對蝦白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的製備和檢測方法

2023-06-11 23:52:46

專利名稱：對蝦白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的製備和檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種利用環介導等溫擴增(LAMP)技術進行菌樣檢測的方 法，具體是 一種對蝦白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的製備和檢測方法。
技術背景對蟲下白斑綜合症病毒(white spot syndrome virus)是新設立的 Nimaviridae科Whispovirus屬的代表種。對蟲下白斑綜合症病毒WSSV最早 出現在上世紀90年代初，是一種具有高度感染性和致死性的病毒，嚴重危 害著全球對蟲下養殖業並造成了巨大的經濟損失，僅我國自1993年爆發以來 已累計損失數百億元，成為海水養殖業危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻 引起了許多國家和地區(中國、美國、曰本、臺灣地區、荷蘭、印度、韓 國、新加坡等)的高度重視，但由於缺乏對病毒遺傳信息和功能特性的了 解，影響了病毒的防治研究。以往檢測對蟲下白斑綜合症病毒的主要方法有兩種l.症狀觀察法，觀 察發病的對蝦行動遲鈍，彈跳無力，靜臥不動或遊動異常(圍著池邊在水面 兜圈或在水中翻滾，)這種異常行為可在幾小時內重複出現，直到最後無力 活動，腹面朝上慢慢沉到水底，或被其他對蝦吃掉。而患病的斑節對蝦在 瀕臨死亡時則顯示出明顯變藍的現象，並多伴有腹部肌肉混濁。 一些倖存 的對蟲下可緩慢恢復正常。個別蝦可在甲殼、鰓部的表皮下出現大量黑色素 斑點。2.病理確認法。該病毒侵害的主要組織和器官是皮下組織、表皮角 質層組織，觸角腺、造血組織。病毒寄生在對蝦大部分的器官，從而導致 全身系統性的壞死；進行血相檢查，發現血淋巴細胞減少，血淋巴混濁， 淋巴樣器官和肝胰臟腫大。血淋巴液凝固時間超過3分鐘。瀕死蝦殼變軟， 血淋巴液發黃，不易凝固。病毒粒子可在細胞質中繼續裝配。最後細胞解 體，病毒粒子再感染周圍細胞。在腹部肌肉纖維之間有時也發現病毒粒子， 有的病郞在鰓和觸角腺中可看到血細胞變性壞死，包圍成結狀構造，其大 小約為20 - 50Mm;淋巴樣器官有血細胞浸潤。在顯微鏡下可見，病蝦甲殼 內面有直徑數毫米的白點，呈重瓣的花朵狀，外圍較透明，花紋較清楚， 中部木透明，花紋著木清。白點在頭胸甲上特別清楚，肉眼可見。白點在 酸中容易溶解。3.聚合酶鏈式反應法(PCR法)，該方法較前兩種方法快速、 靈敏，但需要昂貴的PCR儀並電泳觀察結果，或者使用螢光PCR儀檢測， 檢測時間長和成本高。2004年TomoyaKono報導了使用LAMP技術檢測WSSV的技術(Tomoya Kono， Ram Savan, Masahiro Sakai, Toshiaki Ttami.Dtection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-medicated isothermal amplification. Journalof Virological Methods. 2004,115,59-65.),但是檢測WSSV病毒的亞型比較 少，並且沒有進一步防止汙染的措施。 發明內容本發明的目的是提供 一種對蝦白斑綜合症病毒的快速檢測試劑盒的制 備和檢測方法。為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為 試劑盒l-2mL環介導等溫擴增反應液A、 0. 5-1. 5U/ju L UNG酶、6-10 U/ juL Bst DNA聚合酶B和1-3juL顯色劑C;顯色劑C體積濃度為5%-20°/。；其中，每升環介導等溫擴增反應液A含l-2 mL lOxThermopol反應緩 300 - 500jumo1 dNTP、 2-4mmol硫酸鎂、0. 8 - 1. 2 ji mol上遊內引物、0.8 -1. 2 jumol下遊內引物、0. 2 - 0. 3 jumol上遊外引物、0. 2 - 0. 3 jumol下遊 外引物和1-1.5 mol甜菜鹼；上遊內引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下遊內引物5—ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA—3、上遊外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下i^外弓l物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。所述 dNTP 內的四種脫氧核糖核酸的質量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x The函pol反應 緩衝液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120mmo1 氯化鉀、80-120mmol硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述顯色劑為螢光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。檢測方法1) 待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到500-800 |iL 蒸餾水中調製句漿後，再加入1.0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而後一併加 入到100 - 150 m L滅菌雙蒸水中混勻，並於IO(TC沸水浴中加熱10 - 15 min， 待水洛後將其以10000-12000轉/分離心5-10 min,取上清即為待檢樣品 模板DNA,待用2) 對蟲下白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增在21-23nL環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入1-2jliL待檢樣 品模板DNA和，0. 5-1. 5 U/jaL UNG酶，於恆溫95 。C放置3-5min，而後 置於冰上1-3min;待冷卻後加入、6-1Q U/|a L Bst DNA聚合酶B,於60 -65。C恆溫放置45 - 90 min;而後再將溫度調到80 - 95 °C中止反應，3-5 min後待用；3) 顯色檢測在反應液中加入1-3^L顯色劑C，觀察顏色變化； 每升環介導等溫擴增反應液A含10 x Thermopol反應緩衝液、300 - 500iamoldNTP、 2-4 mmol硫酸鎂、0.8-1.2/a mol上遊內引物、0. 8 - 1. 2 n mol下遊內引物、0. 2 - 0. 3m'ho1上遊外引物、0. 2 - 0. 3 |a mol下遊外引物 和1 - 1. 5 mol甜菜鹼；上遊內引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、 下遊內引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、 上i^外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、 下遊外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。所述 dNTP 內的四種脫氧核糖核酸的質量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x The函pol反應 緩衝液含100-300mmo1 pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120mmol 氯化鉀、80-120mmo1硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述顯色劑為10%的螢光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。所述步驟 3)觀察顏色變化若顏色為黃色，說明待檢樣品不含或者不是對蝦白斑綜合 症病毒，若顏色變為綠色，則說明待檢樣品含有或者為對蝦白斑綜合症病 毒。本發明的主要原理為(1)特殊設計一組可以識別靶DNA六個不同序 列的兩個內引物(上遊內引物和下遊內引物)和兩個外引物(上遊外引物 和下遊外引物)，內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內引 物首先和靶DNA雜交，隨後的鏈置換薩A合成在具有高度鏈置換活性的DNA 聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA,並作為由雜交到靶的 另一端的一個內引物和一個外引物啟動的DNA合成模板，產生一個原始的 莖環DNA; (3)內引物以原始莖環DNA做模板，啟動鏈置換DNA的合成，產 生一個原始的莖環DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環薩A; ( 4 )在等溫條 件下，內引物以莖環DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反覆重 復序列的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到10'拷貝，可 通過螢光染料來觀察擴增結果。本發明所具有的優點本發明建立了對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增檢測試劑盒及檢 測方法，試劑盒根據對蟲下白斑綜合症病毒的VP28基因的基本保守區的六個 序列設計了兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，該保守的基因序列為 對蟲下白斑綜合症病毒各不同血清型和菌株型所共有，以保證從種的水平上 檢測不同來源的對蟲下白斑綜合症病毒株的可靠性。本發明釆用環介導等溫 擴增(LAMP)技術，該技術特異性強，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度， 但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水洛鍋即可，且結果不必用凝膠電泳 方法來觀察，使用螢光染料來觀察即可，簡單而快速。可用於對蝦白斑綜 合症病毒的檢測，特別適用於基層養殖場現場應用，使用範圍廣、檢測結 果可靠。
具體實施方式
下列實施例進一步說明本發明，但不應當作對本發明的限制。 實施例1試劑盒1)環介導等溫擴增反應液A ( LAMP反應液A):含有2.5|uL lOxThermopol反應緩衝液、1. OjuL 10 mmol/L dNTP、 1. 0|iL 20|amol/L上遊內引物(FIP)、 1. 0 |i L 20 ju mol/L下遊內引物(BIP)、 0. 25 |iL 20|amol/L上遊外引物(F3 )、 0. 25 ju L 20 n mol/L下遊外引物(B3 )、 0. 5|aL 100 mmol/L MgS04、 12.5juL 2 mol/L甜菜鹼和4 ju L ddH20 (滅菌雙蒸水)。上遊內引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下遊內引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上遊外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下遊外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3 (參見序列表)。其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。2 ) 1U/ ju L UNG酶(購自New England Biolabs )、 8U/ ju L Bst DNA聚合酶B (購自New England Bi。labs )禾口 1 |i L顯色劑C;所述10 x Thermopol反應緩衝液為200 i腦l /L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100 mmol/L氯化鉀、100 mmol/L硫酸銨、20 mmol/L硫酸鎂和1。/。曲拉通X-100，顯色劑C為10。/。的螢光染料SYBR GREEN I (天根生物有限公司)。 檢測方法1) 待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到500|iL蒸餾 水中調製勻漿後，置於1.5mL離心管中，再加入1.0-1.5 raL滅菌雙蒸水 混句，而後一併加入到100nL滅菌雙蒸水中混勻，並於10(TC沸水浴中加 熱lOmin,待水浴後將其以10000轉/分離心10 min，取上清即為待檢樣 品模板DNA，待用2) 對蟲下白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增在23 n L環介導等溫擴增反應液A中加入1 ju L待檢樣品DNA模板和0. 5 U/]uL的UNG酶，置於95。C下恆溫放置5 min，而後置於冰上1 min;待冷 卻後加入加入8 U/|iL Bst DNA聚合酶B，於65。C恆溫放置60min;而後 再將溫度調到8(TC中止反應，3min後待用；3) 顯色檢測在反應液中加入l|aL10% (體積濃度)的螢光染料SYBR GREEN I,直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品不含 或者不是對蝦白斑綜合症病毒，如果顏色變為綠色，則說明待檢樣品含有或者為對蝦白斑綜合症病毒。其中，LAMP反應液A:含有2. 5pL 10 x Thermopol反應緩衝液、1.0 HL 10 mmol/L dNTP、 l.OjuL 20 p mol/L上遊內引物(FIP )、 l.OjuL 20 jamol/L下遊內引物(BIP)、 0.25 |iL 20|imol/L上遊外引物(F3)、 0.25 juL 20 jLimol/L下遊外引物(B3)、 0, 5 juL 100 mmol/L MgS04、 12. 5 juL 2 mol/L 甜菜鹼和 4 ju L ddH20 (滅菌雙蒸水)。上遊內引物 5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3 、 下遊內引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3 、 上遊外引物 5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下遊外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3 (參 見序列表)。dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。所述每升10 x Thermopol反應緩衝液為200 mmol /L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100 mmol/L氯化鉀、100 隱ol/L硫酸銨、20隱ol/L硫酸鎂和1%曲拉通X-100, 實施例2與實施例l不同之處在於試劑盒lmLLAMP反應液A、 1.5U/|iLUNG 酶(購自New England Biolabs )、 6 U/ |U L Bst DNA聚合酶B (購自New England Biolabs)和l)iL體積濃度為5。/。的螢光染料DNAGreen(購自於天根生物有限 公司)；其中，每升環介導等溫擴增反應液A含lmL 10 x Thermopol反應緩300 jumoldNTP、 2mmol硫酸鎂、0. 8 ju mol上遊內引物、0. 8 |a mol下遊內引物、0. 2|amol上遊外引物、0.2,1下遊外引物和lmol甜菜鹼和4 ju L ddH20 (滅菌雙蒸水)；所述dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP:l. 5: 1: 1: 1;所述每升10 x Thermopol反應緩衝液含 lOO隨ol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80mmol氯化鉀、80mmol硫 酸銨、10 mmol硫酸鎂和0. 8 %曲拉通X - 100。檢測方法1 )待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到 800|aL蒸餾水中調製勻漿後，置於1. 5mL離心管中，再加入1. 0 - 1. 5 mL 滅菌雙蒸水混勻，而後一併加入到150nL滅菌雙蒸水中混勻，並於10(TC 沸水洛中加熱10min，待水浴後將其以10000轉/分離心10min，取上清即 為待檢樣品模板DNA,待用2)對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增在23 juL環介導等溫擴增反應液A中加入luL待檢樣品DNA模板和1. 5U/|iL的UNG酶，置於95。C下恆溫放置5min,而後置於冰上3min;待 冷卻後加入加入6 U/juL Bst DNA聚合酶B，於65'C恆溫放置45min;而 後再將溫度調到80'C中止反應，3min後待用；3)顯色檢測在待檢的每個反應管中加入ljaL體積濃度為5%的螢光 染料讓AGreen的顯色劑C,直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色， 說明待檢樣品不含或者不是對蝦白斑綜合症病毒，如果顏色變為綠色，則 說明待檢樣品含有或者為對蝦白斑綜合症病毒。實施例3與實施例l不同之處在於試劑盒2 mL環介導等溫擴增反應液A、 1.5U/juL UNG酶、10 U/jiL Bst DNA聚合酶B和3 |a L體積濃度20%顯色劑c;其中，每升環介導等溫擴增反應液A含2 mL 10 x Thermopol反應緩500 iamoldNTP、 4mmol硫酸鎂、1. 2 m mol上遊內引物、1. 2 |a mol下遊內引物、0. 3nmo1上遊外引物、0. 3jumo1下遊外引物和1. 5 mol甜菜鹼；所述的dNTP 內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。所述 每升lOxThermopol反應緩衝液為300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷 -鹽酸、120mmol氯化鉀、120mmol硫酸銨、30 mmol硫酸鎂和1. 5 %曲拉 通X- 100。
檢測方法l)待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到600 juL蒸餾水中調製勻漿後，再加入l. 0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而後一併 加入到150ML滅菌雙蒸水中混勻，並於IO(TC沸水洛中加熱12min，待水 洛後將其以11000轉/分離心8min，取上清即為待檢樣品模板DNA,待用
2) 對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增在22 nL環介導等溫擴增 反應液A中加入1. 5 |i L待檢樣品DNA模板和1. 5U/ p L的UNG酶，置於95 。C下恆溫放置4min，而後置於冰上2min;待冷卻後加入10U/ ja L Bst DNA聚 合酶B，於62。C恆溫放置60min;而後再將溫度調到90°C中止反應，4 min 後待用；
3) 顯色檢測在反應液中加入3juL體積濃度20y。顯色劑C，觀察顏色變 實施例4
與實施例l不同之處在於試劑盒1. 5 mL環介導等溫擴增反應液A、 lU/juLUNG酶、9U/juLBstDNA聚合酶B和2 y L體積濃度為15%顯色劑C;
其中，每升環介導等溫擴增反應液A含1. 5mL lOxThermopol反應緩 400 iamoldNTP、 3mmo1硫酸鎂、ljamol上遊內引物、1 p mol下遊內引物、 0. 25jLitno1上遊外引物、0. 25jLimo1下遊外引物和1. 2mo1甜菜鹼；
所述的dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。所述每升10 x Thermopol反應緩衝液為200mmol pH8. 8的三羥基 甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol氯化鉀、lOOmmol硫酸銨、20 mmol硫酸鎂 和1%曲拉通X - 100。
檢測方法1 )待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入 到700)iL蒸餾水中調製勻漿後，再加入l. 0-1. 5 mL滅菌雙蒸水混勻，而 後一併加入到130laL滅菌雙蒸水中混勻，並於10(TC沸水洛中加熱13min， 待水洛後將其以10000轉/分離心7min,取上清即為待檢樣品模板DNA， 待用
2 )對蟲下白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增在22 nL環介導等溫擴增反 應液A中力口入2 )i L待檢樣品DNA模板和1U/ m l的UNG酶，置於95。C下恆 溫放置3min，而後置於冰上2min;待冷卻後加入9U/)aL Bst DNA聚合酶 B，於63。C恆溫放置80min;而後再將溫度調到85°C中止反應，4 min後待 用；
3)顯色檢測在反應液中加入2pL體積濃度為15y。顯色劑C,觀察顏色 變化。SEQUENCE LISTING 〈110>中閨科學院海洋研究所
〈120〉對臥CJ斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的製備和檢測方法
〈130〉
〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 38
〈212〉 DNA 人T.序列
〈220〉
〈221〉 prim—bind
〈222〉 (1). . (38) 〈223〉
〈400> 1
accacctttg gcgcaccaat cgt,gcacgt,a catgtcga 38
2
〈211> 42
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
prim—bind
<222〉 (1)..(42) 《223〉
〈400〉 2
accacacaca aaggtgccaa ctctttgtcg gtagctccaa ca 42
<210〉 3
〈211〉 20
〈212〉 DNA〈213> 人.T.序列 《220〉
〈221> prim—bind
〈222〉 (1). . (20) <223〉
3
ggtctcagtg ccagagtagg 加
〈210〉 4
〈211> 20
DNA
〈213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 pi'im—bind
〈222〉 (1). . (20) <223〉
〈400〉 4
tggtgccaaa gattaaccca 20
權利要求
1.一種對蝦白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒，其特徵在於1-2mL環介導等溫擴增反應液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL顯色劑C；其中，每升環介導等溫擴增反應液A含1-2mL 10×Thermopol反應緩300-500μmol dNTP、2-4mmol硫酸鎂、0.8-1.2μmol上遊內引物、0.8-1.2μmol下遊內引物、0.2-0.3μmol上遊外引物、0.2-0.3μmol下遊外引物和1-1.5mol甜菜鹼；上遊內引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下遊內引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上遊外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下遊外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。
2. 根據權利要求1所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒，其特徵在於所述 dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到 2: 1: 1: 1。
3. 根據權利要求1所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒，其特徵在於所述 每升lOxThe腦pol反應緩衝液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基 甲烷-鹽酸、80-120mmol氯化鉀、80-120mmol硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂 和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述顯色劑為的螢光染料SYBR GREEN I或 DNAGreen。
4. 一種按權利要求1所述的對蝦白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的檢測 方法，其特徵在於1) 待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到500-800 |aL 蒸餾水中調製勻漿後，再加入1.0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而後一併加 入到100 - 150 |i L滅菌雙蒸水中混句，並於IO(TC沸水洛中加熱10 - 15 rain, 待水浴後將其以10000-12000轉/分離心5-10min,取上清即為待檢樣品 模板DNA，待用2) 對蟲下白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增在21-23 n L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入1-2 (i L待檢樣 品模板DNA和，G. 5-1.5 U/iuL UNG酶，於恆溫95 。C放置3-5min,而後 置於冰上1-3 mill;待冷卻後加入、6-10 U/|a L Bst DNA聚合酶B，於60 -65。C恆溫放置45 - 90 min;而後再將溫度調到80 - 95°C中止反應，3-5 min後待用；3) 顯色檢測在反應液中加入l-3pL顯色劑C，觀察顏色變化； 每升環介導等溫擴增反應液A含10 x Thermopol反應緩衝液、300 - 500拜ld證、2-4 mmol硫酸鎂、0. 8 - 1. 2 n mol上遊內引物、0. 8 - 1. 2 |a mol下遊內引物、0.2-0. 3jumo1上遊外引物、0.2-0. 3jumo1下遊外引物和1 - 1. 5 mol甜菜鹼；上遊內引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、 下遊內引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、 上遊外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、 下遊外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。
5. 按權利要求4所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在 於所述dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。
6. 按權利要求4所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在 於所述每升lOxThermopol反應緩衝液含100_300mmol pH8. 8的三羥基 甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120腿o1氯化鉀、80-120隱o1硫酸銨、10-30隱o1 硫酸鎂和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述顯色劑為10%的螢光染料SYBR GREEN I或醒Green。
7. 根據權利要求4中所述的對蟲下白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的檢 測方法，其特徵在於所述步驟3)觀察顏色變化若顏色為黃色，說明待檢 樣品不含或者不是對蟲下白斑綜合症病毒，若顏色變為綠色，則說明待檢樣 品含有或者為對蟲下白斑綜合症病毒。
全文摘要
本發明涉及一種利用環介導等溫擴增技術進行菌樣檢測的方法，具體是一種對蝦白斑綜合症病毒快速檢測試劑盒的製備和檢測方法。試劑盒包含1-2mL環介導等溫擴增反應液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL顯色劑C；上遊內引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下遊內引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上遊外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下遊外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。本發明用於對蝦白斑綜合症病毒的檢測，特別適用於基層養殖場現場應用，使用範圍廣、檢測結果可靠。
文檔編號G01N33/50GK101307364SQ200810015290
公開日2008年11月19日 申請日期2008年4月18日 優先權日2008年4月18日
發明者李富花, 相建海, 高宏偉 申請人:中國科學院海洋研究所