腫瘤壞死因子抗體，其製備方法以及藥物組合物的製作方法

2023-06-11 20:19:21 1

專利名稱：腫瘤壞死因子抗體，其製備方法以及藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域。更具體地，本發明涉及腫瘤壞死因子抗體、其編碼序列、製備方法及其應用。
背景技術：
腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)是機體內的一種多功能免疫調節分子，它可以和細胞膜上的受體結合發揮作用，往往引起靶細胞的死亡(它的名稱即來源於此)或招引免疫效應細胞在局部的聚集。TNFα是一種可溶性的同源三聚體亞基，分子量為17KD(Smith，et al.，J.Biol.Chem.2626951-6954，1987)。也發現有跨膜結合的前體TNFα，分子量為26KD(Kriegler，et al.，Cell5345-53，1988)。單核巨噬細胞在受到內毒素和其他一些刺激物刺激後，能夠分泌TNFα和TNFβ，另外其他一些細胞也能分泌TNF。
TNFα在類風溼關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的病理進程中起十分關鍵的作用，患者或動物模型病變關節腔內的TNF水平異常升高(Feldman M，Brennan FM，Maini RN.The role of cytokines in rheumatoid arthritis.AnnRev Immunol 1996；14397；Grom A，Murray KF，Luyrink L等)。一方面，它和關節滑膜細胞的受體結合造成該細胞直接損傷；另一方面，它可以召集免疫效應細胞聚集至此，分泌更多的細胞因子，產生更強更持久的自身免疫反應。在RA病患部位有過量的TNF-α表達，是造成患病部位腫脹和疼痛的主要因素之一。而TNF單克隆抗體可以中和TNFα，在體內對TNF的活性起到了負調節的作用。而且有大量研究表明，TNF還是引起膿毒性休克綜合症的主要介質。膿毒性休克綜合症患者血清中TNF-α水平升高預示著死亡率或致殘率升高。臨床上應用TNF-α抗體或者其受體對膿毒性休克綜合症有一定療效。另外TNF抗體有療效的疾病還包括細菌或病毒感染、慢性炎症、自身免疫疾病、惡性腫瘤和/或神經退行性疾病等。
1987年，Cerami等人獲得一種TNF的多克隆鼠抗體(EPO專利出版物0212489，1987年3月4日)，可用於細菌感染引起的休克診斷性免疫測定和治療。後來又相繼獲得了TNF的單克隆抗體，如Rubin et al.，EPO專利出版0218868，1987年4月22日和Yone等人的EPO專利出版物0288088，1988年10月28日中所描述的。
另外一些研究者描述了對重組人TNF特異性的單克隆抗體，在體外具有TNF中和活性(Liang，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854，1986；Meager，et al.，Hybridoma 6305-311，1987)。
但是，由於上述研究得到的多為鼠源抗體，這些抗體都存在不同程度的免疫原性高、特異性低和/或穩定性不夠等問題，沒有提供一種能夠在體內發揮診斷或治療作用。
因此，本領域迫切需要建立既能夠保持或提高抗體的親和力和特異性，又能夠降低或基本消除抗體免疫原性的抗TNF抗體，從而可以用於臨床治療。

發明內容
本發明的目的提供一種特異性高、免疫原性低的抗TNF單克隆抗體。
本發明的另一目的是提供所述抗TNF單克隆抗體的製備方法。
本發明的另一目的是提供一種含所述抗TNF單克隆抗體的藥物組合物。
在本發明的第一方面，提供了一種單克隆抗體VH鏈，具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中1-119；SEQ ID NO12中1-118；SEQ ID NO14。
在本發明的第二方面，提供了一種單克隆抗體VL鏈，具有選自下組的CDR的胺基酸序列SEQ ID NO10中135-241；SEQ ID NO12中134-244；SEQ ID NO16。
在本發明的第三方面，提供了一種單克隆抗體，其VH鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中1-119；SEQ ID NO12中1-118；SEQ ID NO14；且其VL鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO10中135-241；SEQID NO12中134-244；SEQ ID NO16。
在一優選例中，所述的單克隆抗體的Fc區為人IgG的恆定區。
在另一優選例中，所述抗體是單鏈抗體。
在另一優選例中，所述抗體具有SEQ ID NO10或12所示的胺基酸序列。
在本發明的第四方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的多肽本發明上述的單克隆抗體VH鏈；本發明上述的單克隆抗體VL鏈；本發明上述的單克隆抗體。
較佳地，所述的DNA分子具有選自下組的DNA序列SEQID NO9、11、13、和15。
在本發明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有單克隆抗體和藥學上可接受的載體，其中所述抗體的VH鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中1-119；SEQ ID NO12中1-118；SEQ ID NO14；且其VL鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中135-241；SEQ ID NO12中134-244；SEQ ID NO16。
在本發明的第六方面，提供了本發明所述單克隆抗體的用途，它被用於製備治療類風溼關節炎的藥物。


圖1是質粒pL101的結構圖。其中，pA表示SV40病毒的加「poly A」尾信號；hCMV promotor表示人巨細胞病毒的啟動子(含增強子序列)；AmpR表示氨苄青黴素抗性基因；IgG1 constant表示人IgG1恆定區。
圖2顯示了不同劑量的本發明單克隆抗體對類風溼關節炎的治療作用。
具體實施例方式
本發明基於噬菌體抗體庫技術克隆和表達腫瘤壞死因子抗體，經過篩選獲得的抗體是全人源的，克服了目前存在的鼠源抗體免疫原性高的缺點。比之從雜交瘤等獲取抗體基因，本發明的全人源和嵌合抗體製備程序先進簡便、價格低廉，更重要的是這種直接從人外周血淋巴細胞中擴增抗體基因的方法，是解決雜交瘤技術等一直無法解決的人源性抗體來源問題的根本途徑。
本發明提供了一種嵌合或重組抗TNF人源化單克隆抗體，它包括人源恆區(如人源恆區IgG1-Fc)，經過人工設計後的重鏈可變區和輕鏈可變區具有獨特的不同於現有技術的結構。
本發明還提供了嵌合抗TNF單克隆抗體的胺基酸序列及其其可變區鏈，以及具有這些鏈的其他蛋白質或融合表達產物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。
抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為超變區域(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，通過其間的FR形成的β摺疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可以通過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。
此外，最近還發現由輕鏈可變區構成的相關結構，與相應的重鏈可變區相比，其結合的動力學比較小，分離的重鏈可變區域自身具有抗原結合活性。
本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab』)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS7、293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯物，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中， 其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、靜脈內、或局部給藥。
本發明的藥物組合物可用於治療類風溼關節炎，以及其他需要抑制TNF的場合。
本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明的抗體以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明的突出優點在於本發明的單克隆抗體的具有很高的親和力且是人源化的抗體。這種高親和力的單克隆抗體在臨床上具有重要的價值。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人源性單鏈抗體(scFv)基因庫的構建(1).CDNA的製備收集1000人的外周血各5ml，混合，用淋巴細胞分離液(醫科院天津血研所生產)分離單個核細胞。用Invitrogen公司的試劑盒，從分離的人外周血淋巴細胞中提取細胞的總mRNA。用GIBCO公司的mRNA純化試劑盒純化，以上述獲得的mRNA為模板，反轉錄出cDNA第一鏈。以上步驟按照廠家提供的說明書進行。
(2).PCR擴增參照國內外已發表的多種人抗體基因家族序列中V區FR1和FR4較保守的區段序列，設計併合成以下人抗體VH基因(hVH)、VL基因(hVL)、5端(back)、3端(forward)引物。其中為了進一步加強引物對人抗體V區基因擴增的通用性，在各引物序列中引入了多處簡併位點(多義位點)。根據所用載體pCANTAB5E(一種噬粒，為Pharmacia公司產品)加入了適當的限制酶切位點序列。引物序列如下hVH back(含SfiI位點)5』-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG YTR NDGSAG TCD GS-3』(SEQID NO1)hVH forward5』-TGA GGA GAC GGT GAC CRK KGT BCC-3』(SEQ ID NO2)hVL back5』-GAM ATY SWG MTS ACB CAG TCT CC-3』(SEQ ID NO3)hVL forward(含Not I位點)5』-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT YTC CAS YYK KGT CCC-3』(SEQID NO4)其中，引物序列中的多義位點代號，系根據國際生物化學學會(IUB)命名委員會(NC)公布的標準方案所編。引物均委託上海生工公司進行合成。
PCR反應以步驟(1)獲得的轉錄cDNA產物為模板，分別以VH引物對或VL引物對進行PCR擴增。在100μl總反應體積中加入4 U Taq酶(購自華美公司)，條件為94℃60s，52℃70s，72℃80s，共30個循環，末次72℃延伸10min。
(3).PCR產物的回收及純化按照上述條件進行PCR後，將產物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳進行鑑定，發現有分子量分別在310bp左右和300bp左右的兩條條帶，用Promega公司的膠回收試劑盒回收片段，操作按照廠家的說明書進行。
(4).人源性單鏈抗體(scFv)基因的構建以(Gly4Ser)3為接頭序列(SEQ ID NO5)分別連接VH和VL構成重鏈-接頭序列-輕鏈結構的ScFv基因。接頭引物根據接頭序列模板及人抗體V區基因序列3端、5端部分序列設計併合成接頭模板DNA序列5』-GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG-3』(SEQID NO6)用於ScFv接頭反向VH序列5』-GVA CMM YGG TCA CCG TCT CCT CAG GTGGAG GCG GTT CAG G-3』(SEQID NO7)用於ScFv接頭反向VL序列5』-GGA GAC TGV GTS AKC WSR ATK TCC GAT CCG CCA CCG CCA GAG-3』(SEQ IDNO8)其中，引物序列中多義位點代號執行IUB所屬NC公布的國際標準，均委託上海生工公司進行合成。
以上述接頭模板和引物進行PCR擴增及回收、純化(PCR條件及回收、純化方法均同上)。分離獲得長度約為100 bp的接頭序列。
實施例2ScFv片段克隆進入噬菌粒載體按照上述條件進行PCR後，獲得兩端帶有SfiI和NotI酶切位點的ScFv片段，進行離心柱(spun-column)層析純化，去除不必要的接頭引物和dNTP。將純化完畢的ScFv片段用SfiI和NotI(均購自Promega公司)進行雙酶切，產生可與載體pCANTAB5E(Pharmacia公司)相連接的粘性末端。再一次進行離心柱層析純化，去除可能影響其與載體連接的小的SfiI或NotI片段。
噬菌粒載體pCANTAB5E(Pharmacia公司)本身包含有SfiI和NotI酶切粘性末端，可與上述ScFv片段相連接。採用常規的DNA連接酶，將ScFv片段克隆進入噬菌粒載體上相應的位點。在pCANTAB5E載體上其相鄰位置是g3p基因，將來可表達ScFv-g3p融合基因。
1升LB培養液加入1ml過夜培養的TG1細胞(Pharmacia公司)，培養至OD值約0.3～0.4，4000rpm離心收集細胞，10倍體積的的冰純水洗滌兩次，重懸於1ml含2％的酵母粉、1％蛋白腖、1mM MgCl2的10mM Tris-HCl緩衝液(PH8.0)中。100μl電擊感受態細胞加入連接過夜的DNA樣品100ng，電壓為10千伏進行電擊，將包含ScFv片段的連接載體轉染進入E.coli TGl細胞。然後將E.coli細胞培養於SOBAG(含100mg/L氨苄青黴素和2％葡萄糖的SOB培養基)瓊脂板，培養溫度為30℃，其中轉化有pCANTAB5E載體的Ecoli細胞成活。反覆進行電轉化，使所獲抗體庫的容量達到1×1011。
以2×YTAG(含100mg/L氨苄青黴素及2％葡萄糖的2×YT培養基)稀釋細菌至OD600＝0.2；再以15ml該懸液培養至對數生長期，加入1011pfu的M13K07輔助噬菌體(購自Promega公司)，37℃振搖培養1h，離心後重懸於10ml2×YTAK(含100mg/L氨苄青黴素及70μg/ml卡那黴素的2×YT培養基)，搖床培養過夜，於4℃以1500×g離心15min。收集上清即為人源性ScFv噬菌體展示文庫。將其分裝後於-20℃保存，以備下一步以特異性抗原對文庫進行″淘選(panning)″篩選。
實施例3淘選抗體庫對於實施例2得到的噬菌體展示文庫中的抗體，通過淘選技術選擇親和力高的抗體。
用重組人TNF(rhTNF)抗原(購自深圳晶美公司)包被酶聯板，BSA封閉，溫育2h，洗板後加50μl噬菌體抗體庫(約1012CFU)溫育2h，TBST(Tris 50mmol/L，NaCl150mmol/L，Tween-20 0.5％，BSA 1％，pH7.5)液洗1次(第2輪洗5次，第3輪後洗10次，每次5min)，以50μl洗脫液回收噬菌體，中和緩衝液調節pH至中性，感染Ecoli TGl，進行下一輪篩選。共進行3輪篩選，移走沒有抗原結合能力的噬菌粒。
進行夾心ELISA實驗，測定抗體的抗原結合活性。加入50μl 200ng/ml的重組人TNF(rhTNF)抗原包被酶聯板，BSA封閉，37℃溫育1h，加入用PBST(KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.8mol/L，NaCl 137mmol/L，Tween-20 0.5％，pH7.4)對倍稀釋的噬菌體抗體，37℃孵育2 h。洗板，加入HRP標記的羊抗M13單抗(購自Pharmacia公司)，37℃1h。用1％Tween-20的PBS洗板，加底物液顯色，在讀板機上讀取595納米處的光吸收。根據計算陽性率接近20％，確定其中親和力最強的克隆，用於下一步的研究。
將上述挑選出2個親和力最強的克隆感染E.coli HB2151細胞(Pharmacia公司)，平板培養，從轉化板上挑取單個菌落，用2×YTAG(含100mg/L氨苄青黴素和2％葡萄糖的2×YT培養液)於30培養過夜，以鹼裂解法小量提取噬菌粒DNA，PCR擴增出ScFv基因片段，並克隆入pUC19載體，進行序列測定，包括預期的VH，VL基因和接頭序列。VH基因序列處於接頭的上遊，VL基因序列處於接頭的下遊。結果如下(其中下劃線部分為接頭序列)克隆1GAGGTGAAGC TGGAGGAGTC CGGCGGCGGC CTGGTGCAGC CCGGCGGCTC CATGAAGCTG 60TCCTGCGTGG CCACCGGCTT CATCTTCTCC AACCACTGGA TGAACTGGGT GCGCGAGACC 120CCCGAGAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCGAG ATCCGCTCCA AGTCCATCAA CTCCGTGACC 180CACTACGCCG AGTCCGTGAA GGGCCGCTTC CCCATCTCCC GCGACGACTC CAAGTCCGCC 240GTGTACCTGC AGCTGACCGA CCTGCGCACC GAGGACACCG GCGCCTACTA CTGCTCCCGC 300AACTACTACG GCTCCACCTA CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCACCCTGAC CGTGTCCGGC 360GGCGGCGGCT CCGGCGGCGG CGGCTCCGGC GGCGGCGGCT CCGACATCCT GCTGACCCAG 420TCCCCCGCCA TCCTGTCCGT GTCCCCCGGC GAGCGCGTGT CCCCCTCCTG CCGCGCCTCC 480CAGTTCGTGG GCTCCACCAT CCACTGGTAC CAGCAGCGCA CCAACGGCTC CCCCCGCCTG 540CTGATCAAGT ACGTGTCCGA GTCCATGTCC GGCATCCCCT CCCGCTTCAC CGGCTCCGGC 600TCCGGCACCG ACTTCACCCT GTCCATCAAC ACCGCCGAGT CCGAGGACGT GGCCGACTAC 660TACTGCCAGC AGTCCCACTC CTGGCCCTTC ACCTTCGGCT CCGGCACCAA CCTGGAGGTG 720AAG723(723bp)(SEQ ID NO9)其中，重鏈可變區為SEQ ID NO9中第1-357位，輕鏈可變區為403-723位。
EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCVATGFIFS NHMMNWVRET PEKGLEWVAE IRSKSINSVT 60HYAESVKGRF PISRDDSKSA VYLQLTDLRT EDTGAYYCSR NYYGSTYDYW GQGTTLTVSG 120GGGSGGGGSG GGGSDILLTQ SPAILSVSPG ERVSPSCRAS QFVGSTIHWY QQRTNGSPRL 180LIKYVSESMS GIPSRFTGSG SGTDFTLSIN TAESEDVADY YCQQSHSWPF TFGSGTNLEV 240K 241(SEQID NO10)其中，重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO10第1-119位，輕鏈可變區為135-241位。
克隆2ATGGCCAACG TGCAGCTGGT GCAGTCCGGC GCCGAGGTGA AGAAGCCCGG CGAGTCCCTG 60AAGATCTCCT GCAAGGGCTC CGGCTACTCC TTCACCTCCT ACTGGATCGG CTGGGTGCGC 120CAGATGCCCG GCAAGGGCCT GGAGTGGATG GGCATCATCT ACCCCGGCGA CTCCGACACC 180CGCTACTCCC CCTCCTTCCA GGGCCAGGTG ACCATCTCCG CCGACAAGTC CATCTCCACC 240GCCTACCTGC AGTGGTCCTC CCTGAAGGCC TCCGACACCG CCATGTACTA CTGCGCCTCC 300CACGGCTGGG GCATGGACGT GTGGGGCCAG GGCACCCTGG TGACCGTGTC CTCCGGCGGC 360GGCGGCTCCG GCGGCGGCGG CTCCGGCGGC GGCGGCTCCG CCGCCGTGCT GACCCAGCCC 420TCCTCCGTGT CCGGCGCCCC CGGCCAGCGC GTGACCATCT CCTGCACCGG CTCCTCCTCC 480AACATCGGCG CCGGCTACGA CGTGCACTGG TACCAGCAGC TGCCCGGCAC CGCCCCCAAG 540CTGCTGATCT ACGGCAACTC CAACCGCCCC TCCGGCGTGC CCGACCGCTT CTCCGGCTCC 600AAGTCCGGCA CCTCCGCCTC CCTGGCCATC ACCGGCCTGG CCGCCGAGGA CGAGGCCGAC 660TACTACTGCC AGTCCTACGA CTCCTCCCTG TCCGGCTCCG TGTTCGGCGG CGGCACCAAG 720CTGACCGTGC TG 732(SEQ ID NO11)其中，重鏈可變區為SEQ ID NO11中第1-354位，輕鏈可變區為第400-732位。
從上述DNA序列中推導出的胺基酸序列為MANVQLVQSG AEVKKPGESL KISCKGSGYS FTSYWIGWVR QMPGKGLEWM GIIYPGDSDT 60RYSPSFQGQV TISADKSIST AYLQWSSLKA SDTAMYYCAS HGWGMDVWGQ GTLVTVSSGG 120GGSGGGGSGG GGSAAVLTQP SSVSGAPGQR VTISCTGSSS NIGAGYDVHW YQQLPGTAPK 180LLIYGNSNRP SGVPDRFSGS KSGTSASLAI TGLAAEDEAD YYCQSYDSSL SGSVFGGGTK 240LTVL 244(SEQ ID NO12)其中，重鏈可變區對應的胺基酸序列為SEQ ID NO12第1-118位，輕鏈可變區為134-244位。
將上述親和力較強的含scFv基因的重組噬菌粒菌種接種於5ml LB培養基，過夜培養。加至50ml SBAG(含100mg/L氨苄青黴素和2％葡萄糖的SB培養液)中，30℃振蕩培養1h，5000rpm離心15min，棄上清。將沉澱重懸於50ml SBAI(含100mg/L氨苄青黴素和1mmol/L IPTG的SB培養液)中，37℃誘導3h，離心同上。取沉澱懸於5ml新配製的溶菌酶(1g/L)，20％(w/v)蔗糖，30mmol/LTris-Cl(pH8.0)及1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液中，冰浴10min，4℃以12000rpm離心5min，上清即為外周質部分。將其冷凍乾燥後，存貯於-20℃。臨用前以0.01mol/L PBS溶解至500μl。
上述獲得的單鏈抗體按照常規方法進行Wersten印跡試驗，結果測得其具有抗原特異性。
實施例4重新克隆到含有人源恆區的表達載體pL101，轉化CHO細胞分別設計和合成重鏈和輕鏈的引物，在重鏈引物前端加上XbaI/NheI酶切位點；在輕鏈引物前端加上HindIII/BsiWI酶切位點。
各引物設計如下克隆1引物A5』-CAGGCTAGCGAGGTGAAGCTGGAGGAGTCCG-3』(SEQ ID NO17)引物a5』-CAG TCTAGAGGACACGGTCAGGGTGGTGCCCTG-3』(SEQ ID NO18)引物B5』-CAGAAGCTTCCGACATCCTGCTGACCCAGTCC-3』(SEQID NO19)引物b5』-CAGCGTACGCTTCACCTCCAGGTTGGTG-3』(SEQ ID NO20)克隆2引物C5』-CAGGCTAGCATGGCCAACGTGCAGCTGGTGCAG-3』(SEQID NO21)引物』c5』-CAGTCTAGAGCCGGAGGACACGGTCACCAGGG-3』(SEQ ID NO22)引物D5』-CAGAAGCTTGCCGTGCTGACCCAGCCCTCC-3』(SEQ ID NO23)引物d5』-CAGCGTACGCAGCACGGTCAGCTTGGTGC-3』(SEQ ID NO24)分別用上述合成的引物，以實施例3獲得的ScFv片段為模板，按常規方法進行PCR，獲得帶有相應酶切位點的重鏈可變區片段和輕鏈可變區片段。
將上述重鏈可變區(SEQ ID NO9中第1-357位(對應的胺基酸序列為SEQ IDNO10第1-119位)，或SEQ ID NO11中第1-354位(對應的胺基酸序列為SEQ IDNO12第1-118位))插入到表達載體pL101的XbaI/NheI位點中，再用Hind III和Bsi WI將上述抗體輕鏈可變區(SEQID NO9中第403-723位(對應的胺基酸序列為SEQID NO10第135-241位)，或SEQ ID NO11中第400-732位(對應的胺基酸序列為SEQ ID NO12第134-244位))插入到插入有重鏈可變區編碼序列的pL101的HindIII/Bsi WI位點中，構建成人源TNF抗體的表達載體。表達載體pL101購自Invitrogen公司，其結構圖見圖1。
上述構建的帶有抗體基因的表達載體轉入在大腸桿菌DH5α菌株，然後接種於100毫升LB培養基中進行擴增，用Qiagen公司的超純質粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提純化質粒DNA。將上述純化的質粒DNA採用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒轉染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉化的CHO細胞在選擇培養基上進行連續9周的選擇，最後在96孔板上進行極度稀釋培養，連續進行3次，進行單克隆化。
挑出的單克隆細胞系在RPMI 1641培養基上進行培養，對上清進行Western印跡實驗，根據染色反應判斷表達強度，挑選出8個表達較強的克隆作為候選細胞株。
實施例5篩選CHO細胞中的表達強度高的克隆將上述篩選得到的高表達候選克隆培養於10ml的方形細胞瓶中，採用ELISA法測量抗體的表達量羊抗人IgG(Fc)包被於ELISA板，4℃過夜，經2％BSA於37℃封閉2小時，加入待測的培養上清和標準品(人IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進行結合反應，37℃孵育1小時，加入TMB於37℃作用10分鐘，最後用H2SO4終止反應，測A450值。測得上述8個候選克隆的表達量如下表1抗體基因在CHO細胞中表達強度(mg/l)

從表1可以看出，編號為6F5、7A3和2B3的細胞株具有很高的表達水平(140-290毫克/升)，其中6F5的表達量達到了290.7毫克/升。挑選表達量高的克隆進行大規模細胞培養並純化，製備抗TNF抗體。
實施例6人鼠嵌合TNF-alpha單克隆抗體的研製過程採用40mu.g純化的重組人TNF(rhTNF，Invitrogen產品，購自深圳晶美公司)作為免疫原，加入等體積的完全弗氏佐劑，充分研磨至完全乳化後常規皮下多點注射10日齡Balb/c小鼠，每點注射50微升，共6點。然後以1周間隔共5次重複注射以加強免疫反應，並對血清抗體水平進行監測。最後一次靜脈注射5×106新鮮細胞(即分泌TNF抗體的細胞株)/PBS混合液。
4天後，將小鼠處死，取出脾細胞，製備成懸浮液。將脾細胞與非分泌雜交瘤細胞Sp2/O(購自ATCC，保藏號CRL1581)以4∶1進行PEG融合。在37℃孵育6小時，將O.2ml融合細胞轉入96孔板，培養細胞。24小時後加入選擇培養液，每3天更換新鮮培養基1次，至長出克隆。
選擇單克隆形成孔，在第14天取出上清液，進行成熟B淋巴細胞細胞螢光染色(上清與B淋巴細胞37度溫育30分鐘，1XPBS洗滌10次，加入FITC標記的兔抗鼠抗體作為二抗，1XPBS洗滌10次，含有1％Tween-20的1XPBS洗滌10次，含有0.5％Triton X-100的1XPBS洗滌10次，在酶標儀上讀取650nm處的螢光強度)。陽性孔保留，亞克隆3次後選擇高表達細胞株。
採用5』RACE的方法來獲取單抗的可變區基因，克隆到pGEM-T(Promega)載體中，轉化大腸桿菌TG1細胞後在IPTG/X-gal平板上進行篩選，挑取白色菌斑接種於含有氨苄青黴素的LB液體培養基中擴增。篩選陽性克隆，用QIAGEN質粒抽提試劑盒抽提質粒並進行測序，確定重鏈和輕鏈可變區序列。
獲得的鼠源抗人TNFa單抗測定的DNA序列如下重鏈可變區GAAGTGAAGC TTGAGGAGTC TGGAGGAGGC TTGGTGCAAC CTGGAGGATC CATGAAACTC 60TCCTGTGTTG CCTCTGGATT CATTTTCAGT AACCACTGGA TGAACTGGGT CCGCCAGTCT 120CCAGAGAAGG GGCTTGAGTG GGTTGCTGAA ATTAGATCAA AATCTATTAA TTCTGCAACA 180CATTATGCGG AGTCTGTGAA AGGGAGGTTC ACCATCTCAA GAGATGATTC CAAAAGTGCT 240GTCTACCTGC AAATGACCGA CTTAAGAACT GAAGACACTG GCGTTTATTA CTGTTCCAGG 300AATTACTACG GTAGTACCTA CGACTACTGG GGCCAAGGCA CCACTCTCAC AGTCTCC 357(SEQ ID NO13)推測的胺基酸序列為EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCVASGFIFS NHWMNWVRQS PEKGLEWVAE IRSKSINSAT 60HYAESVKGRF TISRDDSKSA VYLQMTDLRT EDTGVYYCSR NYYGSTYDYW GQGTTLTVS 119(SEQID NO14)輕鏈可變區GACATCTTGC TGACTCAGTC TCCAGCCATC CTGTCTGTGA GTCCAGGAGA AAGAGTCAGT 60TTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GTTCGTTGGC TCAAGCATCC ACTGGTATCA GCAAAGAACA 120AATGGTTCTC CAAGGCTTCT CATAAAGTAT GCTTCTGAGT CTATGTCTGG GATCCCTTCC 180AGGTTTAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTTACTCTTA GCATCAACAC TGTGGAGTCT 240GAAGATATTG CAGATTATTA CTGTCAACAA AGTCATAGCT GGCCATTCAC GTTCGGCTCG 300GGGACAAATT TGGAAGTAAA A321(SEQID NO15)推測的胺基酸序列DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQFVG SSIHWYQQRT NGSPRLLIKY ASESMSGIPS 60
RFSGSGSGTD FTLSINTVES EDIADYYCQQ SHSWPFTFGS GTNLEVK107(SEQ ID NO16)按類似於實施例4中相同的程序，將上述抗體的重鏈可變區插入到表達載體pL101的XbaI/NheI位點中，再將上述抗體輕鏈可變區插入到插入有重鏈可變區編碼序列的pL101的HindIII/Bsi WI位點中，構成含嵌合抗體基因的表達載體。該表達載體含有鼠源的重鏈和輕鏈可變區與人Fc構成抗體基因。
將該表達載體轉入大腸桿菌DH5α菌株，然後接種於100毫升LB培養基中進行擴增，用Qiagen公司的超純質粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit)抽提純化質粒DNA。將上述純化的質粒DNA採用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒轉染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。將CHO細胞進行連續培養和單克隆化，挑出的單克隆細胞系在RPM1641培養基上進行培養，對上清進行Western Blotting實驗，根據染色反應判斷表達強度，挑選出表達強的克隆作為候選細胞株，即得到表達強度較高的候選克隆。篩選出表達強度高的克隆。
對培養上清進行離心，去除細胞及碎片，進行蛋白A親和層析，用HPLC確定純度，確定獲得了純度大於95％的單克隆抗體。
實施例7全人源TNF單克隆抗體對於膠原誘導的類風溼關節炎B10.RIII小鼠的治療作用100.mu.g豬II型膠原(CII)加入完全弗氏佐劑，皮內注射B10.RIII小鼠，14天後再重複一次，這時小鼠體內出現膠原誘導的類風溼關節炎(CIA)症狀，28天後92％小鼠顯示嚴重的CIA症狀。對小鼠腹膜注射本發明的人源TNF單克隆抗體，觀測其在小鼠體內對CIA的症狀的影響作用。12周後進行檢測。
實驗組小鼠每周3天，每次注射64.mu.g(高劑量)，16.mu.g(中劑量)和8.mu.g(低劑量)實施例5中獲得的全人源單克隆抗體，從第1天到35天；給對照組小鼠注射PBS。按常規方法評價類風溼關節炎的嚴重程度，分值越高表示越嚴重。
結果見圖2，這表明本發明的TNF單克隆抗體與對照組相比，均能夠顯著降低類風溼的嚴重程度。因此，本發明的單抗可開發成為治療類風溼關節炎的藥物。
另外，對實施例6的人鼠嵌合單克隆抗體也進行了相同的動物模型實驗，獲得了類似的治療效果。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110馬，菁120腫瘤壞死因子抗體，其製備方法以及藥物組合物13002742416024170PatentIn version 3.1210121156212DNA213人工序列220
221misc feature222(46)..(46)223n＝a，t，c，g220
221misc feature222(1)..(56)223引物4001gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agytrndgsa gtcdgs56210221124212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(24)223引物4002tgaggagacg gtgaccrkkg tbcc24210321123212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(23)
223引物4003gamatyswgm tsacbcagtc tcc 23210421148212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(48)223引物4004gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatytccasy ykkgtccc48210521115212PRT213人工序列220
221MISC FEATURE222(1)..(15)223接頭4005Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser15 10 15210621145212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(45)223寡核苷酸4006ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg45210721140
212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(40)223引物4007gvacmmyggt caccgtctcc tcaggtggag gcggttcagg 40210821142212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(42)223引物4008ggagactgvg tsakcwsrat ktccgatccg ccaccgccag ag 422109211723212DNA213人工序列220
221misc feature222(1)..(723)223單鏈抗TNF抗體的編碼序列4009gaggtgaagc tggaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc catgaagctg60tcctgcgtgg ccaccggctt catcttctcc aaccactgga tgaactgggt gcgcgagacc120cccgagaagg gcctggagtg ggtggccgag atccgctcca agtccatcaa ctccgtgacc180cactacgccg agtccgtgaa gggccgcttc cccatctccc gcgacgactc caagtccgcc240gtgtacctgc agctgaccga cctgcgcacc gaggacaccg gcgcctacta ctgctcccgc300aactactacg gctccaccta cgactactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgtccggc360ggcggcggct ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggct ccgacatcct gctgacccag420tcccccgcca tcctgtccgt gtcccccggc gagcgcgtgt ccccctcctg ccgcgcctcc480
cagttcgtgg gctccaccat ccactggtac cagcagcgca ccaacggctc cccccgcctg 540ctgatcaagt acgtgtccga gtccatgtcc ggcatcccct cccgcttcac cggctccggc 600tccggcaccg acttcaccct gtccatcaac accgccgagt ccgaggacgt ggccgactac 660tactgccagc agtcccactc ctggcccttc accttcggct ccggcaccaa cctggaggtg 720aag72321010211241212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(241)223單鏈抗TNF抗體的胺基酸序列40010Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Thr Gly Phe Ile Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Glu Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Val Thr His Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Pro Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Leu Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ala Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105110Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile130 135 140Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Pro Ser Cys Arg Ala Ser145 150 155 160Gln Phe Val Gly Ser Thr Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly165 170 175Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile180 185 190Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser195 200 205Ile Asn Thr Ala Glu Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln210 215 220Ser His Ser Trp Pro Phe ThrPhe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val225 230235 240Lys21011211732212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(732)223單鏈抗TNF抗體的編碼序列40011atggccaacg tgcagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg cgagtccctg60aagatctcct gcaagggctc cggctactcc ttcacctcct actggatcgg ctgggtgcgc120cagatgcccg gcaagggcct ggagtggatg ggcatcatct accccggcga ctccgacacc180cgctactccc cctccttcca gggccaggtg accatctccg ccgacaagtc catctccacc240gcctacctgc agtggtcctc cctgaaggcc tccgacaccg ccatgtacta ctgcgcctcc300cacggctggg gcatggacgt gtggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccggcggc360
ggcggctccg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggctccg ccgccgtgct gacccagccc 420tcctccgtgt ccggcgcccc cggccagcgc gtgaccatct cctgcaccgg ctcctcctcc 480aacatcggcg ccggctacga cgtgcactgg taccagcagc tgcccggcac cgcccccaag 540ctgctgatct acggcaactc caaccgcccc tccggcgtgc ccgaccgctt ctccggctcc 600aagtccggca cctccgcctc cctggccatc accggcctgg ccgccgagga cgaggccgac 660tactactgcc agtcctacga ctcctccctg tccggctccg tgttcggcgg cggcaccaag 720ctgaccgtgc tg 73221012211244212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(244)223單鏈抗TNF抗體的胺基酸序列40012Met Ala Asn Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro1 5 10 15Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro50 55 60Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr65 70 75 80Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Ser His Gly Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser130135 140Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser145150 155 160Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly165 170 175Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly180 185 190Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu195 200 205Ala Ile Thr Gly Leu Ala Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln210 215 220Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys225 230 235 240Leu Thr Val Leu21013211357212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(357)223抗TNF抗體的重鏈可變區編碼序列40013gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc60tcctgtgttg cctctggatt cattttcagt aaccactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagatcaa aatctattaa ttctgcaaca180cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtgct240
gtctacctgc aaatgaccga cttaagaact gaagacactg gcgtttatta ctgttccagg 300aattactacg gtagtaccta cgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcc35721014211119212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(119)223抗TNF抗體的重鏈可變區胺基酸序列40014Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Glu lle Arg Ser Lys Ser lle Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser11521015211321212DNA213人工序列220
221misc_teature222(1)..(321)223抗TNF抗體的輕鏈可變區編碼序列40015gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt60ttctcctgca gggccagtca gttcgttggc tcaagcatcc actggtatca gcaaagaaca120aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatgtctgg gatcccttcc180aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacac tgtggagtct240gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtcatagct ggccattcac gttcggctcg300gggacaaatt tggaagtaaa a 32121016211107212PRT213人工序列220
221MISC-FEATURE222(1)..(107)223抗TNF抗體輕鏈可變區的氨醯基序列40016Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys100 1052101721131212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(31)223引物40017caggctagcg aggtgaagct ggaggagtcc g312101821133212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(33)223引物40018cagtctagag gacacggtca gggtggtgcc ctg 332101921132212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(32)223引物40019cagaagcttc cgacatcctg ctgacccagt cc322102021128212DNA213人工序列220
221misc_feature
222(1)..(28)223引物40020cagcgtacgc ttcacctcca ggttggtg 282102121133212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(33)223引物40021caggctagca tggccaacgt gcagctggtg cag332102221132212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(32)223引物40022cagtctagag ccggaggaca cggtcaccag gg 322102321130212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(30)223引物40023cagaagcttg ccgtgctgac ccagccctcc 302102421129212DNA
213人工序列220
221misc_feature222(1)..(29)223引物40024cagcgtacgc agcacggtca gcttggtgc29
權利要求
1.一種單克隆抗體VH鏈，其特徵在於，具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中1-119；SEQ ID NO12中1-118；SEQ ID NO14。
2.一種單克隆抗體VL鏈，其特徵在於，具有選自下組的CDR的胺基酸序列SEQID NO10中135-241；SEQID NO12中134-244；SEQID NO16。
3.一種單克隆抗體，其特徵在於，其VH鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO10中1-119；SEQID NO12中1-118；SEQID NO14；且其VL鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO10中135-241；SEQID NO12中134-244；SEQID NO16。
4.如權利要求3所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述抗體Fc區為人IgG的恆定區。
5.如權利要求3所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述抗體是單鏈抗體。
6.如權利要求5所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述抗體具有SEQID NO10或12所示的胺基酸序列。
7.一種DNA分子，其特徵在於，它編碼選自下組的多肽權利要求1所述的單克隆抗體VH鏈；權利要求2所述的單克隆抗體VL鏈；權利要求3所述的單克隆抗體。
8.如權利要求7所述的DNA分子，其特徵在於，它具有選自下組的DNA序列SEQ ID NO9、11、13、和15。
9.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有單克隆抗體和藥學上可接受的載體，其中所述抗體的VH鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中1-119；SEQ ID NO12中1-118；SEQ ID NO14；且其VL鏈具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO10中135-241；SEQ ID NO12中134-244；SEQ ID NO16。
10.一種權利要求3所述的單克隆抗體的用途，其特徵在於，用於製備治療類風溼關節炎的藥物。
全文摘要
本發明涉及腫瘤壞死因子抗體，其製備方法以及藥物組合物。具體地，本發明提供了嵌合的抗TNF單克隆抗體。所述的單克隆抗體具有特異性強，免疫原性低的特點，特別適用於臨床治療類風溼關節炎。本發明還提供了所述單克隆抗體的製備方法以及含有所述單克隆抗體的藥物組合物。
文檔編號C07K16/18GK1510052SQ02157659
公開日2004年7月7日 申請日期2002年12月23日 優先權日2002年12月23日
發明者馬菁, 馬 菁 申請人:馬菁, 馬 菁