(反-4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1,3,4-二唑-2-基}羰基)氨基]苯基)環己基)乙酸...的製作方法

2023-06-11 16:20:26

專利名稱：：(反-4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1,3,4-二唑-2-基}羰基)氨基]苯基)環己基)乙酸...的製作方法(反-4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1，3,4-^二唑-2-基}羰基)氨基]苯基)環己基)乙酸的晶型本發明涉及一種新的晶態化合物，且更特別地涉及下文中以式(I)表示的(反-4-{4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1,3,4-^二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的新的晶型(crystallineform),該化合物為乙醯CoA(乙醯輔酶A):二乙醯基甘油醯基轉移酶(DGAT1)活性的抑制劑。本發明還涉及用於製造該晶型、含有該晶型的藥物組合物的方法和該晶型在醫療中的用途。我們的共同未決的國際申請，PCT/GB2005/004726描述了抑制DGAT1的含有喁二唑的化合物。式(I)的化合物在該申請中作為例示(國際申請PCT/GB2005/004726;WO2006/064189的實施例541)，並在從乙酸中重結晶之後作為結晶固體而得到，下文中被稱為l型。1型的X-射線粉末衍射圖如附圖2A所示，對於1型的乙酸溶劑化物的熱力學數據如附圖2B所示。現在，我們令人驚訝並意想不到地發現式(I)的試劑可以以下文中被稱作2型和3型的其它的晶型來製備。這種多晶型物可以具有不同的溶解性和/或穩定性和/或生物利用度和/或不同的雜質分布(例如由於製造和/或分離過程引起的微量雜質)和/或易於處理、微粉化和/或易於形成片劑的晶型。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，2型，其X-射線粉末衍射圖在2-9(29)=21.4和22.7°具有峰。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，2型，其X-射線粉末衍射圖在2-0(20)=16.8、21.4和22.7°具有峰。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，2型，其X-射線粉末衍射圖在2-e(26)=4.7、9.3、16.8、21.4和22.7。具有峰。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，2型，其X-射線粉末衍射圖在2-e(20)=4.7、9.3、16.8、21.4、22.7、23.3和25.9。具有峰。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，2型，其X-射線粉末衍射圖在2-0(20)=4.7、9.3、16.2、16.8、17.7、18.1、18.6、21.4、22.7、23.3、25.9和29.2°具有峰。對於2型的X-射線粉末衍射圖如附圖l所示。l型和2型之間的比較如附圖3所示，且對於2型的熱力學數據如附圖4所示(為無水型的2型)。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，2型，具有基本上如附圖1中所示的X-射線粉末衍射圖。依照本發明，提供一種式(I)的晶型，3型，其X-射線粉末衍射圖在2-e(26)=8.4、13.8和16.7°具有峰。依照本發明，還提供一種式(I)的晶型，3型，其X-射線粉末衍射圖在2-e(29)=7.0、8.4、13.8、16.7、21.6和24.3。具有峰。依照本發明，還提供一種式(I)的晶型，3型，其X-射線粉末衍射圖在2-e(26)=4.8、5.6、7.0、8.4、13.8、16.7、19.5、20.0、21.6和24.3。具有峰。對於3型的X-射線粉末衍射圖如附圖5所示，且對於3型的熱力學數據如附圖6所示(為無水型的3型)。依照本發明，還提供一種式(I)的晶型，3型，具有基本上如附圖5中所示的X-射線粉末衍射圖。表l、2和3分別表示對於2型、l型和3型的主要峰。依照本發明得到的2型和3型，分別基本不含化合物(I)的其它晶體和非晶型。術語"基本不含其它晶體和非晶型"應理解為是指所需晶型含有少於50%，優選少於20%，更優選少於10%，更優選少於5%的化合物(I)的任何其它形式。X-射線粉末衍射圖通過將晶體材料的樣品固定在西門子(Siemens)單晶矽(SSC)晶片固定件上並藉助於顯微鏡載片將樣品鋪展開而測定。樣品以30轉/分鐘(改善計數統計)旋轉，並使用BmkerD5000粉末X-射線衍射儀(BrukerAXS,BannerLaneCoventryCV49GH)，用由銅的長-細聚焦管在40kV和40mA下^l喿作產生的波長為1.5406埃的X-射線照射。將校準的X-射線源通過設定在V20的自動變量發散狹縫，且反射射線直接通過2mm的反散射狹縫和0.2mm的探測器狹縫。暴露樣品，2-e的增量為每秒0.02度(連續掃描模式)，掃描範圍為2-e在e-e模式中2度至40度。該裝置配備有閃爍計數器作為檢測器。通過用DellOptiplex686NT4.0Workstation運行Diffrac十軟體進行控制和數據捕獲。本領域技術人員知道可獲得的X射線粉末衍射圖具有一個或多個測量誤差，取決於測量條件(如使用的設備、樣品的製備或機器)。特別地，通常已知的是在X射線粉末衍射圖中的強度可以根據測量條件和樣品製備而波動。例如，本領域技術人員將認識到峰值的相對強度可受到，例如，尺寸大於30微米和非單一長寬比的晶粒的影響，其可影響樣品的分析。本領域技術人員也將認識到反射位置可受到樣品設置於衍射計中的準確高度和衍射計零點校準的影響。樣品的表面平面性也可具有小的影響。因此，本領域技術人員應當理解此處列出的衍射圖數據不應當被看作是絕對的(更多的信息參見Jenkins,R&Snyder,R丄.'IntroductiontoX-RayPowderDiffractometry'JohnWiley&Sons,1996)。因此，應當理解的是化合物(I)的晶型不限於提供與分別在附圖1和5中所示的X-射線粉末衍射圖相同的X-射線粉末衍射圖的晶體，且任何提供與分別在附圖l和5中所示的基本相同的X-射線粉末衍射圖的晶體落入本發明的範圍之內。2型和3型還可以通過本領域熟知的其它分析方法如差示掃描量熱法(DSC)和熱重分析(TGA)依照標準方法來表徵，例如，例如在H6hne,G.W.H.等(1996),DifferentialScanningCalorimetry,Springer,Berlin中所描述的那些。可以理解的是，DSC的起始/峰值溫度和對於TGA的重量減輕值可以從一臺機器到另一機器或從一個樣品到另一樣品而略微不同，因此在熱跡圖中所提供的值不能解釋為絕對的。下面對使用的方法作更詳細的描述。差示掃描量熱法使用分析儀器MettlerDSC820e來進行。通常在4(V1的裝有穿孔蓋子的鋁盤中含有的少於5mg的材料被在25。C至325。C溫度範圍內以10。C每分鐘的恆定加熱速率加熱。使用採用氮氣的吹掃氣體-流速100ml每分鐘。熱重分析使用分析儀器MettlerTG851來進行。通常在70^1氧化鋁(aluminiumoxide)坩鍋中的3至12mg之間的材料被在25。C至325。C溫度範圍內以10。C每分鐘的恆定加熱速率加熱。使用採用氦氣的吹掃氣體-流速50ml每分鐘。2型和3型可以如附隨的實施例中所描述的來結晶。因此，在本發明的更進一步的方面提供一種用於製造式(I)的化合物的晶型2的方法，所述方法包括製備和從水和曱醇分離化合物(I),然後攪拌所得到的固體在水中的懸浮液(例如攪拌1-5天，如3天)，並分離所得到的固體(例如通過過濾，可選地用水洗滌，並乾燥)。在本發明的更進一步的方面提供一種用於製造式(I)的化合物的晶型2的方法，所述方法包括攪拌化合物(I)在水中的懸浮液。在本發明的更進一步的方面提供一種用於製造式(I)的化合物的晶型3的方法，所述方法包括在升溫下(例如，30。C至70。C，特別是在，或者大約在，50°C)攪拌化合物(I)的1型和2型在乙腈中的混合物(例如攪拌l-5天，如3天)，並分離所得到的固體(例如通過過濾，可選地用適合的溶劑洗滌，並乾燥)。依照本發明的更進一步的特徵，提供一種通過此處披露的任何方法或實施例所得到的式(I)的化合物的新的晶型。依照本發明的更進一步的方面，提供一種含有2型或3型的藥物組合物，如在上文或下文中所詳細說明的，與藥物學可接受的賦形劑或載體相結合。本發明的組合物可以是適於口服使用的形式(例如作為片劑、糖錠劑(lozenges)、硬或軟膠嚢、水性或油性懸浮液、乳劑、可分散的粉末或顆粒劑、糖漿劑或酏劑)、適合於局部使用(例如作為乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑或者水性或油性溶液或懸浮液)、適合於通過吸入給藥(例如作為細分散的粉末或液體氣霧劑)、適合於通過吹入法給藥(例如作為細分散的粉末)或適合於胃腸外給藥(例如作為用於靜脈內的、皮下的、肌內的或肌內注射量的無菌水性溶液或油性溶液或作為用於直腸劑量的栓劑)的形式。本發明的組合物可以採用本領域公知的常^L藥物賦形劑通過常規方法來獲得。因此，打算用於口服使用的組合物可包含，例如，一種或多種著色劑、甜味劑、調味劑和/或防腐劑。可用於片劑製劑的合適的藥學上可接受的賦形劑包括，例如，惰性稀釋劑如乳糖、碳酸鈉、磷酸4丐或碳酸鉀，制粒劑和崩解劑如玉米澱粉或褐藻酸；接合劑如澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石；防腐劑如對-羥基苯甲酸的乙酯或丙酯，及抗氧化劑如抗壞血酸。片劑製劑可以不包衣或包衣，以改善它們在胃腸道中的崩解以及隨後的活性成分的吸收，或者以改善它們的穩定性和/或外觀，在每種情況下，使用常規包覆劑和本領域公知的方法。用於口服使用的組合物可以為硬明膠膠嚢形式，其中將活性成分與惰性固體稀釋劑，例如，碳酸釣、磷酸4丐或高嶺土混合，或者為軟明膠膠嚢的形式，其中將活性成分與水或油如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。水性懸浮液通常含有細粉末形式的活性成分和一種或多種懸浮劑，例如羧曱基纖維素鈉、曱基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散劑或潤溼劑如卯磷脂或環氧烷烴與脂肪酸的縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如十七乙烯氧基十六醇，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯(partialester)的縮合產物，如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如十七乙烯氧基十六醇，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產物，如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物，例如聚乙烯脫水山梨醇單油酸酯。該水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑(如對-羥基苯甲酸的乙酯或丙酯)、抗氧化劑(如抗壞血酸)、著色劑、調味劑和/或甜味劑(如蔗糖、糖精或阿斯巴甜)。油性懸浮液可通過將活性成分懸浮於植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(如液體石蠟)中來配製。所述油性懸浮液還可以含有增稠劑如蜂蠟、硬質石蠟或鯨蠟醇。可以加入如上面提及的甜味劑及調味劑，以提供口感好的製劑。這些組合物可通過加入抗氧化劑如抗壞血酸來保存。適用於通過加入水來製備水性懸浮液的可分散粉末和顆粒通常含有與分散劑或潤溼劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑一起的活性成分。合適的分散劑或潤溼劑和懸浮劑可由上面已提及的那些作為例子。還可以存在另外的賦形劑，如甜味劑、調P未劑和著色劑。本發明的藥物組合物也可以是水包油的乳劑的形式。油相可以為才直物油，如裙b晚油或花生油，或礦物油，如例如液體石蠟或任4可這些油的混合物。合適的乳化劑可以是，例如，天然存在的樹膠如阿拉伯樹膠或黃蓍膠，天然存在的磷脂如大豆、卯磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脫水山梨醇單油酸酯)及所述偏酯與環氧乙烷的縮合產物，如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。所述乳劑還可以含有甜味劑、調味劑和防腐劑。糖漿和酏劑可以用甜味劑如甘油、丙二醇、山梨醇、阿斯巴甜或蔗糖來配製，並且還可含有鎮痛劑、防腐劑、調味劑和/或著色劑。該藥物組合物也可以是無菌的可注射水性或油'性懸浮液的形式，其可根據已知的方法，使用上面已提及的一種或多種合適的分散劑或潤溼劑和懸浮劑來配製。無菌的可注射製劑也可以是在非毒性的、胃腸外-可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。用於經吸入給藥的組合物可以是常規加壓的氣霧劑的形式，所述氣霧劑被設計為將活性成分分散為含有細分散的固體的氣霧劑或者小液滴。可以使用常規的氣霧劑推進劑，如揮發性的氟代烴或烴，且該氣霧劑裝置通常設計為分散計量過的量的活性成分。為獲得有關製劑的更多的信息，讀者可參考ComprehensiveMedicinalChemistry(CorwinHansch;編輯委員會主席)，Pergamon出版社1990年，第5巻,25.2章和Particlesizereductionforimprovementoforalbioavailabilityofhydrophobicdrugs:G.G.Liversidge，K.C.Cundy,InternationalJ.Pharmaceutics,125(1995),91-97(其相關部分以引用方式併入本文)。與一種或多種賦形劑相結合以生產單一劑型的活性成分的量將必須根據受治主體和具體的給藥途徑而變化。例如，旨在用於給人口服的製劑通常將含有，例如，0.5mg-2g的活性劑及與之配混的適宜和常規量的賦形劑，所述賦形劑的量可以在總組合物重量的約5%-約98%之間變化。單位劑型通常含有約lmg至約500mg的活性成分。對於有關給藥途徑和劑量規定的更多的信息，讀者可參考ComprehensiveMedicinalChemistry(CorwinHansch;編輯委員會主席)，Pergamon出8版社1990年，第5巻，第25.3章。依照本發明的另外的一個方面，提供如前文或下文中所定義的2型或3型在人或動物體的治療方法中的應用。我們已經發現本發明的化合物抑制DGAT1活性並因此注意到它們對甘油三酯的合成，和/或體重降低和/或降低血糖有影響。有關DGAT1的作用的信息包含在我們的國際申請WO2005/044250中並在那裡提及。本發明的另外一個特徵是2型或3型用作藥物。通常，這是2型或3型被用作在溫血動物如人體內用於產生DGAT1活性抑制作用的藥物。特別地，這是2型或3型被用作用於治療溫血動物如人的糖尿病和/或肥胖的藥物。因此根據本發明的另外一個方面，提供一種2型或3型在製造用於在溫血動物如人體內產生DGAT1活性抑制作用的藥物中的用途。因此根據本發明的另外一個方面，提供一種2型或3型在製造用於溫血動物如人治療糖尿病和/或肥胖的藥物中的用途。根據本發明的另外一個方面，提供一種藥物組合物，其包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的2型或3型，所述的藥物組合物用於在溫血動物如人體內產生DGAT1活性抑制作用。根據本發明的另外一個方面，提供一種藥物組合物，其包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的2型或3型，所述的藥物組合物用於治療溫血動物如人的糖尿病和/或肥胖。根據本發明的另外一個特徵，提供一種用於在需要這樣治療的溫血動物如人體內產生DGAT1活性抑制作用的方法，該方法包括對所述的動物施加有效量的如上文或下文中定義的2型或3型。根據本發明的另外一個特徵，提供一種用於在需要這樣治療的溫血動物如人的糖尿病和/或肥胖的方法，該方法包括對所述的動物施加有效量的如上文或下文中定義的2型或3型。如上所述，用於治療或預防性治療具體的病情所需的藥量大小將根據受治主體、給藥途徑和待治療疾病的嚴重性進行必要的變化。優選地，採用l-50mg/kg範圍內的日劑量。但是所述的日劑量將根據受治主體、具體的給藥途徑和待治療疾病的嚴重性進行必要的變化。因此可以由治療任何具體患者的醫師決定最佳劑量。如上所述，在本發明中定義的化合物令人感興趣的是它們抑制DGAT1活性的能力。本發明的化合物可因此適用於預防、延緩或治療一系列的疾病包括糖尿病，更具體地是2型糖尿病(T2DM)和由此引起的併發症(例如視網膜病，神經病變和腎病)，糖耐量降低(IGT)，空腹血糖受損狀態，代謝性酸中毒，酮症，代謝紊亂綜合症，關節炎，骨質疏鬆症，肥胖和與肥胖有關的紊亂，(其包括外周血管疾病(包括間歇性跛行)，心力衰竭和某些心臟病，心肌缺血，腦缺血和再灌注，高脂血症，動脈硬化症，不育症和多嚢性卯巢綜合症)；本發明的化合物也可以有利於治療肌肉萎縮，皮膚病如痤瘡，阿爾茨海默(Alzheimer)病，多種免疫疾病(如牛皮癬)，HIV感染，炎症性腸病綜合症和炎症性腸疾病如克羅恩氏病(Crohn'sdisease)和潰瘍性結腸炎。特別地，本發明的化合物用於預防、延緩或治療糖尿病和/或肥胖和/或與肥胖有關的紊亂是很令人感興趣的。在一個方面，本發明的化合物用於預防、延緩或治療糖尿病。在另一個方面，本發明的化合物用於預防、延緩或治療肥胖。在另一個方面，本發明的化合物用於預防、延緩或治療與肥胖有關的紊亂。這裡描迷的DGAT1活性抑制作用可以用作單獨治療或者和一種或多種其它物質相結合和/或用於待治療適應症的治療。這樣的聯合治療可以通過治療的個體組分的同時、連續或分別用藥來完成。同時治療可以是以單獨的片劑或者以分開的片劑。例如這樣的聯合治療在代謝綜合症[定義為腹部肥胖症(如針對人種和性別特異性分割點的腰圍來測量)加上以下任何兩種高甘油三脂血症(>150mg/dl;1.7mmol/l);低HDLc(對於男性<40mg/dl或〈l,03mmol/l;對於女性〈50mg/dl或1.29mmo1/1)或對於低HDL(高密度脂蛋白)的治療；高血壓(SBP^130mmHgDBP^85mmHg)或用於高血壓的治療；和高血糖症(空腹血糖^100mg/dl或5.6mmol/l或糖耐量降低或先天性糖尿病)國際糖尿病聯合會(InternationalDiabetesFederation)&輸入自IAS/NCEP]的治療中是很有用的。這樣的聯合治療可以包括下述主要種類1)抗肥胖症治療，例如通過影響食物攝入、營養吸收或能量消耗來引起體重減輕的那些，如奧利司他、西布曲明等等。2)胰島素促分泌素，包括磺脲(例如格列本脲、格列吡。秦)，膳食葡萄糖調節劑(例如瑞格列奈、那格列奈)；3)改善腸促胰島素作用的試劑(例如二肽基肽酶IV抑制劑，和GLP-1激動劑)；4)胰島素敏感性試劑，包括PPARy激動劑(例如匹格列酮和羅格列酮)，以及PPARa和y活性相組合的試劑；5)調節肝葡萄糖平衡的試劑(例如甲福明二曱雙胍、1，6-二磷酸果糖酶抑制劑、糖原磷酸基酶抑制劑、糖原合成酶激酶抑制劑、葡萄糖激酶激活劑)；6)設計用來減少從腸道對葡萄糖吸收的試劑(例如阿卡波糖)；7)防止通過腎的葡萄糖再吸收的試劑(SGLT抑制劑)；8)設計用來治療慢性高血糖症併發症的試劑(例如醛糖還原酶抑制劑)；9)抗血脂異常劑如，HMG-CoA還原酶抑制劑(例如斯他汀類)；PPARa受體激動劑(貝特類藥物，例如吉非貝齊)；膽汁酸螯合劑(消膽胺)；膽固醇吸收抑制劑(植物甾烷醇，合成抑制劑)；膽汁酸吸收抑制劑(IBATi)和煙酸以及類似物(尼亞新和緩釋製劑)；10)抗高血壓劑如，p-阻滯劑(例如阿替洛爾、普萘洛爾)；ACE抑制劑(例如賴諾普利)；鈣拮抗劑(例如硝苯地平)；血管緊縮素受體拮抗劑(例如坎地沙坦)；a拮抗劑和利尿劑(例如利尿磺胺，千噻。秦)；11)止血調節劑如，抗血栓藥，纖維蛋白溶解促進劑和抗血小板劑；凝血酶拮抗劑；Xa因子抑制劑；Vila因子抑制劑)；抗血小板劑(例如阿司匹林、氯吡格雷)；抗凝血劑(肝磷脂及低分子量類似物，水蛭素)和華法林；12)抑制胰高血糖素作用的試劑；和13)抗炎劑，如非類固醇抗炎藥(例如阿司匹林)和類固醇抗炎劑(例如可的松)。本發明的化合物晶型的效用可以通過下面來驗證。人類酶4全測鑑別DGAT1抑制劑的體外檢測使用在昆蟲細胞膜中表達的人類DGAT1作為酶源(Proc.Natl.Acad.Sci.1998,95，13018-13023)。簡單而言，sf9細胞用包含人類DGAT1編碼序列的重組杆狀病毒進行感ii染，並在48h後採集。細胞通過超聲降解法溶解並通過4。C下在41%蔗糖梯度上以28000rpm離心分離1小時來分離細胞膜。收集、清洗細胞間期的細胞膜組分並在液氮中儲存。DGAT1活性通過修正的由科爾曼(Coleman)所描述的方法(MethodsinEnzymology1992,209,98-102)進行測定。將1-10的化合物用0.4pg膜蛋白質、5mMMgCl2，和100pM1,2二油醯-sn-甘油在總檢測體積200pi的塑料管中進行培養。所述反應通過加入14C油醯合酶A(最終濃度30pM)而開始進行並在室溫下培養30分鐘。所述反應通過加入1.5mL的2-丙醇庚烷水(80:20:2)終止。通過加入lmL庚烷和0.5mLpH9.5的0.1M碳酸酯緩沖液，將》文射性三油精產物分離到有機相中。用液體閃爍照相法通過上層庚烷層的計數等分試樣量來量化DGAT1活性。在該測試中式(I)化合物具有2.5nM的IC,式(I)的化合物和相應的藥學上可接受的酸式鹽抑制DGAT1的能力可進一步的採用下面的全細胞檢測1)和2)來驗證1)在3T3細胞中的甘油三酯合成的測定將小鼠脂肪細胞3T3細胞在6孔板中的包含培養基的新生牛血清中培養匯合。通過在包含10%胎牛血清、1ng/mL胰島素、0.25nM地塞米松和0.5mM異丁基曱基黃。票呤的培養基中培養來誘導細胞的分化。48h後所述細胞在含有10%胎牛血清和1pg/mL胰島素的培養基中被另外保持4-6天。對該試驗而言，所述培養基更換成不含血清的培養基，且細胞用溶解在DMSO的化合物(最終濃度0.1%)預培養30分鐘。新生脂肪通過加入0.25mM醋酸鈉加上1|aCi/mL"C-醋酸鈉到每個孔中並保持另外2小時來測定(J.Biol.Chem.,1976，251，6462-6464)。所述細胞在磷酸鹽緩沖鹽水中清洗並溶解於1%十二烷基硫酸鈉中。等分試樣使用基於Lowry方法(J.Biol.Chem.,1951,193,265-275)的蛋白質估測試劑盒(Perbio)進行分離來用於蛋白質的測量。所述脂類才艮據科爾曼(Coleman)方法(MethodsinEnzymology,1992，209,98-104)使用庚烷丙-2-醇水(80:20:2)混合物隨後由水和庚烷的等分試樣萃取到有機相。收集有機相且溶劑在氮氣流下蒸發。根據SilversandandHaux(1997)的方法，萃取物被溶解在異己烷乙酸(99:1)中，脂質通過正相高效液相色譜(HPLC)分離，使用Lichrospherdiol-5,4x250mm柱和異己烷乙酸(99:1)以及異己烷丙-2-醇乙酸(85:15:l)的梯度溶劑體系，流速1mL/分鐘。使用與HPLC設備相連的RadiomaticFlo-one檢測器(Packard)分析甘油三酯部分中放射性同位素標記的摻入情況。2)在MCF7細胞中的甘油三酯合成的測量將人類乳腺上皮(MCF7)細胞在包含培養基的胎牛血清的6孔板中培養融合。對該試驗而言，所述培養基更換成不含血清的培養基，且細胞用溶解在DMSO的化合物(最終濃度0.1%)預培養30分鐘。新生脂肪通過加入50(iM醋酸鈉加上3(iCi/mL"C-醋酸鈉到每個孔中並保持另外3小時來測定(J.Biol.Chem.，1976,251,6462-6464)。所述細胞在磷酸鹽緩沖鹽水中清洗並溶解於1%十二烷基硫酸鈉中。等分試樣使用基於Lowry方法(J.Biol.Chem.,1951,193,265-275)的蛋白質估測試劑盒(Perbio)進行分離來用於蛋白質的測量。所述脂類根據科爾曼(Col函n)方法(MethodsinEnzymology，1992,209,98-104)使用庚烷丙-2-醇水(80:20:2)混合物隨後由水和庚烷的等分試樣萃取到有機相。收集有機相且溶劑在氮氣流下蒸發。根據SilversandandHaux的方法(J.Chromat.B,1997,703，7-14)，萃取物被溶解在異己烷乙酸(99:l)中，脂質通過正相高效液相色譜(HPLC)分離，使用Lichrospherdiol-5，4x250mm柱和異己烷乙酸(99:1)以及異己烷丙-2-醇乙酸(85:15:1)的梯度溶劑體系，流速1mL/分鐘。使用與HPLC設備相連的RadiomaticFlo-one檢測器(Packard)分析甘油三酯部分中放射性同位素標記的摻入情況。本發明現在將通過下面的實施例進行說明。實施例現將通過下述實施例示例說明本發明，除非另有說明，其中(i)溫度以攝氏度(。C)給出；操作在室溫或環境溫度下，即在18-25。C溫度範圍內和惰性氣體如氬氣氛下進行；(ii)有機溶液以無水硫酸鎂乾燥；使用旋轉蒸發儀在減壓(600-4000Pa;4.5-30mmHg)和不超過6CTC的浴溫下進行溶劑蒸發；(iii)色傳表示在矽膠上的快速色鐠；其中Biotage筒(Biotagecartridge)表示含有KP-SIL二氧化矽(60A,顆粒尺寸32-63mM)的筒，由Biotage(DyaxCo卬.的分部，1500AvonStreetExtended,Charlottesville,VA22902,USA)提供；(iv)通常，反應過程由TLC跟蹤，給出的反應時間只是示例性的；(v)收率的給出僅為示例說明，並不必然是可通過努力的工藝開發而實現的那些；如果需要更多物質，可重複製備；(vi)除非另有規定，所給出的NMR數據OH)為主要特徵質子的A值形式，以相對於四曱基矽烷(TMS)的百萬分之份數(ppm)給出，使用全氖化二曱亞碸(DMSO-d6)作為溶劑在300MHz或400MHz(除非另有說明)下測定；峰多重性如此顯示s,單峰；d，雙重峰；dd,雙重雙重峰；dt,雙重三重峰；dm，雙重多重峰；t，三重峰；q，四重峰；m,多重峰；br,寬峰；(vii)化學符號具有其通常的含義；使用國際(SI)單位和符號；(viii)溶劑比例以體積體積(v/v)術語症合出；(ix)質譜(MS)(loop)記錄在配備有HP1100檢測器的MicromassPlatformLC上；除非另有說明，所引用的質量離子為(MH+);(x)LCMS(液相色譜-質譜法)記錄在包括配備有Waters996光電二極體陣列檢測器的Waters2790LC和MicromassZMDMS的系統上，使用PhenomenexGemini5uC18110A50x2mm柱，以及流速為1.1ml/min的5%(水/乙腈(1:1)+1%曱酸)洗脫，且在開始4分鐘內乙腈從0-95%梯度增加，餘量(95-0%)為水，除非另有說明，HPLC保留時間在該系統中以分鐘報告；除非另有說明，所引用的質量離子為(MH+);(xi)當描述相分離筒時，那麼使用ISOLUTE相分離70ml柱，由ArgonautTechnologies(NewRoad,Hengoed,MidGlamorgan,CF828AU,UnitedKingdom)提供；(xii)當提及SiliCycle筒時，其表示含有超純矽膠(粒徑230-400目,孔徑40-63um)的筒，由SiliCycleChemicalDivision(1200AveSt-Jean-Baptiste,Suite114,QuebecCity,Quebec,G2E5E8,CANADA)提供；(xiii)當提及IscoCompanion時，則使用Combiflash公司色謙4義，由ISOCInc.(地址TeledyneISOCInc,4700SuperiorStreet,Lincoln,NE68504，USA)提供；14(xiv)當^是及孩i波時，其表示BiotageInitiatorsixty或SmithCreator微波,由Biotage(DyaxCorp.的分部，1500AvonStreetExtended,Charlottesville,VA22902，USA)提供；(xv)當提及GCMS時，則氣相色譜-質譜分析法在QP-2010GC-MS系統上完成，該體系安裝有AOC20i自動取樣器和通過"GCMSsolutions"軟體(2.0版，由Shimadzu提供，MiltonKeynes，MK125RE，UK)進行控制；該GC柱是DB-5MS,長25m,0.32mm內徑，帶有厚度為0.52的膜，由J&WScientific,Folsom,CA，美國提供；(xvi)當提及離心分離機時，是指GenevacEZ-2plus，由Genevac有限公司提供(TheSoveriegnCentre,FarthingRoad,Ipswich,IPl5AP,UK);(xvii)這裡涉及的手性色譜法是指通常使用20pmMerck50mmChiralpakAD柱(手性固定相由ChimlTechnologiesEurope,Pared，In麟ation,Bd.Gonthierd，Andernach,67404IllkirchCedex,法國提供)來完成，使用MeCN/2-丙醇/AcOH(90/10/0.l)作為洗脫液，流動速率80mL/min，波長300nm,使用Gilson製備性HPLC設備(200mlheads);(xviii)熔點使用Buchi530儀器進行測定並且未加較正；(xix)當提及當量(equiv)時，它們意欲指的是摩爾當量。(xx)下面的縮寫可能在下面用到或在上文或下文的製備方法部分用到Et20或醚二乙基醚DMF二甲基甲醯胺DCM二氯曱烷DME1,2-二曱氧基乙烷MeOH甲醇EtOH乙醇H20水TFA三氟乙酸THF四氬p夫喃DMSO二曱亞石風HOBtl-羥基苯並三唑EDCI(EDAC)1-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二-醯亞胺氫氯化物DIPEA二異丙基乙胺DEAD二乙基偶氮雙羧基酯EtOAc乙酸乙酯NaHC03小蘇打/碳酸氫鈉K3P04磷酸鉀PS聚合物承載的BINAP2,2，-雙(二苯基膦基)-1,1，聯萘Dppfl,l，-雙(二苯基膦基)二茂鐵dba聯亞爺基丙酮PS-CDI聚合物承載的羰基雙咪唑CH3CN或MeCN乙腈h小時min分鐘HATU0-(7-氮雜苯並三唑-l-基)-N,N,N，,N，-四曱基脲己氧基氟磷酸酯NaOH氫氧化鈉AcOH乙酸DMA二曱基乙醯胺nBuLi正丁基鋰MgS04硫酸鎂Na2S04硫酸鈉CDC13三氯化氘CD3OD全氖化曱醇Boc叔-丁氧基羰基實施1:2型(反-4"4-「({5，「(3,4-二氟苯基)氨基-1,3,4-哺二唑-2-基1羰基}氨基)苯基l環己基！乙酸formulaseeoriginaldocumentpage16往攪拌的(反-4-{4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1,3,4-嚅二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸曱酯(中間體1;1當量)的曱醇(9.38L/摩爾中間體1)懸浮液中加入一水合氬氧化鋰(10當量)水溶液(2.23L/摩爾中間體1)。該反應混合液在30。C下攪拌2小時然後冷卻至0°C並用濃鹽酸酸化至pH2(保持溫度低於l(TC)。將得到的白色沉澱物過濾，用水和甲醇洗滌，然後在50。C真空下乾燥以給出作為固體的標題化合物(82%產率)。該固體然後通過攪拌懸浮在水(大約28ml/g化合物)中，然後該懸浮液被攪拌3天。然後固體被過濾掉並用淡水洗滌(緩慢過濾)。將得到的白色固體在高真空乾燥箱中50。C下乾燥至恆重並進行分析(參見附圖1、3&4)。中間體1:(反-4-{4-「({5-「(3,4-二氟苯基)氨基1-1,3，4-喝二唑-2-基}羰基)氨基l苯基l環己基)乙酸曱酯3,4-二氟異硫氰酸酯(1.2當量)被加至攪拌的[反-4-(4-{[肼基(氧代基)乙醯基]氨基}苯基)環己基]乙酸甲酯(中間體2，1當量)的DMA(大約5.3升每摩爾中間體2)的懸浮液中，並將混合物加熱至45。C並攪拌2小時。加入EDAC(1.2當量)並將得到的混合物加熱至85°C並攪拌3小時。加入水(大約4.3升每摩爾中間體2)。將沉澱物過濾掉並用水洗滌，然後在真空下乾燥以給出作為黃色固體的標題化合物。中間體2:「反-4-(4-{「肼基(氧代基)乙醯基1氨基}苯基)環己基1乙酸曱酯將膦醯乙酸三曱基酯(170mL,1.05mol)滴加至冷卻至12。C的攪拌的氫化鈉(在礦物油中60%，27.5g,1.14mol)的THF(3.5L)懸浮液i)2-K-(4-羥基苯基)亞環己基i乙酸曱酉;中。加完之後，反應混合物被允許加熱至環境溫度並攪拌1小時。在單獨的容器中，N,N-四曱基胍(144mL,1.14mol)被加至4-(4-羥基苯基)環己-l-酉同(235g,0.95mol)的THF(1.2L)懸浮液中，且將反應混合物在環境溫度下攪拌1小時。將膦醯乙酸酯混合物冷卻至l(TC並將胍溶液緩慢加入，控制溫度在8至12。C之間直到沒有殘餘放熱被觀察到。溫度被允許升至環境溫度並將反應混合物攪拌16小時。混合物被在氯化銨的稀的水溶液(2.4L)和乙酸乙酯(2.4L)之間分配。將水相分離並用乙酸乙酯(1.2L)萃取。將有機相合併並用鹽水(2.4L)洗滌、乾燥(MgS04)並在真空中濃縮從而剩下灰白色固體。該固體在醚和己烷混合物(2:1;470mL)中製漿，過濾並用醚和異己烷的混合物(2:1;240mL)洗滌從而給出為白色固體的產物(285g,94%)。&NMR51.35-1.55(2H,m)，1.85-2.05(4H，m),2.25-2.40(2H，m)，2.65-2.75(1H,m)，3.60(3H,s)，3.80(1H,m),6.66(2H,d),6.99(2H,d)，9.10(1H,s)ii)反-2-「4-(4-羥基苯基)環己基l乙酸甲酯formulaseeoriginaldocumentpage18將10%碳載把(50%水溼，6.9mmol)加至幹THF(400mL)中的2-[4-(4-羥基苯基)亞環己基]乙酸甲酯(100g,0.41mol)。反應混合物在氫氣氛下(2bar)加熱至30°C。混合物經C鹽過濾餘下固體，該固體用THF(50mL)洗滌。該THF溶液在真空中濃縮至餘下剩餘物，剩餘物用乙酸乙酯洗滌。將粗混合物溶於熱的乙酸乙酯(IOOmL)並然後冷卻至環境溫度。用冰水冷卻之後，過濾沉澱物並用乙酸乙酯(50mL)洗滌以給出為固體的標題化合物(42g,42%)。&NMR51.02-1.17(2H,m),1.31-1.46(2H,m),1.66-1.82(5H,m),2.23(2H,d)，2.28-2,38(1H，m)3.63(3H,s)，6.66(2H,d)，6.99(2H，d)，9.10(1H，s)。反-2-「4-(4-氨基苯基)環己基l乙酸曱酯formulaseeoriginaldocumentpage18反_2-[4-(4-羥基苯基)環己基]乙酸曱酯(2.82g，11.4mmol)和二異丙基乙胺(2.32mL，13.3mmol)的DCM(40mL)溶液被冷卻至4。C並將三氟曱烷磺醯氯(1.42mL，13.3mmol)經30分鐘加入，保持溫度在低於6。C。反應混合物在4。C下攪拌45分鐘並然後升溫至15°C。停止攪拌並將反應混合物放置16小時。將反應混合物倒入冰水(18mL)，分層並將水層用DCM(7mL)萃取。合併的有機相用2N氫氧化鈉水溶液(2mL)洗滌，並且然後用鹽水(9mL)洗滌，乾燥(MgS04)並在真空中濃縮從而剩下為黃色固體的中間體三氟曱基磺酸鹽(4.59g,106%)，對其使用時沒有進一步提純。將中間體三氟曱基磺酸鹽(12g,32mmol)加至THF(200mL)中的碳酸銫(14.4g，44mmol)、醋酸把(0.43g,1.9mmol)、BINAP(1.2g,1.9mmol)和二苯曱酮亞胺(7.9mL,47mmol)的混合物中。開始攪拌並將容器抽空且用氮氣吹掃5次。將攪拌的混合物加熱至回流16小時。反應混合物冷卻至環境溫度並在真空中濃縮至餘下剩餘物。剩餘物在醚(360mL)和水(210mL)之間分配並被分層。水層用醚(3x360mL)萃取並將合併的有機層乾燥(MgS04)並在真空中濃縮從而剩下粗黃色油，其使用時沒有進一步提純。將該粗亞胺(21g,51mmol)溶於甲醇(300mL)並將溶液冷卻至4°C。緩慢加入1M鹽酸溶液(100mL)，保持溫度低於7。C。懸浮液經16小時升溫至環境溫度。將甲醇在真空中去除並將得到的混合物用水(100mL)稀釋。將該水性混合物用醚(2x30mL)洗滌並將合併的有機層用1M的鹽酸溶液(2x30mL)洗滌。將合併的水層用10%碳酸鈉水溶液鹼化至pH為9從而引起沉澱。加入乙酸乙酯(3x200mL)並分層。將合併的有機層乾燥(MgS04)並在真空中濃縮直到沉澱形成。將混合物冷卻，過濾並用己烷(20mL)洗滌從而給出為淺黃色固體的產物。將濾出液在真空中濃縮以給出附加產物，將其合併，在真空中濃縮並通過柱色譜純化，使用10-50%的EtOAc和異己烷梯度作為洗脫液從而給出為黃色固體的產物(5.1g，經過2步的總產率為65。/。)。^NMR(CDC13)50.98-1.06(2H,m),1.33-1.42(2H，m)，1.72-1.81(5H,m),2.16-2.18(2H,m)，2.28-2.34(1H,m),3.61(3H，s),6.68(2H，d)，6.96(2H，d)。iv)({4-「反-4-(2-甲氧基-2-氣代乙基)環己基1苯基1氨基)(氧代V乙酸甲19酯在(TC將氯代(氧代)乙酸曱酯(0.84211^)加至攪拌著的反-2-[4-(4-氨基苯基)環己基]乙酸曱酯(1740mg)和吡啶(0.689mL)的DCM(50mL)溶液中。添加完成之後混合物被允許升溫至環境溫度並攪拌64小時。將溶液用DCM(100mL)稀釋，用水(50mL)和鹽水(50mL)洗滌，然後乾燥並在真空中濃縮以給出為固體的標題化合物(2267mg);]HNMR57.60(2H,d)，7.18(2H，d),3.83(3H,s)，3.58(3H,s)，2.58-35(1H+DMS0，m)，2.21(2H,d),1.75(5H，m)，1.43(2H，m)，1.12(2H,m);MSm/e(M-H)-332。將iv)水合肼(0.361mL)加至攪拌著的((4-[反-4-(2-甲氧基-2-氧乙基)環己基]苯基}氨基)(氧代)乙酸甲酯(2260mg)的EtOH(50mL)溶液中。將該混合物攪拌1小時。沉澱物;故濾除，用Et20洗滌，並在真空下整夜乾燥從而給出為固體的標題化合物(中間體2，1845mg);}H濯R510.44(1H,s)，10.20(1H,s)，7.70(2H，d)，7.21(2H，d)，4.60(2H,s),3.60(3H，s),2.42(1H,m)，1.79(5H,m),1.45(2H,m)，1.11(2H，m);MSm/eMH+334。實施例2:3型(反-4-{4-「({5-「(3,4-二氟苯基)氨基1-1,3,4-，二唑-2-基}羰基)氨基1苯基！環己基)乙酸將2型(如實施例1中製備；大約20mg)放入含有磁力攪拌子的小瓶中。少量的1型被加入作為種子並加入乙腈(大約lml)。將瓶用蓋子密封，並在50。C置於熱板攪拌器上3天，始終進行攪拌。3天後，將瓶從攪拌器移走，去掉蓋子並使任何殘存的溶劑揮發。將得到的3型固體進行分析(參見附圖5&6和表3)。1型原料如下來製備...將2-[4-[4-[[5-[(3，4-二氟苯基)氨基]l,3,4-嚅二唑-2-羰基]氨基]-苯基]環己基]乙酸曱酯(參見實施例1;1當量)在氮氣下通過攪拌懸浮在曱醇/四氫呋喃(14vol/7vol)中，並加入氫氧化鋰(10eq)的水(5vol)溶液。將所形成的黃色溶液加熱至30°C(2小時後通過(lc/ms)來完成)。20該混合物然後被冷卻至0。C並用濃鹽酸酸化至pH為2，保持溫度低於l(TC。將形成的白色沉澱物濾除並用水和甲醇洗滌。將所得到的產物在50。C高真空下乾燥以給出白色固體。將該固體在水(50vol)中製漿並在環境溫度下攪拌24小時，然後加熱至60°C2個小時並使其整夜冷卻。將固體濾除並真空乾燥從而給出產物(存在0.57w/wTHF)。表l:2型的X-射線衍射圖tableseeoriginaldocumentpage21表2:1型的X-射線衍射圖tableseeoriginaldocumentpage22表3:3型的X-射線衍射圖tableseeoriginaldocumentpage22權利要求1.一種(反-4-{4-[({5-[(3，4-二氟苯基)氨基]-1，3，4-噁二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，其X-射線粉末衍射圖在2-θ(2θ)＝16.8、21.4和22.7°具有峰。2.—種如權利要求1所述的(反-4-{4-[({5-[(3，4-二氟苯基)氨基]-1，3,4-哺二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，其X-射線粉末衍射圖在2-6(29)=4.7、9.3、16.8、21.4和22.7°具有峰。3.—種如權利要求1或2所述的(反-4-{4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1，3,4-嗜二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，具有基本上如圖1所示的X-射線粉末衍射圖。4.一種(反-4-{4-[({5-[(3，4-二氟苯基)氨基]-1，3,4-喁二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，其x-射線粉末衍射圖在2-e(2e)=8.4、13.8和16.7。具有峰。5.一種如權利要求4所述的(反-4-{4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1,3,4-嗝二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，其X-射線粉末衍射圖在2-0(26)=7.0、8.4、13.8、16.7、21.6和24.3。具有峰。6.—種如權利要求4或5所述的(反-4-{4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1，3,4-嗝二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，其》射線粉末衍射圖在2-6(26)=4.8、5.6、7.0、8.4、13.8、16.7、19.5、20.0、21.6和24.3。具有峰。7.一種如權利要求4、5或6所述的(反-4-{4-[({5-[(3,4-二氟苯基)氨基]-1，3，4-喁二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的晶型，具有基本上如圖5所示的X-射線粉末衍射圖。8.—種藥物製劑，包含如權利要求1-7中任一權利要求所定義的化合物，所述化合物與藥學可接受的佐劑、稀釋劑或載體相混合。9.如權利要求1-7中任一權利要求所述的化合物，用作藥物。10.如權利要求1-7中任一權利要求所定義的化合物的用途，用於製造用來治療要求或期望抑制DGAT1的症狀的藥物。11.一種治療要求或期望抑制DGAT1的症狀的方法，該方法包括給需要這種治療的患者給予治療有效量的如權利要求1-7中任一權利要求所述的化合物。全文摘要提供化合物(反-4-{4-[({5-[(3，4-二氟苯基)氨基]-1，3，4-二唑-2-基}羰基)氨基]苯基}環己基)乙酸的新的晶型，以及用於製造該晶型、含有它們的藥物組合物的方法和該晶型在醫療中的用途。文檔編號C07D271/113GK101466690SQ200780021729公開日2009年6月24日申請日期2007年6月8日優先權日2006年6月12日發明者A·H·多布森,W·格倫迪申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司