檢測ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板與流程

2023-06-11 08:58:36

本發明涉及法醫學
技術領域：
，具體涉及檢測ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板。
背景技術：
：ABO血型是經典的人類遺傳標記，在輸血、親子鑑定、人類學研究、法醫物證檢驗等領域均佔據重要地位。針對ABO血型，傳統的血清學檢驗方法是對抗原或抗體進行檢驗，而在法醫物證檢驗中最為常用的方法是檢驗抗原物質，但由於ABO血型抗原是糖脂或糖蛋白，因此檢驗時易受抗原活性、抗體的特異性以及微生物的汙染等因素的影響。尤其針對性犯罪中的混合斑檢驗，傳統的血清學檢驗方法也有著無法克服的局限性，使得無法分離女性受害人和男性嫌疑人的血型物質，只能根據受害人的血型來推測嫌疑人的血型，一旦遇到受害人血型遮蔽的情況，則無法準確推斷混合斑中男性物質的血型。1985年，Gill研究組將差異裂解法和DNA指紋圖技術應用於法醫學檢驗，成功的分別提取混合斑中精子DNA和女性DNA，解決了困擾法醫物證檢驗多年的難題，這也使DNA技術檢驗混合斑中精子血型成為可能。1990年，Yamamoto等人報導了ABO血型基因的核苷酸序列，準確檢測到各等位基因在DNA序列上不同的SNP位點鹼基的差異，這些研究證實利用ABO血型基因上SNP位點的差異進行ABO血型的基因分型將是一種非常有效的方法，特別是對於法醫學實踐中微量或降解的檢材，但是現有的ABO血型基因SNP分型仍有一些不足，例如無法重複；雖可以重複，但在毛細管電泳平臺上的峰型易出現分叉、肩峰、不對稱等等現象，導致無法準確讀取分型。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何檢測ABO血型基因型。為解決上述技術問題，本發明首先提供了引物組合。本發明所提供的引物組合，可由引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3組成；所述引物ABO-F1可為如下A1)或A2)：A1)序列表中的序列1所示的單鏈DNA分子；A2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-F2可為如下A3)或A4)：A3)序列表中的序列2所示的單鏈DNA分子；A4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-F3可為如下A5)或A6)：A5)序列表中的序列3所示的單鏈DNA分子；A6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R1可為如下A7)或A8)：A7)序列表中的序列4所示的單鏈DNA分子；A8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R2可為如下A9)或A10)：A9)序列表中的序列5所示的單鏈DNA分子；A10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R3可為如下A11)或A12)：A11)序列表中的序列6所示的單鏈DNA分子；A12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物組合的應用也屬於本發明的保護範圍。所述引物組合的應用可為(b1)或(b2)：(b1)製備用於檢測ABO血型基因型的試劑盒；(b2)檢測ABO血型基因型。含有所述引物組合的試劑盒也屬於本發明的保護範圍。所述試劑盒可用於檢測ABO血型基因型。含有所述引物組合的試劑盒的製備方法也屬於本發明的保護範圍。含有所述引物組合的試劑盒的製備方法，可包括將各條引物單獨包裝的步驟。為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測ABO血型基因型的方法。本發明所提供的檢測ABO血型基因型的方法，具體可為方法一，包括如下步驟：以待測樣本的基因組DNA或總DNA為模板，採用所述引物組合進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，然後進行如下判斷：(d1)如果所述PCR擴增產物中含有DNA片段甲和DNA片段丁，且不含有DNA片段乙和DNA片段丙，則待測樣本的ABO血型基因型為AA；(d2)如果PCR擴增產物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，則待測樣本的ABO血型基因型為AB；(d3)如果PCR擴增產物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙，則待測樣本的ABO血型基因型為AO；(d4)如果PCR擴增產物中含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，則待測樣本的ABO血型基因型為BB；(d5)如果PCR擴增產物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，則待測樣本的ABO血型基因型為BO；(d6)如果PCR擴增產物中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，則待測樣本的ABO血型基因型為OO；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列表中的序列7所示；所述DNA片段乙的核苷酸序列如序列表中的序列8所示；所述DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中的序列9所示；所述DNA片段丁的核苷酸序列如序列表中的序列10所示。上述方法中，所述「進行PCR擴增」的反應體系可由KCl、MgCl2、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN3、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl緩衝液組成；引物混合物即為所述引物組合中的各條引物組成的混合物。反應體系中，KCl的濃度具體可為50mM，MgCl2的濃度具體可為1.6mM，牛血清白蛋白的濃度具體可為0.8mg/mL，Tween-20的濃度具體可為0.2％(v/v)，甘油的濃度具體可為3.2％(v/v)，NaN3的濃度具體可為0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度具體均可為200μM，所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2、所述引物ABO-F3、所述引物ABO-R1、所述引物ABO-R2和所述引物ABO-R3的濃度具體均可為0.32μM，Taq金牌酶的濃度具體可為0.1U/μL，模板具體可為0.05ng/μL，Tris-HCl緩衝液的濃度具體可為pH8.3、20mM的Tris-HCl。上述方法中，所述「進行PCR擴增」的反應程序具體可為：95℃預變性11min；94℃變性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循環；60℃延伸60min；4℃保存。本發明所提供的檢測ABO血型基因型的方法，具體可為方法二，包括如下步驟：檢測待測樣本的基因組DNA或總DNA中是否含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙或所述DNA片段丁，然後進行如下判斷：(e1)如果待測樣本的基因組DNA或總DNA中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丙，則待測樣本的ABO血型基因型為AA；(e2)如果待測樣本的基因組DNA或總DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，則待測樣本的ABO血型基因型為AB；(e3)如果待測樣本的基因組DNA或總DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙，則待測樣本的ABO血型基因型為AO；(e4)如果待測樣本的基因組DNA或總DNA中含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，則待測樣本的ABO血型基因型為BB；(e5)如果待測樣本的基因組DNA或總DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，則待測樣本的ABO血型基因型為BO；(e6)如果待測樣本的基因組DNA或總DNA中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，則待測樣本的ABO血型基因型為OO。為解決上述技術問題，本發明還提供了一種作為ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板的DNA組合物，其含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁。所述DNA組合物具體可由所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁組成。所述DNA組合物中，所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁的質量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述DNA組合物中，所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁的質量比具體可為1：1：1：1。為解決上述技術問題，本發明還提供了一種作為ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板的重組質粒組合物。所述重組質粒組合物是通過如下方法製備的：將所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁分別插入到4個載體中，得到4個重組載體；將所述4個重組載體混合，得到重組質粒組合物；所述重組質粒組合物中，所述載體可為克隆載體。所述克隆載體具體可為質粒pMD18-T。所述DNA組合物或所述重組質粒組合物的應用也屬於本發明的保護範圍。所述DNA組合物或所述重組質粒組合物的應用為a1)或a2)或a3)：a1)作為ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板；a2)製備ABO血型基因座的等位基因分型標準物；a3)檢測ABO血型基因座的等位基因分型。所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁均可以人的基因組DNA為模板，採用所述引物組合(各個引物均不經過螢光修飾)進行PCR擴增獲得。所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2和所述引物ABO-F3的5』末端均可經過螢光修飾，以便於對PCR擴增產物進行毛細管電泳檢測。所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2和所述引物ABO-F3的5』末端具體均可經過TAMRA修飾。實驗證明，採用本發明提供的引物組合檢測ABO血型基因型，準確率為100％；採用本發明提供的重組質粒組合物作為ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板，可擴增獲得ABO血型基因座的等位基因分型標準物，並可在多種商業試劑盒中使用。本發明具有重要的應用價值。附圖說明圖1為實施例1步驟二的實驗結果。圖2為實施例3步驟3的實驗結果。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。Typer500內標為公安部物證鑑定中心的產品。去離子甲醯胺為ABI公司的產品，產品目錄號為4311320。ABI3130xl遺傳分析儀和Nanodrop1000微量分光光度計均為ABI公司的產品。質粒pMD18-T為TaKaRa公司的產品，產品目錄號為6011。實施例1、檢測ABO血型基因座的等位基因的基因型一、引物組合的製備用於檢測ABO血型基因座的等位基因的基因型的引物組合如下：引物ABO-F1：5』-TAMRA-ACACCCCGGAAGGATGTCCTCGTGGTGA-3』(5』末端進行TAMRA修飾)(序列表中序列1)；引物ABO-F2：5』-TAMRA-GGAAGGATGTCCTCGTGGTA-3』(5』末端進行TAMRA修飾)(序列表中序列2)；引物ABO-F3：5』-TAMRA-AGTGGACGTGGACATGGAGTTCC-3』(5』末端進行TAMRA修飾)(序列表中序列3)；引物ABO-R1：5』-AATGTCCACAGTCACTCGCCACT-3』(序列表中序列4)；引物ABO-R2：5』-CCCGAAGAACCCCCCCAG-3』(序列表中序列5)；引物ABO-R3：5』-TTTTTCGAAGAACGCCCCCAT-3』(序列表中序列6)。人工合成引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3。二、檢測ABO血型基因座的等位基因的基因型待測樣本為樣本一、樣本二、樣本三、樣本四、樣本五或樣本六：樣本一：已鑑定血型基因型為AA的人的血液；樣本二：已鑑定血型基因型為AB的人的血液；樣本三：已鑑定血型基因型為AO的人的血液；樣本四：已鑑定血型基因型為BB的人的血液；樣本五：已鑑定血型基因型為BO的人的血液；樣本六：已鑑定血型基因型為OO的人的血液。1、以待測樣本的基因組DNA為模板，採用步驟一製備的引物組合進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。反應體系由KCl、MgCl2、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN3、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl緩衝液組成；引物混合物即為步驟一製備的引物組合中的各條引物組成的混合物。反應體系中，KCl的濃度為50mM，MgCl2的濃度為1.6mM，牛血清白蛋白的濃度為0.8mg/mL，Tween-20的濃度為0.2％(v/v)，甘油的濃度為3.2％(v/v)，NaN3的濃度為0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度均為200μM，引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3的濃度均為0.32μM，Taq金牌酶的濃度為0.1U/μL，模板為0.05ng/μL，Tris-HCl緩衝液的濃度為pH8.3、20mM的Tris-HCl。反應程序：95℃預變性11min；94℃變性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循環；60℃延伸60min；4℃保存。2、完成步驟1後，向去離子甲醯胺中加入1μLPCR擴增產物和0.2μLTyper500內標，然後用去離子甲醯胺定容至20μL，得到反應液。3、完成步驟2後，取反應液，95℃變性5min，迅速轉移至-20℃放置5min，然後用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到DNA檢測圖譜。電泳條件為：進樣電壓1.2kV，進樣時間為18s。實驗結果見圖1(A為樣本一，B為樣本二，C為樣本三，D為樣本四，E為樣本五，F為樣本六)。結果表明，ABO血型基因座有4個等位基因，分別命名為等位基因1(大小為187bp，核苷酸序列如序列表中序列7所示)、等位基因2(大小為190bp，核苷酸序列如序列表中序列8所示)、等位基因3(大小為192bp，核苷酸序列如序列表中序列9所示)和等位基因4(大小為200bp，核苷酸序列如序列表中序列10所示)。4個等位基因對應6個血型基因型：血型基因型為AA的樣本一中含有等位基因1和等位基因4；血型基因型為AB的樣本二中含有等位基因1、等位基因2和等位基因4；血型基因型為AO的樣本三中含有等位基因1、等位基因3和等位基因4；血型基因型為BB的樣本四中含有等位基因2和等位基因4；血型基因型為BO的樣本五中含有等位基因1、等位基因2、等位基因3和等位基因4；血型基因型為OO的樣本六中含有等位基因1和等位基因3。實施例2、檢測ABO血型基因型的方法一、檢測ABO血型基因型的方法採用實施例1步驟一製備的引物組合可檢測ABO血型基因型。具體步驟為：以待測樣本的基因組DNA或總DNA為模板，採用步驟一製備的引物組合進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，然後根據PCR擴增產物的核苷酸序列，確定含有等位基因1、等位基因2、等位基因3和等位基因4中的哪幾種，然後進行如下判斷：如果含有等位基因1和等位基因4，則待測樣本的ABO血型基因型為AA；如果含有等位基因1、等位基因2和等位基因4，則待測樣本的ABO血型基因型為AB；如果含有等位基因1、等位基因3和等位基因4，則待測樣本的ABO血型基因型為AO；如果含有等位基因2和等位基因4，則待測樣本的ABO血型基因型為BB；如果含有等位基因1、等位基因2、等位基因3和等位基因4，則待測樣本的ABO血型基因型為BO；如果含有等位基因1和等位基因3，則待測樣本的ABO血型基因型為OO。二、準確性1、分別以90片待測血卡(圓形，直徑均為1.0mm)為模板，採用實施例1步驟一製備的引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。反應體系由KCl、MgCl2、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN3、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl緩衝液組成；引物混合物即為上述各條引物組成的混合物。反應體系中，KCl的濃度為50mM，MgCl2的濃度為1.6mM，牛血清白蛋白的濃度為0.8mg/mL，Tween-20的濃度為0.2％(v/v)，甘油的濃度為3.2％(v/v)，NaN3的濃度為0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度均為200μM，各條引物的的濃度均為0.32μM，Taq金牌酶的濃度為0.1U/μL，模板為1片待測血卡，Tris-HCl緩衝液的濃度為pH8.3、20mM的Tris-HCl。反應程序：95℃預變性11min；94℃變性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循環；60℃延伸60min；4℃保存。2、完成步驟1後，向去離子甲醯胺中加入1μLPCR擴增產物和0.2μLTyper500內標，然後用去離子甲醯胺定容至20μL，得到反應液。3、完成步驟2後，取反應液，95℃變性5min，迅速轉移至-20℃放置5min，然後用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到DNA檢測圖譜；然後按照步驟一的結論確定待測血卡的血型基因型。電泳條件為：進樣電壓1.2kV，進樣時間為18s。採用經典的血清學方法檢測90片待測血卡的血型基因型。實驗結果見表1。結果表明，採用步驟一提供的方法檢測ABO血型基因型，準確率為100％。表1實施例3、ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板的製備和驗證1、重組質粒的獲得(1)人工合成DNA片段甲、DNA片段乙、DNA片段丙和DNA片段丁。DNA片段甲的核苷酸序列如序列表中的序列7所示。DNA片段乙的核苷酸序列如序列表中的序列8所示。DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中的序列9所示。DNA片段丁的核苷酸序列如序列表中的序列10所示。(2)製備表2所示的4個重組質粒，包含實施例1中ABO血型基因座的4個等位基因。根據測序結果，各重組質粒的詳細信息如下：重組質粒甲：將步驟(1)合成的DNA片段甲和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒甲；重組質粒乙：將步驟(1)合成的DNA片段乙和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒乙；重組質粒丙：將步驟(1)合成的DNA片段丙和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒丙；重組質粒丁：將步驟(1)合成的DNA片段丁和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒丁。表2編號基因座等位基因重組質粒名稱1ABO血型基因座1重組質粒甲2ABO血型基因座2重組質粒乙3ABO血型基因座3重組質粒丙4ABO血型基因座4重組質粒丁2、ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板的製備(1)利用Nanodrop1000微量分光光度計分別測量並稀釋步驟1中獲得的重組質粒DNA的濃度至1ng/μL，獲得各重組質粒的稀釋液。(2)完成步驟(1)後，取各重組質粒的稀釋液1μL進行混合，然後用超純水定容至1mL，得到ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板。ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板中，步驟一中各個等位基因的DNA濃度均為1pg/μL。3、ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板的驗證(1)以ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板作為模板，採用實施例1步驟一製備的引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。反應體系和反應程序同實施例1步驟二中1。(2)完成步驟(1)後，向去離子甲醯胺中加入1μLPCR擴增產物和0.2μLTyper500內標，然後用去離子甲醯胺定容至20μL，得到反應液。(3)完成步驟(2)後，取反應液，95℃變性5min，迅速轉移至-20℃放置5min，然後用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到DNA檢測圖譜。電泳條件為：進樣電壓1.2kV，進樣時間為18s。實驗結果見圖2。結果表明，ABO血型基因座的各等位基因分型完整、正確，峰型尖銳清晰，無雜峰，均衡性良好。因此，使用ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板可以製備ABO血型基因座的等位基因分型標準物。公安部物證鑑定中心檢測ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型標準物的模板10PatentInversion3.5128DNA人工序列1acaccccggaaggatgtcctcgtggtga28220DNA人工序列2ggaaggatgtcctcgtggta20323DNA人工序列3agtggacgtggacatggagttcc23423DNA人工序列4aatgtccacagtcactcgccact23518DNA人工序列5cccgaagaacccccccag18621DNA人工序列6tttttcgaagaacgcccccat217187DNA人工序列7agtggacgtggacatggagttccgcgaccacgtgggcgtggagatcctgactccgctgtt60cggcaccctgcaccccggcttctacggaagcagccgggaggccttcacctacgagcgccg120gccccagtcccaggcctacatccccaaggacgagggcgatttctactacctgggggggtt180cttcggg1878190DNA人工序列8agtggacgtggacatggagttccgcgaccacgtgggcgtggagatcctgactccgctgtt60cggcaccctgcaccccggcttctacggaagcagccgggaggccttcacctacgagcgccg120gccccagtcccaggcctacatccccaaggacgagggcgatttctactacatgggggcgtt180cttcgaaaaa1909192DNA人工序列9ggaaggatgtcctcgtggtaccccttggctggctcccattgtctgggagggcacattcaa60catcgacatcctcaacgagcagttcaggctccagaacaccaccattgggttaactgtgtt120tgccatcaagaagtaagtcagtgaggtggccgagggtagagacccaggcagtggcgagtg180actgtggacatt19210200DNA人工序列10acaccccggaaggatgtcctcgtggtgaccccttggctggctcccattgtctgggagggc60acattcaacatcgacatcctcaacgagcagttcaggctccagaacaccaccattgggtta120actgtgtttgccatcaagaagtaagtcagtgaggtggccgagggtagagacccaggcagt180ggcgagtgactgtggacatt200當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp