乳酸菌混菌發酵結合酶解法生產蛋白飼料源小肽工藝的製作方法

2023-06-12 00:55:26

專利名稱：乳酸菌混菌發酵結合酶解法生產蛋白飼料源小肽工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體說就是一種乳酸菌混菌發酵結合酶解 法生產蛋白飼料源小肽工藝。(二) 背景技術100多年前，人們已經注意到了肽的吸收和轉運(mathews，1987)。 近十多年來，肽在奶牛體內的作用己引起科學界的高度重視，大量研 究結果表明，蛋白質攝入後，並不完全水解成胺基酸，而是大部分以 肽的形式吸收，同時發現，小肽被吸收的速度比同組成的胺基酸要快， 且無飽和，無競爭性抑制。不僅如此，特定的小肽具有調節植物神經 系統、活化細胞機能、提高泌乳能力和改善牛奶成分等生理活性。這 些發現為開發奶牛飼料源小肽產品提供了理論依據。小肽是指含2個 或者3個胺基酸殘基的一類化合物。根據所發揮的功能把小肽分為兩 大類，即營養性小肽和功能性小肽。營養性小肽是指不具有特殊生理 調節功能，只為蛋白質合成提供氮架的小肽；功能性小肽是指參與調 節動物的某些生理活動或具有某些特殊作用的小肽，如免疫肽、抗菌 肽、抗氧化肽、表皮生長因子等。在國外，發達國家在小肽的研究、生產與應用方面已經取得了許 多成果。國外對各類肽製品開發與應用方面的研究日益活躍，研究範 圍日益廣泛，其中包括水解蛋白肽類產品開發的有酪蛋白肽、大豆肽、 小麥肽、玉米肽、血蛋白肽、水產蛋白肽、海洋生物肽、膠原肽等。 美國與日本在20世紀80年代相繼研究出大豆多功能肽，並已成功地將 大豆多功能肽用於伺料行業。目前，大豆多功能肽產品已在美國、日 本等發達國家飼料行業中得到廣泛開發和應用。國內方面，我國科研人員也對小肽的生產和特性進行了研究。為 了彌補我國在小肽研製和生產方面與國外的差距，"大豆低聚肽的開 發與應用"等酶解肽項目被列入國家"九五"重點科技攻關項目，2002 年被列入國家級重點新產品開發計劃，並取得了良好的成果。隨著實驗手段的現代化，奶牛對肽的營養由純生理研究向營養研 究發展取得了重大發展，生物活性肽的發現開創了動物營養的新紀元，但是在奶牛飼料對肽研究製備領域尚存在空白。
發明內容本發明的目的在於提供一種利用微生物發酵和酶解複合技術，採 用常用蛋白詞料的乳酸菌混菌發酵結合酶解法生產蛋白飼料源小肽 工藝。本發明的目的是這樣實現的乳酸菌混菌發酵結合酶解法生產 蛋白飼料源小肽，工藝流程如下(1) 原料預處理 .步驟一選擇新鮮優質的豆粕、玉米蛋白粉、麥麩，使用粉碎機 粉碎後過40目的篩子，稱量後按比例進行混勻，混合比例按美國NRC 營養標準中賴氨酸、蛋氨酸理論含量值並根據奶牛賴氨酸和蛋氨酸營 養需要比例(100.00: 48.70)確定豆粕玉米蛋白粉麩皮=15: 4: 1;步驟二稱取一定量混合物，按5%蛋白質濃度與50° C去離子水混合，攪拌均勻，應用飽和Ca(OH)2調節pH為7.7,經封裝置於55°C 空氣浴振蕩器中，頻率100r/min，萃取反應60min;步驟三浸提後溶液經12rC高溫溼熱滅菌15min，殺滅病原菌， 鈍化脂肪氧化酶和脲酶等成分；(2) 乳酸菌發酵將菌種解凍復活，在種子培養基上接種，培 養14h達對數生長期後接種至增殖培養基，接菌量5%:其中乳酸乳 球菌3%、保加利亞乳桿菌2%，培養時間8h;當滅菌後蛋白浸提液 溫度降至4(TC進行接菌，接菌量10%，溫度37.5匸，溼度70%，恆 溫發酵36h;(3) 熱處理髮酵後混合液經9(TC、 10min的熱處理，殺滅微生 物發酵菌群，並使蛋白質適度變性；(4) 酶解加酶水解經熱處理後的發酵液通過測定發酵液中蛋白質的含量 配製成5%蛋白質濃度溶液，用4mol/L的NaOH調節pH值8.5，置 於恆溫水浴中，溫度40°C，胰蛋白酶的用量按蛋白底物濃度比0.6%， 胰酶1.5%，酶解4.5h，小肽得率65%,水解度29.1%。酶解過程中 pH值應保持在6.5 7.0的範圍內，出現異常時，用HCL及Ca(OH) 2進行調解；酶失活處理將酶水解液加熱到80 85°C，恆溫保持55min，使酶失活；
(5)產品的乾燥採用DZF-6030B型真空乾燥箱在55。C進行 真空濃縮至濃度30%~40%;後經FD-1B-55型真空冷凍乾燥機乾燥， 獲得小肽產品。
應用豆粕和玉米蛋白粉均已能工業化生產小肽，但是利用他們生 產的小肽功能均不理想，豆粕缺乏含硫胺基酸(主要是蛋氨酸)，玉 米蛋白粉缺乏賴氨酸和色氨酸，溶解性不好。本發明採用具備蛋白酶 活力的乳酸乳球菌、保加利亞乳桿菌混菌發酵結合酶解法生產蛋白飼 料源小肽，原料配比時根據美國NRC蛋白營養標準(2002)將豆粕 和玉米蛋白粉進行配比，充分考慮賴氨酸、蛋氨酸比例，為了有效提 高乳酸菌的代謝活力，添加一定比例的麩皮，通過微生物發酵作用使 蛋白質轉化增殖顯著提高賴氨酸、蛋氨酸含量及改善二者比例；將發 酵的蛋白飼料經複合酶解，控制水解度，使獲得的小肽分子質量主要 集中在300 800Da。利用微生物發酵和酶解複合技術採用常用蛋白詞 料製得的小肽無苦味和異味，口感好，生產成本大大降低，小肽得率 佔蛋白質含量65%，蛋氨酸2.51%，提高1.67%，賴氨酸5.17%，提 高1.76。X，優於國內外類似產品，為其他蛋白飼料資源生產飼用小肽 提供了有效的資料和數據。
(四)


圖1為本發明的20pg/ml的標準衍生液HPLC結果；
圖2為本發明的賴氨酸標準曲線；
圖3為本發明的10pig/ml的標準衍生液HPLC結果；
圖4為本發明的lml飼料源蛋白小肽產品水解樣HPLC結果；
圖5為本發明的蛋氨酸標準曲線；
圖6為本發明的蛋氨酸含量變化曲線
圖7為本發明的賴氨酸標準曲線圖8為本發明的賴氨酸含量變化曲線；
圖9為本發明的不同蛋白酶酶解效果圖10為本發明的標準出峰曲線；
圖11為本發明的水解液凝膠G-15洗脫圖譜。
具體實施方式
下面結合附圖舉例對本發明作進一步說明。
實施例1:結合圖1-圖11，本發明一種乳酸菌混菌發酵結合酶 解法生產蛋白飼料源小肽工藝，工藝流程如下
(1) 原料預處理
步驟一選擇新鮮優質的豆粕、玉米蛋白粉、麥麩，使用粉碎機 粉碎後過40目的篩子，稱量後按比例進行混勻，混合比例按美國NRC 營養標準中賴氨酸、蛋氨酸理論含量值並根據奶牛賴氨酸和蛋氨酸營 養需要比例(100.00: 48.70)確定豆粕玉米蛋白粉麩皮二15: 4: 1;
步驟二稱取一定量混合物按5%蛋白質濃度與50° C去離子水 混合，攪拌均勻，應用飽和Ca(OH)2調節pH為7.7,經封裝置於55。C 空氣浴振蕩器中，頻率100r/min，萃取反應60min;
步驟三浸提後溶液經12rC高溫溼熱滅菌15min，殺滅病原菌, 鈍化脂肪氧化酶和脲酶等成分；
(2) 乳酸菌發酵將菌種解凍復活，在種子培養基上接種，培 養14h達對數生長期後接種至增殖培養基，接菌量5%:其中乳酸乳 球菌3%、保加利亞乳桿菌2%，培養時間8h;當滅菌後蛋白浸提液 溫度降至4(TC進行接菌，接菌量10%，溫度37.5。C，溼度70%，恆 溫發酵36h;
(3) 熱處理髮酵後混合液經9(TC、 10min的熱處理,殺滅微生
物發酵菌群，並使蛋白質適度變性；
(4) 酶解
加酶水解經熱處理後的發酵液通過測定發酵液中蛋白質的含量 配製成5%蛋白質濃度溶液，用4mol/L的NaOH調節pH值8.5，置 於恆溫水浴中，溫度40°C，胰蛋白酶的用量按蛋白底物濃度比0.6%, 胰酶1.5%,酶解4.5h，小肽得率65%,水解度29.1%。酶解過程中 pH值應保持在6.5 7.0的範圍內，出現異常時，用HCL及Ca(OH) 2進行調解；酶失活處理將酶水解液加熱到80 85°C，恆溫保持 5min，使酶失活；
(5) 產品的乾燥採用DZF-6030B型真空乾燥箱在55。C進行真 空濃縮至濃度30%~40%;後經FD-lB-55型真空冷凍乾燥機乾燥，獲
7得小肽產品。
實施例2:結合圖l一圖ll，本發明一種乳酸菌混菌發酵結合酶解
法生產蛋白飼料源小肽工藝，所用原料為胰酶(Amersco)、胰蛋白 酶(Amersco)，豆粕、玉米蛋白粉、麩皮，乳酸乳球菌(實驗室保藏 具備蛋白酶活力)、保加利亞乳桿菌(實驗室保藏具備蛋白酶活力)。
土首養基
種子培養基乳酸乳球菌M17球菌半選擇培養基；保加利亞乳杆
菌使用MRS培養基。
增殖培養基100g大麥芽根浸提液、蛋白腖10g、蔗糖10g、葡
萄糖10g、 pH7.0的磷酸鹽緩衝液400ml，加蒸餾水至1L，調節pH值為 6.8 7.0。 113。C滅菌30min。
主要試劑L-賴氨酸標準品(Amersco，色譜純)，其他試劑均為 國產分析純；0.8mol/LNa2CO3-NaHCO3緩衝液(pH9.0);含cp=25 ^甲醇的0.01mol/LNaAC緩衝液(pH5.2):稱取2.50g無水乙酸鈉， 用水溶解後定容1000 mL，冰乙酸調節pH至5.20。取0.01mol/LpH5.2 NaAC緩衝液750mL與250mL色譜純甲醇混合，經0.45mm微孔濾 膜真空超濾，並超聲波脫氣；30mg/mLCDNB溶液(2， 4一二硝基氯 苯溶液)稱取2， 4一二硝基氯苯3.0g,用甲醇溶解定容100mL，臨 用新配。其他試劑均為國產分析純試劑。
指標測定方法水分的測定GB/T 14769 ;粗蛋白含量測定 GB/T 5009.5-85;可溶性氮(NSI)含量測定GB 5511 — 1985附錄A; 酸溶性蛋白含量(TCA-NSI)測定QB/T2653-2004;水解度(DH) 測定按《植物蛋白功能原理與工藝》中茚三酮比色法測定；蛋白酶 活力測定按QB/T 1803-1993中福林一酚試劑法測定；乳酸菌酶活 力測定SB/T 10317-1999;蛋氨酸含量測定按《糧油食品品質分 析》中亞硝基鐵氰化鈉法測定；賴氨酸含量測定方法為自行設計，詳 見以下步驟
(1)樣品液的準備
本實驗稱取含蛋白質10~20mg的試樣(約50 100mg，準確至 O.lmg)按照GB/T 18246-2000中酸水解法進行水解。水解後，冷去口，混勻，開管，過濾，用蒸餾水反覆衝洗試管和濾紙，定容至50mL。 用移液管吸取10mL濾液，置真空乾燥箱中，6(TC，抽真空，蒸發至 幹後加少量三蒸水重複蒸發至幹1 2次，最後用lmL三蒸水溶解， 供進一步的胺基酸衍生用。
(2) 胺基酸標準樣品的衍生
根據lmol賴氨酸與lmolCDNB在鹼性條件下生成lmol DNP-LYS的衍生反應原理，確定衍生劑的理論用量(lmg賴氨酸需 要1.39mgCDNB)。為了保證衍生化反應完全，應適當加入過量的衍 生劑，經試驗CDNB理論值的5倍量衍生化效果較好。
根據上述理論，準確吸取6份賴氨酸標準液各lmL，分別置於6 個10mL具塞離心管中，再分別吸取pH9.0 Na2COrNaHC03緩衝液 2mL，混勻後，按照CDNB理論值的5倍量分別加入，用微型漩渦 混合儀混勻，置85。C恆溫水浴鍋中，避光暗反應1.5h，取出，冷卻 至室溫，應用lmol/L鹽酸調解pH值至7.0，用三蒸水稀釋至50ml 容量瓶中定容，混勻，配置成了相當於含賴氨酸分別為80昭/mL， 60|ig/mL, 40嗎/mL， 20嗎/mL， 10jig/mL， 2jig/mL的標準衍生液。
(3) 胺基酸水解液的衍生
吸取樣品液lmL，分別置於50mL具塞離心管中，再分別吸取 pH9.0 Na2COrNaHC03緩衝液2mL，混勻後，加入CDNB溶液各 0.4mL，混勻，'其他步驟同2.3
(4) 色譜條件
C18不鏽鋼分離柱YMC (5(im4.6Xl50mm);流動相，含(p二 25X甲醇的0.01mol/LpH5.2NaAC緩衝液；檢測波長，350nm;柱溫， 24°C;流速，0.8mL/min;外標法定量；實驗用水均系本實驗室SZ-93 自動雙重純水蒸餾器製備。
衍生化後的試劑經0.22(im微孔濾膜過濾後在本實驗色譜條件下 直接上樣，體積10^1，進行含量測定。3結果
(5)胺基酸標準樣品衍生後峰形的鑑別用標準2,4-二硝基酚(DNP-OH)、 DNP-Lysine與樣品水解液作 比較疊加，它們分別為峰1、峰2、峰3，在衍生過程中通過不加賴 氨酸、CDNB或是不經過衍生直接上樣，均有峰l，是雜質峰，是溶 液中的，最終確定峰2、峰3是水解過程中產生的，峰2為CDNB在 鹼性條件下形成的DNP-OH，峰3為經CDNB衍生生成的DNP—賴 氨酸，為目的峰，出峰時間為14.685min，峰4經過多次實驗，確定 是衍生化過程中產生的，査閱文獻為2， 4一二硝基羥乙基苯(DEB) (黛華，1993)
(6) 賴氨酸衍生後標準曲線的建立
以進樣濃度(pg/mL)對所得峰面積(pv.s)作直線回歸，獲得 回歸方程Y=1817.4X+2679.7，見圖2。在進樣量為2|ig/mL 80(ig/mL 的範圍內，經重複進樣，線性係數均在0.9999,在此範圍內進樣濃度 與峰面積程良好的線性關，各物質得到較好的分離見圖3，最低撿出 限為2ng/mL。
(7) 樣品衍生圖譜分析
稱取0.1000g飼料源蛋白小肽產品根據2.2、 2.3試驗方法進行水 解、衍生化處理，過濾後上樣。測定結果見圖4，在14.886min出現 目的峰，與標準品出峰時間一致，根據HPLC峰面積計算，測得飼料 源蛋白小肽產品含賴氨酸5.17%，與其他報導及正常豆粕(3.13%) 相比，賴氨酸含量較高。
(8)方法評價
採用柱前衍生反相高效液相色譜法分析賴氨酸是一種靈敏、快速 的方法。本文採用CDNB作為柱前衍生生化試劑，CDNB (生化試劑) 價格便宜，理化性質穩定；衍生化過程簡便，反應易於控制，胺基酸 的取樣量少，過量的CDNB對測定無幹擾，衍生化製得的DNP-Lys 性質穩定，線性關係良好。樣品水解、衍生後經HPLC， C18柱分離， UV350nm檢測，用含cp=25%甲醇的0.01mol/L pH5.2 NaAc緩衝液 為流動相，賴氨酸與其他胺基酸分離效果較好，可以準確測定伺料中 賴氨酸的含量，為小肽產品及其他詞料中賴氨酸含量的測定提供了一種有效的方法。
平均肽鏈長度估算
小肽的平均鏈長即肽鏈的平均胺基酸殘基數。根據李培駿(2006)
研究總結，小肽的平均鏈長"l/DHX100y。，水解度控制是發酵和酶水 解過程的關鍵，本試驗預製備含3 8個胺基酸殘基的小肽水解物， 即水解度控制在10. 0% 34. 0%。 小肽分子質量分布測定
驗採用凝膠柱層析法對小肽水解液的分子質量分布範圍進行測
定。柱S印hadex G-15 (1. OcmX 80. Ocm)，流速1. 3mL/min， 0. lmol/L pH7.0 Tris-HCl洗脫液，溫度18°C (YOl型層析試驗冷櫃)，檢測 波長280nm下測定，經CDMC色譜工作站分析。取桿菌肽(Mw^445Da)、 氧化型穀胱甘肽(Mw=612. 66Da)、還原型穀胱甘肽(Mw=307. 22Da)、 酪氨酸(Mw=181.2Da)、(溶菌酶(Mw=14400Da)、牛血清白蛋白 (Mw=68000Da)各50mg，分別溶於5ml三蒸水中，製成標準溶液。
將己處理好的S印hadex G-15裝柱，用洗脫液洗脫至基線平穩， 加入標準溶液3ml，並記錄最大吸收峰出現時間(min)，並繪製出 峰時間與標準蛋白分子質量對數(lgM)的標準曲線。 製備蛋白飼料源小肽的工藝
l.原料預處理
(1) 原料的選擇與粉碎
選擇新鮮優質的豆粕、玉米蛋白粉、麥麩，使用粉碎機粉碎後過 40目的篩子，稱量後按比例進行混勻，混合比例按美國NRC營養標 準中賴氨酸、蛋氨酸理論含量值並根據奶牛賴氨酸和蛋氨酸營養需要
比例(100.00: 48.70)確定豆粕玉米蛋白粉麩皮=15: 4: 1。
(2) 浸提
稱取一定量混合物按5%蛋白質濃度與去離子水(50°C)混合， 攪拌均勻，應用飽和Ca(OH)2調節pH為7.7，經封裝置於55'C空氣浴 振蕩器中，頻率100r/min，萃取反應60min。
(3) 滅菌
浸提後溶液經12rC高溫溼熱滅菌15min，殺滅病原菌,鈍化脂肪 氧化酶和脲酶等成分。
ii2. 乳酸菌發酵
將菌種解凍復活，在種子培養基上接種，培養14h達對數生長期 後接種至增殖培養基，接菌量5% (乳酸乳球菌3%、保加利亞乳杆
菌2%)，培養時間8h;當滅菌後蛋白浸提液溫度降至4(TC進行接菌， 接菌量10%，溫度37.5'C，溼度70%，恆溫發酵36h。
3. 熱處理
發酵後混合液經卯。C、 10min的熱處理,殺滅微生物發酵菌群， 並使蛋白質適度變性。
4. 酶解
(1) 加酶水解
經熱處理後的發酵液通過測定發酵液中蛋白質的含量配製成5% 蛋白質濃度溶液，用4mol/L的NaOH調節pH值8.5，置於恆溫水浴 中，溫度4(TC，胰蛋白酶的用量按蛋白底物濃度比0.6%，胰酶1.5 %，酶解4.5h，小肽得率65%,水解度29.1%。酶解過程中pH值應 保持在6.5 7.0的範圍內，出現異常時，用HCL及Ca (OH) 2進行 調解。
(2) 酶失活處理 將酶水解液加熱到80 85t:，恆溫保持5min，使酶失活。
5. 產品的乾燥-
採用DZF-6030B型真空乾燥箱在55。C進行真空濃縮至濃度 30% 40%;濃縮後噴入真空罐,經83-85"真空狀態下瞬時蒸發出水 分、噴粉，獲得小肽產品。
6. 實驗結果分析 (1)原料的預處理
試驗材料進行適度粉碎處理破壞蛋白由於存在大量二硫鍵的致 密、立體結構，使其成為鬆散、柔軟的伸展狀，增大表面積，以提高 蛋白溶出率和發酵酶解效果。經粉碎混勻後以氮溶解指數為指標，通 過單因素分析和正交實驗對浸提溫度、pH值、蛋白濃度、時間進行 工藝優化，獲得最佳預處理條件(浸提溫度55i:，溶液pH值7.7， 5 %的蛋白濃度，浸提60min)，可溶性氮佔總氮含量的83.5%。(2) 乳酸菌發酵
經增殖培養後接種至滅菌後蛋白飼料浸提液，以蛋白質、賴氨酸 和蛋氨酸含量為指標，通過單因素分析和正交實驗對溫度、PH值、
接種量、濃度、時間優化，在滅菌後蛋白飼料浸提液經溫度37.5。C、 pH值7.3、接種量10%、 5%蛋白質濃度、培養32h條件下發酵，蛋 白質含量由最初44. 3%增殖至55%。
(3) 蛋氨酸含量測定 按檢測方法中相應方法測定，獲得蛋氨酸標準曲線(圖1)，根據
曲線求得不同發酵時間樣品蛋氨酸含量(見圖2)，發酵36h蛋氨酸 含量最高，達2.51%，之後隨著發酵的進行明顯降低。
(4) 賴氨酸含量測定
按檢測方法中測定，獲得賴氨酸標準曲線(見圖3)，並求得不 同時間樣品中賴氨酸含量的變化曲線(圖4)，發酵32h含量最高， 達到5.17。％，並隨著發酵時間的進行，含量變化趨於平穩，略有下 降。
(5) 酶解條件
胰蛋白酶和胰酶複合酶解，以酸溶性蛋白(TCA-NSI)含量為指 標，根據單因素分析和正交實驗，確定本實驗條件下最佳酶解物理參 數溫度40。C、 pH值8.5、胰蛋白酶-底物濃度比0.6%、胰酶一底 物濃度比1.5%、底物濃度8%。根據S印hadex G-15柱層析水解液 峰值的變化，隨著水解的進行，游離胺基酸含量不斷增加，而小肽含 量變化比較微弱，綜合考慮，經酶解4.5h，水解度29. 1%，平均鏈 長度3.44時，酶解效果最好。
(6) 小肽平均鏈長度(PCL) 蛋白質水解度按檢測方法中水解度測定方法以不同濃度完全水
解蛋白為標準溶液進行測定，獲得標準工作曲線 Y=0. 0005X-0. 0844， R2=0. 9997。取2g處理後不同酶解時間樣品測定 水解度，從標準工作曲線上查得蛋白質含量，並求出水解度及估算出 平均肽鏈長度
(7) 分子質量測定 按檢測方法中測定各標準品出峰時間牛血清白蛋白50.17min，溶菌酶62. 69min，桿菌肽71. 308 min，氧化型穀胱甘肽88. 142 min，還原型穀胱甘肽102.39 min,酪氨酸115.2 min，繪製其與標 準蛋白分子質量對數(lgM)的標準曲線如圖6，獲得回歸方程 Y=-0.0206X+4. 6178， R2=0. 9981，線性關係很好，可以根據此回歸方 程計算小肽水解液的分子質量。
取不同酶解時間的水解液經S印hadex G-15凝膠過濾分離結果見 圖7，酶解液有4個明顯的洗脫峰，第1峰的出峰時間為61. 24，為 柱前鋒，第2、 3兩個峰的出峰時間分別是84.23、 99.157，根據回 歸方程計算兩個峰的分子量分別為763. 59Da、 375. 98Da，峰4出峰 時間是162.345，根據酪氨酸的出峰時間和不同酶解時間圖譜分析判 定是混合胺基酸，在280nm紫外光下不成線性相關。應用部分收集器 收集多肽洗脫峰，經凱式定氮測定，第2、 3、 4含氮佔總可溶性氮的 77. 84%，說明經酶解後小肽分子質量主要集中在300 800Da之間。
權利要求
1.一種乳酸菌混菌發酵結合酶解法生產蛋白飼料源小肽工藝，其特徵在於工藝流程如下(1)原料預處理步驟一選擇新鮮優質的豆粕、玉米蛋白粉、麥麩，使用粉碎機粉碎後過40目的篩子，稱量後按比例進行混勻，混合比例按美國NRC營養標準中賴氨酸、蛋氨酸理論含量值並根據奶牛賴氨酸和蛋氨酸營養需要比例(100.00∶48.70)確定豆粕∶玉米蛋白粉∶麩皮＝15∶4∶1；步驟二稱取一定量混合物，按5％蛋白質濃度與50℃去離子水混合，攪拌均勻，應用飽和Ca(OH)2調節pH為7.7，經封裝置於55℃空氣浴振蕩器中，頻率100r/min，萃取反應60min；步驟三浸提後溶液經121℃高溫溼熱滅菌15min，殺滅病原菌，鈍化脂肪氧化酶和脲酶等成分；(2)乳酸菌發酵將菌種解凍復活，在種子培養基上接種，培養14h達對數生長期後接種至增殖培養基，接菌量5％其中乳酸乳球菌3％、保加利亞乳桿菌2％，培養時間8h；當滅菌後蛋白浸提液溫度降至40℃進行接菌，接菌量10％，溫度37.5℃，溼度70％，恆溫發酵36h；(3)熱處理髮酵後混合液經90℃、10min的熱處理，殺滅微生物發酵菌群，並使蛋白質適度變性；(4)酶解加酶水解經熱處理後的發酵液通過測定發酵液中蛋白質的含量配製成5％蛋白質濃度溶液，用4mol/L的NaOH調節pH值8.5，置於恆溫水浴中，溫度40℃，胰蛋白酶的用量按蛋白底物濃度比0.6％，胰酶1.5％，酶解4.5h，小肽得率65％，水解度29.1％，酶解過程中pH值應保持在6.5～7.0的範圍內，出現異常時，用HCL及Ca(OH)2進行調解；酶失活處理將酶水解液加熱到80～85℃，恆溫保持5min，使酶失活；(5)產品的乾燥採用DZF-6030B型真空乾燥箱在55℃進行真空濃縮至濃度30％～40％，後經FD-1B-55型真空冷凍乾燥機乾燥，獲得小肽產品。
全文摘要
本發明提供一種利用微生物發酵和酶解複合技術，採用常用蛋白飼料的乳酸菌混菌發酵結合酶解法生產蛋白飼料源小肽工藝。工藝流程選擇新鮮優質的豆粕、玉米蛋白粉、麥麩，使用粉碎機粉碎後過40目的篩子，稱量後按比例進行混勻，稱取一定量混合物，按5％蛋白質濃度與50℃去離子水混合，攪拌均勻，應用飽和Ca(OH)2調節pH為7.7，經封裝置於55℃空氣浴振蕩器中，頻率100r/min，萃取反應60min；利用微生物發酵和酶解複合技術採用常用蛋白飼料製得的小肽無苦味和異味，口感好，生產成本大大降低，小肽得率佔蛋白質含量65％，蛋氨酸2.51％，提高1.67％，賴氨酸5.17％，提高1.76％，為其他蛋白飼料資源生產飼用小肽提供了有效的資料和數據。
文檔編號A23K1/14GK101669571SQ200910072989
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月28日 優先權日2009年9月28日
發明者嚴雲勤, 佟慧麗, 娜 王, 超 陳, 高學軍, 黃建國 申請人:東北農業大學