殼聚糖－免疫rna複合物製劑及其製備方法

2023-06-11 21:21:36

專利名稱：殼聚糖－免疫rna複合物製劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種醫學製劑，更具體地說它是一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，本發明還同時公布了這種複合物製劑的製備方法；這種殼聚糖-免疫RNA製劑可應用於病毒性疾病和惡性腫瘤等領域的治療。
背景技術：
免疫核糖核酸(Immune RNA，免疫RNA)是一類超越種屬界限傳遞免疫功能的活性物質，能夠將供者所具有的特異性免疫應答能力傳遞給受體的機體或淋巴細胞。大量的研究表明，如果用一種抗原給動物免疫，使其產生對該抗原的免疫反應(包括體液免疫和細胞免疫)，再從致敏動物的淋巴器官(淋巴結和睥髒)和淋巴細胞分離RNA(RNA)，此種RNA能將供體動物對特異抗原的免疫反應能力傳遞給從未接觸過該抗原的受體動物，使其能產生對該抗原的特異體液和細胞免疫反應(參見鄭昌學.從實驗、臨床和理論角度看免疫RNA[J].中國生化藥物，1999，20(5)267-269)，因此稱這科RNA為免疫RNA。可以看出，免疫RNA是一類來自免疫器官並能傳遞免疫功能的RNA。免疫RNA的免疫學作用機理尚未完全闡明(參見馮來坤，閆肅，劉景會，等.從理論角度看免疫RNA的療效.中國生化藥物，1999，18(2)106-107)，大多數實驗結果都支持免疫RNA中起作用的是mRNA，它可能是抗體的直接模板或某些激活免疫反應因子的直接模板。
免疫RNA作為一種免疫治療劑，臨床應用已有二十多年，但由於免疫RNA進入人體後極易受人體內RNase降解而失去活性，因此其免疫活性及臨床療效仍有爭議(參見鄭昌學.關於當前免疫RNA生產、質量控制和應用方面的一些問題.中國生化藥物，1997，18(6)320-321)。如抗B肝免疫RNA作為一種免疫治療劑，對慢性肝炎的治療作用倍受重視，但臨床應用效果不穩定。我們認為目前臨床應用的免疫RNA是提取致敏動物的淋巴組織(脾、淋巴結)RNA的凍乾粉，實為裸露的RNA，直接皮下(有些甚至是肌肉注射)注射進入人體後，被組織內的RNase迅速水解至免疫活性降低，導致臨床療效不穩定。因此為提高免疫RNA的進入體內後的免疫活性，成功的傳遞免疫信息，構建一個能有效保護免疫RNA並能被組織更好吸收的免疫RNA運載體系是十分很必要的。
殼聚糖(chitosan)，又稱為可溶性甲殼素，或甲殼胺、幾丁聚糖、殼多糖等，學名為β-1，4-聚-D-氨基葡萄糖，分子式(C6H11NO4)n，商品名Flonac，由蟹、蝦等水產加工廢棄物提取精製甲殼素(chitin)後經過脫乙醯基而製取，含β-(1，4)-2-乙醯氨基-D-葡糖單元和β-(1，4)-2-氨基-D-葡糖單元的聚合物，後者一般不超過65％。根據不同的製備方法可得不同脫乙醯程度和平均分子量的殼聚糖。殼聚糖生產原料來源豐富，具有許多獨特的化學物理性質，根據其醯化、硫酸酯化和氧化、接枝與交聯、羥乙基化、羥甲基化等反應還可製備成多種用途的產品。
殼聚糖分子在酸性條件下帶正電荷，核酸分子在鹼性條件下帶負電荷，殼聚糖能與核酸分子在醋酸或鹽水溶液中形成表面帶正電荷的微粒(參見Ishii T，Okahata Y，Sato T.Mechanism of cell transfectionwith plasmid/chitosan complexes.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)/Biomembranes 2001，1514(1)51-64)，核酸被包裹在納米粒中不易被核酸酶降解，穩定性顯著提高(參見Richardson SCW，KolbeHVJ，Duncan R.Potential of low molecular mass chitosan as a DNAdelivery systembioconpatibility，body distribution and ability tocomplex and protect DNA.International Journal of Pharmaceutics 1999，178(2)231-243)。殼聚糖-核酸納米複合物在釋放包裹的核酸過程中還可充當一個控釋製劑，殼聚糖-核酸納米聚合物作為核酸的載體有良好的前景，但殼聚糖作為RNA的載體目前尚未見報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有免疫RNA製劑的缺陷，而提供一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，本發明的另一個目的是提供一種製備上述殼聚糖-免疫RNA複合物製劑的方法。該製劑一方面能保護免疫RNA免受降解，同時還可以增強免疫RNA的活性，提高療效。
本發明的目的是通過如下措施來達到的一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，它主要包含殼聚糖與免疫RNA所形成的複合物，所述複合物為納米級或微米級顆粒。
在上述技術方案中，所述的複合物微粒直徑在100納米～100微米之間。
在上述技術方案中，所述的免疫RNA為抗B型肝炎免疫RNA。
在上述技術方案中，所述的免疫RNA為抗腫瘤免疫RNA。
製備上述殼聚糖-免疫RNA複合物製劑的方法，它至少包括以下步驟a.將殼聚糖溶於1％醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，氫氧化鈉調PH到5.5，無菌過濾；b.將免疫RNA溶於5％至20％的硫酸鈉溶液中，免疫RNA濃度為10-20μg/ml；c.將免疫RNA溶液逐滴加入到等體積0.5％殼聚糖溶液中，同時以500轉/分鐘的速度攪拌，待全部免疫RNA全部滴加完後，攪拌1小時，按體積比為1％加入濃度12.5％的戊二醛，然後繼續攪拌1小時；d.將混和溶液12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物；e.加入雙蒸水洗滌殼聚糖-免疫RNA複合物，12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物，重複3次；f.真空冷凍乾燥得到殼聚糖-免疫RNA複合物的凍乾粉劑。
本發明是將殼聚糖作為載體，製備殼聚糖-免疫RNA的一種新型製劑。
殼聚糖是由葡萄糖胺單體及N-乙醯基葡萄糖胺單體按不同比例聚合形成的多糖，由於葡萄糖胺單體上有游離的氨基，故帶有正電荷，其pKa值為6.5。當PH在6以下時，殼聚糖溶解，其一級氨基會質子化。帶有正電荷的殼聚糖和帶有負電荷的免疫RNA通過靜電作用會形成殼聚糖-免疫RNA微粒。所形成的殼聚糖-免疫RNA微粒直徑一般在100納米～100微米之間。殼聚糖和免疫RNA結合後可以保護免疫RNA免受酶的降解，增加免疫RNA的穩定性，提高免疫RNA的生物學活性和臨床療效。另外，殼聚糖是一種天然的生物材料，無毒性，無副作用，為綠色環保型核酸載體，使用者易於接受。同時殼聚糖本身具有一定的免疫增強作用，可同時提高病人的非特異性免疫功能。本發明製備工藝簡單，設備要求不高，反應時間短，條件溫和，易於操作。而且材料易得，成本低廉。


圖1為本發明殼聚糖-RNA複合物RNA酶降解保護實驗結果圖。
具體實施例方式
下面結合附圖詳細分析本發明殼聚糖-RNA複合物RNA酶降解保護實驗的結果參閱圖1可知RNA與殼聚糖形成複合物後，殼聚糖-免疫RNA複合物被阻滯在加樣孔中沒有被降解。圖1中A是沒有保護的免疫RNA，B是RNA+RNase作用15min，可以看到RNA基本都被降解了；C、D是殼聚糖-免疫RNA複合物+不同濃度的RNase作用15min，E、F是C、D孔中1/2濃度的殼聚糖-免疫RNA複合物+不同濃度的RNase作用15min，可以看出由於殼聚糖與RNA形成了複合物，殼聚糖對RNA起阻滯作用，RNA全部被阻滯在加樣孔中，並得到保護，未被RNase的降解，四孔對比，F孔中Rnase的濃度最大，殼聚糖-RNA複合物中的RNA部分被降解。
實施例1殼聚糖-B型肝炎免疫RNA複合物製劑的製備及效果分析1、殼聚糖-B型肝炎免疫RNA新型製劑的製備(1)將殼聚糖溶於1％醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，攪拌24小時，加入1％的氨水，使溶解的殼聚糖沉澱，過濾，真空冷凍乾燥沉澱，將乾燥後所得殼聚糖再溶於1％醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，用氫氧化鈉調PH到5.5，無菌過濾；(2)將0.5mg免疫RNA溶於50ml的5％的硫酸鈉溶液中，將免疫RNA溶液逐滴加入到等體積0.5％殼聚糖溶液中，同時以500轉/分鐘的速度攪拌，待全部免疫RNA全部滴加完後，攪拌1小時，加入1ml濃度12.5％的戊二醛，然後繼續攪拌1小時，將混和溶液12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物；(3)加入雙蒸水洗滌殼聚糖-免疫RNA複合物，12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物，重複3次；(4)真空冷凍乾燥得到殼聚糖-免疫RNA的凍乾粉劑-支。
2.殼聚糖-RNA複合物RNA酶降解保護實驗實驗步驟如下(1)按上述殼聚糖-B型肝炎免疫RNA新型製劑的製備方法製備殼聚糖-RNA複合物，取一支凍乾粉劑溶於0.5ml ddH2O。
(2)按下列操作準備A、B、C、D、E、F六個樣品A是沒有保護的免疫RNA，B是RNA+RNase作用15min，可以看到RNA基本都被降解了；C、D是殼聚糖-免疫RNA複合物+不同濃度的RNase作用15min，E、F是C、D孔中1/2濃度的殼聚糖-免疫RNA複合物+不同濃度的RNase作用15min；然後進行瓊脂糖凝膠電泳。
3、小鼠試驗取健康小白鼠20隻，體重28～34g，雌性，將製備的殼聚糖-免疫RNA的凍乾粉劑四支溶於10ml的雙蒸水中，於小鼠的腋下或腹股溝皮下注射，每隻注射0.5ml，每周1次，共7次，30天後重複注射2次。同時還設立生理鹽水組(注射生理鹽水0.5ml)、殼聚糖組(注射0.1％殼聚糖0.5ml)、免疫RNA組(注射免疫RNA溶液0.5ml，含免疫RNA0.1mg)作為對照，每組20隻小白鼠，注射部位和時間相同。末次注射10天後分別進行小鼠的B型肝炎表面抗體HbsAb測定、體內白細胞粘附抑制(LAI)試驗、體外白細胞粘附抑制試驗和脾細胞識別HBsAg ELISA試驗。
(1)B型肝炎表面抗體HbsAb測定從小鼠尾部採血0.5ml，待血液凝固後分離血清，測定小鼠體內的B型肝炎表面抗體HbsAb水平，採用B型肝炎表面抗體HbsAb試劑盒測定HbsAb，具體方法按使用說明書進行。
(2)白細胞粘附抑制(LAI)試驗脫頸椎處死小鼠，放入75％的酒精中浸泡5min，製備脾細胞懸液的，具體方法如下取出後右側臥位，消毒左側背腹交界處皮膚，用剪刀無菌取出小鼠脾臟，在不含血清的RPMI-1640不完全培養液中洗去血跡，剪去脂肪和筋膜，置於墊有200目尼龍網的無菌小平皿中；用無菌的玻璃注射器內芯壓碎脾臟，加入1640液衝洗過濾，收集網下的細胞懸液入無菌離心管中，用不含血清的RPMI-1640不完全培養液洗滌2次並重新懸浮；分離單個核細胞上述已製備好的脾細胞懸液緩慢置於已配好的淋巴細胞分離液(比重1.080)上，2000r/min離心20min，吸取第二層雲霧狀的低密度細胞，再用不含血清的RPMI-1640不完全培養液1000r/min洗滌2次；調節細胞濃度至5×106個/ml。
取96孔板，分別設立試驗孔和對照孔(各孔設5個平行孔)，按下述加樣實驗孔加入小鼠脾細胞懸液100μl、B肝表面抗原50μl、10％小牛血清RPMI-1640液50μl；對照孔加入小鼠脾細胞懸液100μl、10％小牛血清RPMI-1640液100μl。5％CO2、37℃培養2h，輕輕棄去上清，向各孔內加入180μl不含小牛血清的RPMI-1640不完全培養液和20μlMTT溶液，再培養4h，棄上清，每孔再加入200μlDMSO，振蕩均勻，室溫放置15min，酶標儀測在波長490nm的光密度值(A值)。按下述公式計算粘附抑制指數(LAI值) (3)脾細胞特異結合HBsAg ELISA試驗取96孔板，按下述加樣小鼠脾細胞懸液50μl、B肝表面抗原50μl、10％小牛血清RPMI-1640液100μl，5％CO2、37℃培養2h，離心微孔板(1000g、15min)，輕輕棄去上清，加入含10％小牛血清的RPMI-1640液50μl；同時設陽性對照孔(陽性血清50μl)和陰性對照孔(陰性血清50μl)，均設5個平行孔；各孔內加入辣根過氧化物酶標記的抗體50μl，輕拍混勻；37℃孵育25min，室溫平衡5min；用洗滌液洗滌後，離心後棄上清，重複5次，洗滌完後扣幹(每次保持30～60s浸泡時間)；向各孔內加入底物緩衝液和底物各50μl，輕拍混勻，37℃暗置15min；每孔加入終止液50μl，混勻；雙波長450/630nm條件下測定各孔的OD值(A值)，樣品OD值/(2.1×陰性對照孔OD值)≥1者為陽性。
4、殼聚糖-B型肝炎免疫RNA新型製劑的效果分析免疫RNA複合物RNA酶降解保護試驗結果表明(參見圖1)RNA與殼聚糖形成複合物後，殼聚糖-免疫RNA複合物被阻滯在加樣孔中沒有被降解。如圖1所示A是提取的RNA空白對照，B是RNA+RNase作用15min，可以看到RNA基本都被降解了；C、D、E、F由於殼聚糖與RNA形成了複合物，殼聚糖對RNA起阻滯作用，RNA全部被阻滯在加樣孔中，並得到保護，未被RNase的降解，四孔對比，F孔中Rnase的濃度最大，殼聚糖-RNA複合物中的RNA部分被降解。
B型肝炎表面抗體HbsAb測定結果表明使用殼聚糖-免疫RNA複合物的小鼠的抗Hbs抗體陽性率(參見表1)、白細胞粘附抑制指數(參見表2)及脾細胞識別HBsAg的陽性率(參見表3)均顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組和免疫RNA組。
表1為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組小鼠的抗HBs抗體(HBsAb)產生情況，由表1可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠的抗HBs抗體(HBsAb)陽性率顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表1、四組小鼠的抗體產生情況

*與免疫RNA組比較，P＜0.01.
表2為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組小鼠的白細胞粘附抑制試驗結果，由表2可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠的白細胞粘附抑制指數顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表2、小鼠的白細胞粘附抑制指數比較

*與免疫RNA組比較P＜0.01。
表3為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組小鼠脾細胞特異結合HBsAg情況，由表3可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠脾細胞特異結合HBsAg的陽性率顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表3、小鼠脾細胞特異結合HBsAg的ELISA檢測結果

*與免疫RNA組比較P＜0.01。
實施例2殼聚糖-腫瘤免疫RNA新型製劑的製備及效果分析
1、殼聚糖-腫瘤免疫RNA新型製劑的製備(1)將殼聚糖溶於1％醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，攪拌24小時，加入1％的氨水，使溶解的殼聚糖沉澱，過濾，真空冷凍乾燥沉澱，將乾燥後所得殼聚糖再溶於1％醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，用氫氧化鈉調PH到5.5，無菌過濾；(2)將0.5mg免疫RNA溶於50ml的5％的硫酸鈉溶液中，將免疫RNA溶液逐滴加入到0.5％殼聚糖溶液中，同時以500轉/分鐘的速度攪拌，待全部免疫RNA全部滴加完後，攪拌1小時，再加入12.5％的戊二醛1ml，然後繼續攪拌1小時，將混和溶液12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物；(3)加入雙蒸水洗滌殼聚糖-免疫RNA複合物，12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物，重複3次；(4)真空冷凍乾燥得到殼聚糖-免疫RNA的凍乾粉劑。
2.小鼠試驗取健康小白鼠40隻，體重28～34g，雌性，將製備的殼聚糖-免疫RNA的凍乾粉劑八支溶於20ml的雙蒸水中，於小鼠的腋下或腹股溝皮下注射，每隻注射0.5ml，每周1次，共7次，30天後重複注射2次。同時還設立生理鹽水組(注射生理鹽水0.5ml)、殼聚糖組(注射0.02％殼聚糖0.5ml)、免疫RNA組(注射免疫RNA溶液0.5ml，含免疫RNA0.5mg)作為對照，每組40隻小白鼠，注射部位和時間相同。末次注射10天後每組取20隻分別進行小鼠的抗腫瘤抗體、體內白細胞粘附抑制(LAI)試驗、細胞毒性T細胞活性試驗。另20隻每隻腹股溝皮下接種0.1ml H22腫瘤細胞(1×105個)，待實體瘤出現後進行存活率測定試驗。
(1)抗腫瘤抗體從小鼠尾部採血0.5ml，待血液凝固後分離血清，測定小鼠體內的抗腫瘤抗體，具體方法用鹽析沉澱法分離H22細胞抗原，包被至於96孔板上，每孔加入小鼠血清50μl，並設置陰性對照。37℃孵育30分鐘，棄去孔中液體，洗滌5次，加入辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育半小時，棄去孔內液體，洗滌5次，每孔加入底物緩衝液50μl，再加入底物50μl，輕拍混勻，37℃反應15分鐘。在雙波長450nm/630nm條件下讀取各孔OD值。樣品OD值≥(0.12+陰性對照平均OD值)為抗體陽性。
(2)白細胞粘附抑制(LAI)試驗
脫頸椎處死小鼠，放入75％的酒精中浸泡5min，製備脾細胞懸液，具體方法如下取出後右側臥位，消毒左側背腹交界處皮膚，用剪刀無菌取出小鼠脾臟，在不含血清的RPMI-1640不完全培養液中洗去血跡，剪去脂肪和筋膜，置於墊有200目尼龍網的無菌小平皿中；用無菌的玻璃注射器內芯壓碎脾臟，加入1640液衝洗過濾，收集網下的細胞懸液入無菌離心管中，用不含血清的RPMI-1640不完全培養液洗滌2次並重新懸浮；分離單個核細胞上述已製備好的脾細胞懸液緩慢置於已配好的淋巴細胞分離液(比重1.080)上，2000r/min離心20min，吸取第二層雲霧狀的低密度細胞，再用不含血清的RPMI-1640不完全培養液1000r/min洗滌2次；調節細胞濃度至5×106個/ml。
取96孔板，分別設立試驗孔和對照孔(各孔設5個平行孔)，按下述加樣實驗孔加入小鼠脾細胞懸液100μl、腫瘤細胞抗原50μl、10％小牛血清RPMI-1640液50μl；對照孔加入小鼠脾細胞懸液100μl、10％小牛血清RPMI-1640液100l。5％CO2、37℃培養2h，輕輕棄去上清，向各孔內加入180μl不含小牛血清的RPMI-1640不完全培養液和20μlMTT溶液，再培養4h，棄上清，每孔再加入200μlDMSO，振蕩均勻，室溫放置15min，酶標儀測在波長490nm的光密度值(A值)。按下述公式計算粘附抑制指數(LAI值) (3)細胞毒性T細胞(CTL)活性試驗將上述分離的小鼠單個核細胞經尼龍棉柱吸附法進一步純化，分離出T細胞。於96孔板中加入50μl完全培養液配製的2×106個/ml CTL懸液；加50μl 2×106H22細胞於檢測孔，加40μl完全培養液和10μl 1％Triton X-100於酶總釋放對照孔，空白對照孔加入50μl完全培養液；置37℃培養4h；4℃，1100r/min離心5min，吸取50μl培養上清夜轉入試管中，加入950μl新鮮配製的BLT底物(20mmol/L N-α苯氧羥基-L-賴氨酸硫代苯甲酯)，37℃水浴20min。然後將試管立即置冰浴，並立即加入0.1mol/L的PMSF(苯甲基磺醯氟)10μl，補加1.0ml PBS使終濃度達0.05mol/L，於412nm波長下測各孔OD值，並按下式計算顆粒酯酶分泌百分率。
顆粒酯酶分泌百分率(％)＝100×(E-B)×(T-B)
式中E為靶細胞誘導的CTL細胞上清液平均光吸收值，B表示背景或未處理的CTL細胞孔平均吸光值；T表示酶總釋放量(即用Triton X-100處理的CTL細胞上清)。
(4)存活率試驗四組小鼠如前所述注射殼聚糖-免疫RNA後，每組取20隻腹股溝皮下接種0.1ml H22腫瘤細胞(1×105個)，測定每組的30天存活率。
3、殼聚糖-腫瘤免疫RNA新型製劑的效果分析實驗結果表明使用殼聚糖-免疫RNA複合物的小鼠的抗Hbs抗體陽性率(參見表4)、白細胞粘附抑制指數(參見表5)及細胞毒性T細胞活性(參見表6)均顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組和免疫RNA組。使用殼聚糖-免疫RNA複合物的小鼠接種H22腫瘤細胞後的30天存活率亦顯著高於其餘三組對照組(參見表7)表4為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組小鼠的抗腫瘤抗體產生情況，由表4可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠的抗腫瘤抗體陽性率顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表4、四組小鼠的抗體產生情況

*與免疫RNA組比較，P＜0.01.
表5為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組小鼠的白細胞粘附抑制試驗結果，由表5可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠的白細胞粘附抑制指數顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表5、小鼠的白細胞粘附抑制指數比較


*與免疫RNA組比較P＜0.05。
表6為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組CTL活性，由表6可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠CTL的活性顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表6、CTL活性檢測結果

*與免疫RNA組比較P＜0.05。
表7為經殼聚糖-免疫RNA聚合物處理組及對照組小鼠接種H22腫瘤細胞後30天存活率。由表7可見殼聚糖-免疫RNA複合物組小鼠的存活率顯著高於生理鹽水組、殼聚糖組及免疫RNA組。表明殼聚糖-免疫RNA複合物能有效的保護免疫RNA免受降解，並能顯著增強免疫RNA的活性。
表7小鼠30天存活率比較

*與免疫RNA組比較P＜0.05。
需要說明的是對於所屬領域的技術人員來說，在不改變本發明原理的前提下還可以對本發明做出若干的改變或變形，這同樣屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，其特徵是它主要包含殼聚糖與免疫RNA所形成的複合物，所述複合物為納米級或微米級顆粒。
2.根據權利要求1所述的一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，其特徵在於所述的複合物微粒直徑在100納米～100微米之間。
3.根據權利要求1或2所述的一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，其特徵在於所述的免疫RNA為抗B型肝炎免疫RNA。
4.根據權利要求1或2所述的一種殼聚糖-免疫RNA複合物製劑，其特徵在於所述的免疫RNA為抗腫瘤免疫RNA。
5.製備上述任一權利要求書所述殼聚糖-免疫RNA複合物製劑的方法，其特徵在於它至少包括以下步驟a.將殼聚糖溶於1％至5％的醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，氫氧化鈉調PH到5.5，無菌過濾；b.將免疫RNA溶於5％至20％的硫酸鈉溶液中，免疫RNA濃度為10-20μg/ml；c.將免疫RNA溶液逐滴加入到0.5％殼聚糖溶液中，同時以500轉/分鐘的速度攪拌，待全部免疫RNA全部滴加完後，攪拌1小時，按體積比為1％加入濃度12.5％的戊二醛，然後繼續攪拌1小時；d.將混和溶液12000rpm離心10分鐘以收集殼聚糖-免疫RNA複合物；e.用雙蒸水洗滌殼聚糖-免疫RNA複合物，離心收集殼聚糖-免疫RNA複合物，重複3次f.冷凍真空乾燥得到殼聚糖-免疫RNA的凍乾粉劑。
全文摘要
一種殼聚糖－免疫RNA複合物製劑，它主要包含殼聚糖與免疫RNA所形成的複合物，所述複合物為納米級或微米級顆粒。本發明針對現有免疫RNA在體內容易被降解的缺點，利用殼聚糖製備一種較穩定的免疫RNA新製劑，這種殼聚糖－免疫RNA複合物製劑能有效保護免疫RNA免受快速降解，延長其作用時間，並能促進免疫RNA進入淋巴細胞，從而使免疫RNA更好的發揮作用，增強免疫RNA的活性，提高療效。本發明還同時公開了製備這種殼聚糖－免疫RNA複合物製劑的方法。
文檔編號A61K31/7088GK1799630SQ20051001966
公開日2006年7月12日 申請日期2005年10月26日 優先權日2005年10月26日
發明者徐順清, 李媛媛, 張紅菱, 李曉波, 陳玉雙 申請人:武漢共同科技有限公司