量。在某些實施方案中，溶液中的ATP量減少到溶液中最初ATP量的不足2%，例如1%、0. 75%、 0. 5%,0. 25%,0. 1%,0. 075%,0. 05%,0. 025%,0. 02%,0. 01%,0. 001%或 0. 0001%或更低。本文所用的術語「基本上除去所有PPi 」是指溶液中PPi的量減少到這樣的量使得生物發光反應可以檢測溶液中從ADP產生的ATP的存在與否或測定ATP的量。在某些實施方案中，溶液中的PPi的量減少到溶液中最初PPi量的不足5 %，例如4 %、3 %、2 %、 1%,0. 75%,0. 5%,0. 25%,0. 1 %,0. 075%,0. 05%,0. 025%,0. 02%,0. 01%,0. 001 %或 0. 0001%或更低。在某些實施方案中，用酶例如焦磷酸酶除去PPi。本發明示例件組合物和方法本發明提供組合物和使用這些組合物的方法，所述方法在抑制激酶或ATP酶並將任何剩餘ATP轉化為cAMP之後，通過檢測激酶或ATP酶催化的ADP形成，而檢測樣品中的激酶或ATP酶活性。所形成的ADP再轉化為ATP，用於生物發光反應，例如與螢光素酶介導的反應結合，任選在單個步驟中，然後再通過檢測所發的光。在一個實施方案中，使用本發明組合物與樣品而產生的光具有延長的持續時間，即減少到每小時小於約50%，相對於最後的組合物剛與樣品混合之後的發光而言。用於所述方法的樣品可包含細胞、細胞裂解物、裂解物的亞細胞部分例如膜部分，或無細胞樣品，並包括生理樣品。本發明範圍之內的細胞包括原核細胞和真核細胞， 包括植物細胞和脊椎動物細胞，例如哺乳動物細胞包括但不限於人、非靈長類的人類 (non-primate human)、牛、馬、綿羊、豬、山羊、貓、狗、貂、嚙齒類或禽類的細胞。包含細胞的樣品可經處理，使樣品中的細胞滲透或裂解。滲透、裂解或破碎細胞或其亞細胞部分的方法是本領域眾所周知的。各種儀器可用於機械破碎，包括超聲波儀(超聲波發生器)、杜恩斯勻漿器(doimce)、研缽和乳缽、或法式壓榨(French press) 0可通過滲壓振蕩，通過例如一系列凍融循環或快速改變環境離子強度等處理，或者通過使用直接破壞細胞膜的試劑(例如溶菌酶等酶，或化學試劑例如去垢劑或表面活性劑例如兩性離子型和非離子型去垢劑或陽離子型去垢劑DTAB或CTAB，以及抗菌藥物例如多粘菌素B和氯己定)，來破碎細胞(產生細胞裂解物)。樣品中的細胞，例如在包括真核細胞例如酵母細胞、禽類細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞在內的樣品中的細胞，包括但不限於人、猿、鼠、狗、牛、馬、貓、綿羊、山羊或豬的細胞，原核細胞，來自兩種以上不同生物體的細胞，或細胞裂解物，可以是未經重組技術的遺傳修飾(非重組細胞)，或者可以是重組細胞，其可以是用重組DNA和/或用重組 DNA穩定擴增的基因組瞬時轉染的細胞，或者其基因組已經修飾以破壞基因例如破壞啟動子、內含子或可讀框，或用另一 DNA片段置換一個DNA片段。重組DNA或置換DNA片段可編碼可用本發明方法檢測的激酶或ATP酶，改變所檢測激酶或ATP酶的水平或活性的一部分， 和/或與改變激酶或ATP酶的水平或活性的分子或部分無關的基因產物。
在一個實施方案中，本發明減少到檢測樣品中的激酶或ATP酶活性所需操作的2 步驟，在發光檢測之前。在所述方法中，至少一部分激酶或ATP酶反應產物與腺苷酸環化酶和焦磷酸酶反應的必要成分混合，其中在激酶或ATP酶反應之後剩餘的ATP轉化為cAMP，而且焦磷酸被降解。至少一部分具有cAMP的反應混合物的產物與ADP到ATP轉化酶反應和生物發光反應的所有必須成分混合，所述成分例如包括以下在內的成分腺苷酸環化酶抑制劑、一種或多種ADP到ATP轉化酶及其任選底物、和ATP依賴型生物發光產生酶(例如螢光素酶)以及相應發光分子。在3步法中，至少一部分激酶或ATP酶反應產物(包括ADP和ATP)與腺苷酸環化酶和焦磷酸酶反應的必要成分混合，產生cAMP和磷酸。至少一部分所述反應產物與ADP到 ATP轉化酶反應的必要成分混合。至少一部分ADP到ATP轉化酶反應產物與ATP依賴型生物發光酶介導的反應的必要成分混合。用於檢測、或用於篩選激酶或ATP酶的調節劑的示例性激酶和ATP酶提供如下。表 1.
權利要求
1.用於檢測溶液中腺苷二磷酸(ADP)的存在與否或測定其含量的方法，所述方法包括(a)使用將ATP轉化為非ADP產物的酶，基本上將溶液中的所有ATP減少成非ADP產物；(b)使用能夠將ADP轉化為ATP和磷酸基團供體的酶，將溶液中的ADP轉化為ATP；和(c)採用生物發光反應，檢測(a)中所產生的ATP的存在與否或測定其含量。
2.權利要求1的方法，所述方法還包括(d)在(b)或(c)之前，基本上除去(a)中產生的所有焦磷酸(PPi)。
3.權利要求1或2的方法，所述方法還包括(e)在(b)或(c)之前，抑制將ATP轉化為非ADP產物的酶。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中通過產生ADP的酶在溶液中產生ADP，而且所述生物發光反應提供對產生ADP的酶的度量。
5.權利要求4的方法，其中所述產生ADP的酶是將ATP轉化為ADP的酶。
6.權利要求5的方法，其中所述將ATP轉化為ADP的酶是激酶或ATP水解酶。
7.權利要求6的方法，所述方法還包括(f)在(a)之前，在激酶反應或ATP水解酶反應的已知或推定抑制劑的存在或不存在下，進行所述激酶反應或ATP水解酶反應。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述將ATP轉化為非ADP產物的酶是腺苷酸環化酶。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述能夠將ADP轉化為ATP的酶是丙酮酸激酶。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述生物發光反應包含螢光素酶和所述螢光素酶的底物。
11.權利要求2-10中任一項的方法，其中(d)用焦磷酸酶來進行。
12.用於檢測溶液中的ADP的試劑盒，所述試劑盒包含 (i)將ATP轉化為非ADP產物的酶；(ii)能夠將ADP轉化為ATP的酶；(iii)磷酸基團供體；(iv)螢光素酶；和(ν)所述螢光素酶的底物。
13.權利要求12的試劑盒，所述試劑盒還包含一種或多種以下成分(vi)焦磷酸酶；(vii)一種或多種去垢劑；(viii)—種或多種緩衝液；和/或(ix)一種或多種鹽。
14.權利要求12或13的試劑盒，其中所述將ATP轉化為非ADP產物的酶是腺苷酸環化酶，所述能夠將ADP轉化為ATP的酶是丙酮酸激酶和/或所述磷酸基團供體是磷酸烯醇式丙酮酸。
全文摘要
本發明提供用於測定或檢測酶活性的組合物和方法，所述酶包括磷酸轉移酶例如激酶(例如蛋白激酶、脂質激酶和糖激酶)和ATP水解酶(例如ATP酶，例如HSP90)，所述方法使用ATP作為底物而形成ADP作為產物通過監測ADP的變化來測定或檢測酶活性。
文檔編號G01N33/53GK102159948SQ200980138112
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月20日 優先權日2008年7月22日
發明者H·澤佐蒂, S·A·格利 申請人:普羅美加公司