一種用於表達lncRNA的慢病毒載體及其應用的製作方法
2023-06-12 00:21:06
一種用於表達lncRNA的慢病毒載體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種用於表達lncRNA的慢病毒載體及其應用，所述慢病毒載體的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，以pLL3.7質粒為骨架，以luc2基因替換質粒EGFP基因，以核苷酸序列為SEQIDNO.4的合成序列替換mU6啟動子序列；所述慢病毒載體用於lncRNA異位表達，不產生任何有效的細胞免疫應答，可以感染非分裂期細胞、容納外源性基因片段大，轉基因表達能持續數月，且引入luc2基因，不需要外源性激發光，避免對體內正常細胞造成損傷，有利於長期觀察。
【專利說明】—種用於表達IncRNA的慢病毒載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，特別是一種用於表達IncRNA的慢病毒載體及其應用。技術背景
[0002]長鏈非編碼RNA( long noncoding RNA,以下簡稱IncRNA)是一類長度大於200nt且不表現任何蛋白質編碼潛能的非編碼RNA (ncRNA)。IncRNA在結構上類似於信使RNA(mRNA),但序列中不存在開放閱讀框(open reading frame, 0RF)。許多已知的IncRNA由RNA聚合酶(RNA polymerase II,RNA polll)轉錄並經可變剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。IncRNA基因轉錄水平低於蛋白質編碼基因，廣泛存在於基因間內含子以及蛋白質編碼基因的反義鏈中，有些與蛋白質編碼基因或非編碼基因相重疊，有些僅在特定的組織中被優先轉錄。Kapranov等提出在人類細胞中，除核糖體RNA和線粒體RNA外,絕大部分RNA是未知功能的ncRNA，其中主要是IncRNA。目前已確定的IncRNA，多數通過順式作用調控基因的表達，影響表觀遺傳轉錄轉錄後等過程，參與生物體的胚胎發育組織分化器官形成等基本生命活動。與miRNA相比，IncRNA序列更長空間結構更複雜，因此信息含量更加豐富；其參與表達調控的分子機制也更加多樣，不僅可以通過直接結合來激活或抑制靶基因的表達，還能參與組蛋白修飾募集調控因子等；IncRNA作用範圍也更加廣泛，在染色質水平、表達水平和翻譯水平均可發揮調控作用。雖然目前已確定的IncRNA很多，但對其在生命活動過程中的具體調控機制及功能模式仍不清楚。最新發現，IncRNA在一些複雜疾病(如癌症、神經系統疾病等)的發生過程中異常表達，具有促使或抑制疾病發生的作用。因此，研究IncRNA對於認識生命體複雜而多層次的調控體系提高人類預防和治療疾病的能力以及探索生物進化規律等都具 有積極的生物學意義。
[0003]目前IncRNA的表達，多以真核質粒載體實現。但是真核質粒載體存在轉染效率低，不易構建穩定細胞系等缺點，因此提供一種可以實現IncRNA穩定的異位表達的載體，是本領域一直亟待解決的問題。
【發明內容】
[0004]針對上述IncRNA表達載體存在轉染效率低、不易構建穩定細胞系的問題，構建一種添加人EF-1a啟動子序列和SV40 polyA轉錄終止信號序列的慢病毒載體，實現IncRNA穩定的異位表達，本發明是這樣實現的:
一種用於表達IncRNA的慢病毒載體，其特徵在於，以pLL3.7質粒為骨架，以luc2基因(NCBI中GI =212717248)替換質粒EGFP基因，以核苷酸序列為SEQ ID N0.4的合成序列替換質粒mU6啟動子序列,所述慢病毒載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0005]本發明中所述luc2 (NCBI中GI =212717248)基因是以SEQ ID N0.1為上遊引物，SEQ ID N0.2為下遊引物，以pmirGLO質粒為模板擴增獲得。
[0006]本發明中，用於表達IncRNA的慢病毒載體在IncRNA異位表達中的應用。
[0007]本發明中，用於表達IncRNA的慢病毒載體在LncRNA MEG3 (NCBI中NR_002766.2)異位表達中的應用。
[0008]本發明的優點在於:
1、相對於目前常用的真核表達質粒，以慢病毒作為表達載體，不產生任何有效的細胞免疫應答，可以感染非分裂期細胞、容納外源性基因片段大，轉基因表達能持續數月，且無可觀察到的病理學現象。
[0009]2、螢光素酶(Luciferase)基因(luc2基因)，表達所產生的螢光素酶蛋白與其小分子底物螢光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發生氧化反應，在體外利用敏感的CXD設備形成圖像，可以實時連續動態監測體內的各種生物學過程，減少實驗動物數量，降低個體間差異的影響，具有較高的敏感性，並且不需要外源性激發光，避免對體內正常細胞造成損傷，有利於長期觀察。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為pLL3.7質粒結構示意圖。 [0011]圖2為pLL3.7_luc2質粒結構示意圖。
[0012]圖3為pLnc_luc2質粒結構示意圖。
[0013]圖4為pLnc-luc2_MEG3質粒結構不意圖。
[0014]圖5為MEG3表達量表達量示意圖。
[0015]圖6為螢光檢測MEG3表達量示意圖。
[0016]
【具體實施方式】
[0017]實施例涉及材料:
pmirGLO 質粒(pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector, E1330)、pGEM-T Easy Vector System (E1910)由 Promega 公司購入；
感受態細胞DH5 a (CB101-03)和質粒小提試劑盒(型號DP103)由天根生化科技有限公司購入；
Taq Plus DNA Polymerase (PC1200)由北京索萊寶公司購入；
快速DNA產物純化試劑盒(CW2301)由北京康為世紀公司購入；
T4 DNA Ligase (2011A) ,PrimeScrip RT Reagent Kit(RR037Q)由 TAKARA 公司購入；限制性內切酶 Nhe I (R0131S)、EcoR I (R0101S)、XbaI (R0145S)、NotI (R0189S)、BamH I (R0136S)和 Xho I (R0146S)酶由 NEB 公司購入；
pLL3.7 質粒、HEK-293T、pCMV — VSV — G 和 pCMV — dR8.91 由本室保存；
U251細胞由南京醫科大學姚堃教授贈予； polybrene (sc-134220)由 Santa Cruz 公司購入；
RNeasy Mini Kit (74104)由 Qiagen 公司購入；
DMEM 高糖培養基(I 1965-084)和 FBS (10099141)由 Life Technologies 公司購入； AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AP-GX-4)由Axygen公司購入；
胰酶細胞消化液(C0201)和螢光素酶報告基因檢測試劑盒(RG005)由碧雲天公司購
Λ；實施例培養基配方:
LB液體培養基:
配製每升培養基，在900 ml去離子水中加入:胰化蛋白腖IOg,酵母提取物5g,NaCl5g，搖動容器直至溶質溶解，用去離子水定容至1L，在用5mol/L NaOH調pH至7.0 ;在121°C下蒸汽滅菌20min ；
LB固體培養基:
在900 ml去離子水中加入:胰化蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，瓊脂粉15g，用去離子水定容至lL，5mol/L NaOH調pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min，待冷卻至55°C時加入氨苄青黴素至終濃度100 μ g/ml，傾倒入無菌平板內，待凝固成LB固體培養基。
[0018]DMEM完全培養基(含10%FBS) =DMEM高糖培養基與FBS按體積比9:1混合而成； 實驗設備:
PCR儀為C1000 Touch?,伯樂牛命醫學產品(h.海)有限公司:
突光測定儀 Turner DesignsTD-20/20 (E2041)購自 Promega 公司；
實施例涉及引物序列:
SEQ ID N0.1: 5 ' CGGCTAGCATGGAAGATGCCAAAAACATTA 3 '；
SEQ ID N0.2: 5 ' CGGAATTCTTACACGGCGATCTTGCCGCCC 3 '；
SEQ ID N0.7 5 ' GGGCATTAAGCCCTGACCTT 3'；
SEQ ID N0.8 5 ' CCTTGGGGAGGGAAACACTC 3'。
[0019]實施例1慢病毒載體的構建 l、pLL3.7-luc2 的構建
1.1 PCR 反應:
以pmirGLO質粒為模板，上遊引物SEQ ID N0.1，下遊引物SEQ ID N0.2擴增luc2 ；PCR 反應體系 40KL,其中 Taq Plus DNA Polymerase 2M-L, Master mix 12M-L, pmirGLO質粒 2μ?，10Mmol/L SEQ ID N0.1 2μ?, 10Mmol/L SEQ ID N0.2 2μ?, ddH20 20μ? ；
PCR反應程序:94°C預變性3 min; 94°C變性30 s，58°C退火30s，72°C延伸60s，共進行30個循環；72°C復性IOmin ；
1.2凝膠電泳:
對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，120V, 30min,依照說明書，用快速DNA產物純化試劑盒回收目的片段，獲得純化PCR產物；
1.3克隆載體的構建
在0.2ml PCR管中加入5 μ L步驟1.2獲得的純化PCR產物、I μ L 10Χ Ligationbuffer,3 μ L PGEM T Easy VectorU μ L Τ4 DNA Ligase，4°C下連接過夜，次日獲得連接產物；
1.4感受態細菌的轉化
1.4.1取5 UL步驟1.3獲得的連接產物，加入50 μ L感受態細胞DH5 α，混勻後冰浴30min，後42°C熱擊90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液體培養基，混勻後37°C，200rpm/min震蕩培養45min，獲得轉化後的連接產物；
1.4.2 將 x-gal 40 μ L (20mg/ml)和 IPTG 4μ L (200mg/ml)塗布於 LB 固體培養基上，加入200 μ L步驟1.4.1獲得的轉化後的連接產物，37°C倒置培養20h，培養基上生成白色菌落，這些白色菌即具有重組質粒；
1.5鑑定
隨機挑取步驟1.4.2獲得的2個菌落，分別接種於2mL LB液體培養基中，在37°C，250rpm/min條件下震蕩培養過夜，次日依照說明書，使用質粒小提試劑盒獲得重組質粒DNA;然後由金斯瑞生物科技有限公司對所獲得的的重組質粒DNA進行測序驗證，其序列與NCBI中GI =212717248序列相同，確定為luc2基因。
[0020]1.6 重組 pLL3.7 質粒
1.6.1對步驟1.5獲得重組質粒DNA和pLL3.7 (其質粒結構如圖1所示)質粒分別進行Nhe I和EcoR I雙酶切，酶切體系分別為:
重組質粒 DNA 6 μ L (310ng/y L) +IOx buffer 2 μ L+Nhe I I μ L+EcoR I Iμ L+ddH20 10 μ L ；
pLL3.7 質粒(300ng/y L) 10 μ L+10x buffer 2 μ L+Nhe I I μ L+EcoR I I μ L+ddH206 μ L ；
將上述反應體系分別於37°C，反應4h，後進行瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min，後使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，分別按照說明書回收電泳產物，即分別為重組質粒DNA酶切後純化產物和PLL3.7質粒酶切後純化產物；
1.6.2在0.2ml PCR管中加入5 μ L步驟1.6.1獲得的重組質粒DNA酶切後純化產物、I μ L IOX Ligation buffer,3 μ L步驟1.6.1獲得的pLL3.7質粒酶切後純化產物、IUL T4 DNA Ligase，4°C下連接過夜，次日獲得連接產物；取10 yL連接產物，加入50 μ L感受態細胞DH5 α，混勻後冰浴30min，後42°C熱擊90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液體培養基，混勻後37°C，200rpm/min震蕩培養45min後獲得菌液；取200 μ L獲得的菌液塗布於LB固體培養基上，37°C倒置培養20h，培養基上生成菌落。
[0021]1.6.3 鑑定:
隨機挑取步驟1.6.2獲得的2個菌落，分別接種於2mL LB液體培養基中，在37°C，250rpm/min條件下震蕩培養過夜，次日依照其說明，使用質粒小提試劑盒提取重組質粒，濃度為270ng/y L ;然後將獲得的重組質粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成測序，其序列如SEQ ID N0.3所示， 申請人:將其命名為pLL3.7_luc2，其質粒結構如圖2所示。
[0022]2、pLnc_luc2 構建
2.1依人EF-1 α啟動子序列、SV40 polyA轉錄終止信號序列及Xba I和Not I酶切位點序列設計合成序列,其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，交由金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成；
2.2對步驟2.1獲得的的合成產物和步驟1.6.獲得的pLL3.7_luc2質粒進行雙酶切:酶切體系分別為:
合成產物 6 μ L (150 ng/μ L) +IOx buffer 2 μ L+Xba I I μ L+Not I I μ L+ddH2010μ L ；
pLL3.7-luc2 質粒 10 μ L (300 ng/μ L) +IOx buffer 2 μ L+Xba I I μ L+Not II μ L+ddH20 6 μ L ；
將上述酶切體系分別置於37°C反應4h，後進行瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min，再使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，按照試劑盒操作要求回收電泳產物，獲得合成序列酶切後純化產物和PLL3.7-luc2質粒酶切後純化產物；
在0.2ml PCR管中加入5 μ L合成序列酶切後純化產物、I μ L IOX Ligation buffer、3 yL pLL3.7-luc2質粒酶切後純化產物、I μ L T4 DNA Ligase，4°C下連接過夜，次日獲得連接產物；取10 UL連接產物，加入50 μ L感受態細胞DH5 α，混勻後冰浴30min，後42°C熱擊90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液體培養基，混勻後37°C，200rpm/min震蕩培養45min後獲得菌液；取200 μ L獲得的菌液塗布於LB固體培養基上，37°C倒置培養20h，培養基上生成菌落。
[0023]鑑定:隨機挑取生成的2個菌落，分別接種於2mL LB液體培養基中，在37°C，250rpm/min條件下震蕩培養過夜，次日依照其說明使用質粒小提試劑盒獲得目的質粒，濃度為250ng/ μ L ;將目的質粒交由金斯瑞生物科技有限公司對目的基因進行測序，其序列如SEQ ID N0.5所示， 申請人:將其命名為pLnc-luc2，其質粒結構如圖3所示。
[0024]
實施例2 pLnc_luc2質粒表達LncRNA MEG3
LncRNA MEG3質粒(NCBI中NR_002766.2)由金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。
[0025]1、對LncRNA MEG3質粒和實施例1獲得的pLnc_luc2質粒進行BamH I和Xho I雙酶切，反應體系如下:
LncRNA MEG3 質粒 6 μ L(260ng/μ L)+10x buffer 2 μ L+BamH I I μ L+Xho I I μ L+ddH2010μ L ；
pLnc_luc2 質粒 10 μ L(320ng/μ L)+10x buffer 2 μ L+ BamH I I μ L+Xho I I μ L+ddH206 μ L ；
將上述反應體系分別置於37 V反應4h，後進行瓊脂糖凝膠電泳，120V,30min,電泳後，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒，按照說明書，回收電泳產物，獲得LncRNA MEG3 DNA酶切後純化產物和pLnc-luc2質粒酶切後純化產物；
鑑定:在0.2ml PCR管中加入5 μ LLncRNA MEG3 DNA酶切後純化產物、I μ L IOXLigation buffer、3 μ LpLnc_luc2質粒酶切後純化產物、I μ L T4 DNA Ligase, 4°C下連接過夜，次日獲得連接產物；取10 UL連接產物，加入50 μ L感受態細胞DH5 α，混勻後冰浴30min，後42°C熱擊90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液體培養基，混勻後37°C，200rpm/min震蕩培養45min，獲得菌液；取200 μ L獲得的菌液塗布於LB固體培養基上，37°C倒置培養20h，培養基上生成菌落。
[0026]隨機挑取生成的2個菌落，分別接種於2mL LB液體培養基中，在37°C，250rpm/min條件下震蕩培養過夜，次日使用質粒小提試劑盒，依照說明書，獲得重組質粒DNA，其濃度為350 ng/μ L ;將重組質粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成測序，其序列如SEQ ID N0.6所示，從核苷酸序列中可以看出，MEG3基因已經插入到pLnc-lUc2質粒中， 申請人:將該重組質粒自命名為pLnc-luc2-MEG3，其結構如圖4所示。
[0027]2、細胞培養及病毒包裝
2.1細胞培養及pLnc-luc2-MEG3病毒包裝
在6孔細胞培養板中每孔接種約I X IO6個HEK-293T細胞，分別加入2mL DMEM完全培養基，37 °C，5%C02培養24h，當細胞匯合度達到80%~90%時，按照I ipof ectin2000 Transfection Reagent 說明書(Life Technologies, 11668019)將三質粒系統(pLnc-luc2-MEG3,1.5 g; pCMV - VSV - G, 0.5 g; pCMV — dR8.91，I g)轉染至 HEK-293T細胞中，轉染48h後，收集培養上清液，4°C下，3000g離心lOmin，去除細胞碎片，然後將所得上清液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為pLnc-luc2-MEG3病毒液；
2.2細胞培養及pLnc-luc2病毒包裝
在6孔細胞培養板中每孔接種約IX IO6個HEK-293T細胞，分別加入2mL DMEM完全培養基，37°C，5%C02培養24h，當細胞匯合度達到80%~90%時，按照Iipofectin 2000Transfection Reagent 說明書(Life Technologies, 11668019)將三質粒系統(pLnc_luc2,1.5 g; pCMV - VSV - G,0.5 g; pCMV — dR8.91，I g)轉染至 HEK-293T 細胞中，轉染 48h後，收集培養上清液，4°C下，3000g離心lOmin，去除細胞碎片，然後將上清液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為pLnc-luc2病毒；
3、慢病毒感染U251細胞
3.1取步驟2.1獲得的pLnc-luc2-MEG3病毒液0.2 ml，加入I ml的DMEM高糖培養基稀釋病毒，在加入終濃度為5μ g / ml的polybrene,獲得含pLnc_luc2_MEG3病毒的DMEM
培養基；
3.2接種U251細胞於6孔板，1O5個/孔，分別加入DMEM完全培養基2 ml/孔，37°C，5%C02培養24h，待細胞 密度約為50%時，去除培養基，分別加入步驟3.1獲得的含pLnc-luc2-MEG3病毒的DMEM培養基，Iml/孔，培養24h後，去除含pLnc-luc2_MEG3病毒的DMEM培養基培養基，分別加入DMEM完全培養基，2 ml/孔；再分別每孔加入Iml的胰酶細胞消化液，待細胞消化後，用DMEM完全培養基稀釋成20個/ml，用吸管將細胞懸液分別種入微量培養盤，每孔0.05ml，細胞含量分別為I個/孔，37°C，5%C02培養7天；選擇只有一個集落生長的孔，待集落布滿孔底的1/3~1/2時，傳代入六孔板，即為pLnc-luc2-MEG3載體過表達細胞克隆株；
3.3取步驟2.2獲得的pLnc-luc2病毒液0.2 ml，加入I ml的DMEM高糖培養基稀釋病毒，在加入終濃度為5 μ g / ml的polybrene,獲得含pLnc_luc2病毒的DMEM培養基；
3.4接種U251細胞於6孔板，IO5個/孔，加入DMEM完全培養基2 ml/孔，37°C，5%C02培養24h，待細胞密度約為50%時，去除培養基，加入步驟3.3獲得的含pLnc-luc2病毒的DMEM培養基，Iml/孔，培養24h後，去除含pLnc_luc2病毒的DMEM培養基，加入DMEM完全培養基，2 ml/孔；再每孔加入Iml的胰酶細胞消化液，待細胞消化後，用DMEM完全培養基稀釋成20個/ml，用吸管將細胞懸液分別種入微量培養盤，每孔0.05ml，細胞含量分別為I個/孔，370C，5%C02培養7天。選擇只有一個集落生長的孔，待集落布滿孔底的1/3~1/2時，傳代入六孔板，即為pLnc-luc2載體過表達細胞克隆株；
4、螢光定量PCR檢測MEG3基因表達量
分別接種U251細胞、步驟3.4獲得的pLnc-luc2載體過表達細胞和步驟3.2獲得的pLnc-luc2-MEG3載體過表達細胞於培養瓶(25cm2生長面積)中，分別編號1_3，在細胞鋪滿80%~90%瓶底面積時，依照說明書，分別用RNeasy Mini Kit提取各組細胞的總RNA，利用PrimeScrip RT Reagent Kit 將總 RNA 逆轉錄為 cDNA (依照 PrimeScrip RT Reagent Kit說明書)，分別以1-3組細胞的cDNA為模板，上遊引物SEQ ID N0.7，下遊引物SEQ ID N0.8，利用 SYBR Primescript RT-PCR Kit (依照 Primescript RT-PCR Kit 說明書)，依照表 I 所示反應體系檢測各組細胞MEG3基因相對表達量。[0028]表1 MEG3基因檢測20μ?體系中各組分
【權利要求】
1.一種用於表達IncRNA的慢病毒載體，其特徵在於，以pLL3.7質粒為骨架，以luc2基因替換質粒EGFP基因，以核苷酸序列為SEQ ID N0.4的合成序列替換mU6啟動子序列，所述慢病毒載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
2.根據權利要求1所述的用於表達IncRNA的慢病毒載體，其特徵在於，所述luc2基因是以SEQ ID N0.1為上遊引物，SEQ ID N0.2為下遊引物，以pmirGLO質粒為模板擴增獲得。
3.如權利要求1所述的用於表達IncRNA的慢病毒載體在IncRNA異位表達中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，所述IncRNA為LncRNAMEG3。
【文檔編號】C12N15/867GK103834692SQ201410068610
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月27日 優先權日:2014年2月27日
【發明者】陳雲, 林喆, 孫倍成, 唐俊偉, 萬昕, 卓晗, 夏陽 申請人:南京醫科大學