簡單脂肪桿菌dm18菌株及其製備d－蘋果酸的方法

2023-06-11 17:06:36 2

專利名稱：簡單脂肪桿菌dm18菌株及其製備d－蘋果酸的方法
技術領域：
本發明屬於有機酸製備技術領域，具體涉及一種簡單脂肪桿菌(簡單棲油桿菌)(Pimelobacter simplex)DM18菌株製備D-蘋果酸的方法。
背景技術：
D-蘋果酸(英文名D-malic acid，中文別名羥基丁二酸、羥基琥珀酸)是一種自然界中稀少的有機酸。D-蘋果酸主要應用於手性藥物合成、手性添加劑、手性助劑等領域，如抗生素、藥物信息素、抗病毒藥物、抗癌藥物、HMG-CoA還原酶抑制劑、抗組胺藥、D-和L-肉毒鹼、維生素(R)-泛酸等合成，也可作為藥物拆分試劑和不對稱合成的配體。
D-蘋果酸合成方法主要有化學拆分法、生物拆分法(或生物降解法)、生物轉化法(酶法)等。化學拆分法成本高，國內進行了消旋體蘋果酸的生物拆分研究工作，但D-蘋果酸對菌體生長有抑制作用，D-蘋果酸的生產濃度極低。目前還沒有生物轉化法製備D-蘋果酸的研究報導。
從馬來酸製備D-蘋果酸的生物轉化方法是最經濟的路線。1993年日本的Asano Y.等(Environ Microbio.1993，591110-1113.)報導了用Arthrobacter sp.MCI2612菌進行轉化反應、產量為87g/l、摩爾轉化率為72％。
1993年荷蘭Van der Warf M.J.等(Appl Environ Microbiol.1993，582854-2860)報導了Pseudomonas pseudoalcaligenes NCIMB9867。該菌有較高的馬來酸水合酶活力，但誘導劑對該菌的生長有強烈的抑制作用，使得該菌株較難培養(OD660＜1.0)(Would JMicrobiol Biotech 1997，13279-282)，而且該菌所產馬來酸水合酶耐鹽性和穩定性差(Biocatal Biotransform 1999，17125-137)。

發明內容
本發明需要解決的問題是生物轉化馬來酸製備D-蘋果酸過程中馬來酸水合酶活性低和穩定性差、不耐鹽，而不能高效轉化的問題。
本發明的技術方案是首先從自然界篩選了產馬來酸水合酶的嗜鹽性或耐鹽性菌種，採用其中一株高活性菌株簡單脂肪桿菌(Pimelobacter simplex)DM18進行如下反應。該菌株已送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號(CCTCC M 204088)，保藏日期(2004年11月26日)。
本發明的反應路線為 其中，馬來酸鹽為可溶性鹽或難溶性鹽，也可為按一定比例的可溶性性鹽和難溶性鹽的組合。可用的可溶性馬來酸鹽不必加以特別限定，常用的可溶性鹽即可。更具體地說，可以選自鈉鹽、鉀鹽。所指的鹽既可以是所說的鹽，也可用相應的酸，加相應的鹼獲得，例如，馬來酸鈉鹽可以用馬來酸加氫氧化鈉獲得。這樣反應產生的D-蘋果酸相應的鹽一般具有較好的溶解度。可用難溶性馬來酸鹽不必加以特別限定，常用的難溶性鹽即可。更具體地說，可以選自鈣鹽、鋇鹽。這樣隨著反應的進行，難溶性馬來酸鹽轉化成溶解度底的D-蘋果酸鹽，利於過濾獲得產品。
所說的菌種具有以下特徵(一)菌種的來源及分離方法、形態特徵以底物馬來酸的類似物寧康酸Citraconic acid為唯一碳源和能源進行篩選，共篩到29株菌，再從能代謝和利用寧康酸的菌株中篩選馬來酸水合酶高的菌珠，即分別從馬來酸及寧康酸為底物轉化後採用HPLC法分別進行D-蘋果酸(D-malic acid)及D-寧蘋酸(Citramalic acid)測定，選取D-蘋果酸及D-寧蘋酸酸量高的轉化菌株。
該菌株為革蘭氏陽性，無芽孢。過氧化物酶試驗陽性。同時該菌株經16srDNA(同源性為98.2％)序列分析及脂肪酸指紋分析鑑定，該菌為簡單脂肪桿菌(簡單棲油桿菌)(Pimelobacter Simplex)DM18.
(二)菌體的發酵該菌體在檸康酸為誘導劑的發酵液中發酵即可。一般地發酵液中含有作為誘導劑的檸康酸0.5-10g/L；作為碳源，一般不必特別限定，可用糖類例如葡萄糖，0-10g/L；作為緩衝溶劑，只要能維持發酵液pH6-10即可，可以選用磷酸二氫鉀5-15g/L；作為無機氮源可以選用硝酸銨0-5g/L；作為生長因子的微量元素可選用鎂鹽和/或亞鐵鹽，例如無水硫酸鎂，0-5g/L，七水硫酸亞鐵0-0.5g/L；作為有機氮可以用酵母膏、蛋白腖、牛肉膏和/或魚粉，添量為0-20g/L；作為有機氮和碳源可選用玉米漿添加量為0-30g/L；菌種接種量(體積百分比計)一般為0.2-10％，更好為3-6％，在150-300rpm轉速攪動下，保持溫度在20-40℃，發酵至水合酶活力被誘導出來，發酵時間一般為16-50小時，發酵25～38小時較好。
該菌發酵後收集菌體，在反應液中含1％以下的破壁劑用於後續反應。破壁劑可選用甲苯，SDS(十二烷基磺酸鈉)，CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)等，較好為CTAB，所用濃度可根據一般使用量確定，較好的使用量為以重量百分計1-3‰。
其發酵特點為1、無需大量的碳氮源，一般固體碳氮源的含量0-50g/l.2、用檸康酸作為誘導劑.3、發酵為好氧發酵。
所說的反應，可以按以下方式進行(一)馬來酸可溶性鹽轉化成D-蘋果酸採用磷酸或Tris-HCl緩衝液，由收集的菌體製備菌懸液(pH6.0～8.0，pH7.0～7.2更好)，加入一定量的破壁劑和底物-馬來酸可溶性鹽例如鈉鹽、鉀鹽等(以馬來酸計算濃度為20～120g/L，濃度為60～80g/L更好)，在28～36℃反應，30-34℃反應更好，可獲得產物D-蘋果酸可溶性鹽。
(二)馬來酸難溶性鹽轉化成D-蘋果酸採用磷酸或Tris-HCl緩衝液，由收集的菌體製備菌懸液(pH6.0～8.0，pH7.0～7.2更好)，加入一定量的破壁劑和底物-馬來酸難溶性鹽例如鈣鹽、鋇鹽等(以馬來酸計算濃度可從100～500g/L)，在28～36℃反應，30-34℃反應更好，可獲得產物D-蘋果酸難溶性鹽。
其轉化反應特點為1、採用馬來酸鈣鹽或鋇鹽，其中以馬來酸鈣鹽的轉化反應速率為最快。2、只要能充分攪拌馬來酸鈣鹽固體，就可以加快反應。
(三)馬來酸難溶性鹽加少量馬來酸可溶性鹽轉化成D-蘋果酸在上述反應(二)的反應液中除馬來酸難溶性鹽例如鈣鹽以外，加入少量馬來酸可溶性鹽例如鈉鹽，馬來酸可溶性鹽的添加量可以以酶活性的變化來決定，一般調整到游離馬來酸終濃度為30-120g/L，較好為50-80g/L，在28～36℃反應，30-34℃反應更好，可獲得產物D-蘋果酸難溶性鹽。
綜上所述，本發明採用簡單脂肪桿菌(簡單棲油桿菌)(Pimelobacter simplex)DM18菌株，所產生的馬來酸水合酶具有耐高濃度底物和產物特點，同時具有較高穩定性，有效避免高濃度產物及底物對馬來酸水合酶的抑制作用。進一步耦合利用馬來酸和D-蘋果酸難溶性鹽例如鈣鹽、鋇鹽的溶解度低的特點，以馬來酸鈣或馬來酸鋇為底物，經水合酶催化加水轉化成D-蘋果酸鈣或鋇，實現邊反應邊分離產物的反應分離耦合的目的。同時巧妙地利用難溶性鹽例如鈣鹽或鋇鹽與可溶性鹽例如鈉鹽或鉀鹽的混合反應體系提高了轉化反應速率，縮短反應時間，提高產量和轉化率。本發明方法可以獲得200～500g/L的D-蘋果酸鈣，其轉化率可達99％。同時，菌體的培養條件比較簡單，易於得到活性穩定的菌體，因此利於產業化大規模生產。
具體實施例方式
(實施例)實施例1(菌體的發酵)按以下重量比例配製發酵液檸康酸2.5g/L，葡萄糖3g/L，磷酸二氫鉀10.5g/L，硝酸銨2.0g/L，無水硫酸鎂0.25g/L，七水硫酸亞鐵0.015g/L，酵母膏2.8g/L，玉米漿5g/L，此時pH值7.2。滅菌後接種量為4％，在溫度為30℃和轉速為200rpm攪拌下，發酵。
實施例2 Pimelobacter simplex DM18菌、按實施列1發酵28小時，離心收集菌體，用Tris-HCl緩衝液(pH7.2)製備菌懸液，調整反應液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和80g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計算濃度為80g/L)，32℃振蕩反應(或攪拌反應)15小時，獲得91g/L的D-蘋果酸。
實施例3 Pimelobacter simplex DM18菌、按實施列1發酵30小時，離心收集菌體，用Tris-HCl緩衝液(pH7.2)製備菌懸液，調整反應液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁CTAB和80g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計算終濃度為80g/L)開始反應，32℃振蕩反應(或攪拌反應)，反應開始3～4小時後間歇添加少量高濃度的馬來酸鈉鹽溶液，連續反應32小時，獲得153.9g/L的D-蘋果酸，底物轉化收率達到96.67％。
實施例4 Pimelobacter simplex DM18菌、按實施列1發酵28小時，離心收集菌體，用Tris-HCl緩衝液(pH7.2)製備菌懸液，調整反應液終OD660至10，加入終濃度為5‰的破壁劑甲苯和200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(或攪拌反應)30小時，獲得218g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶於溶液中，底物轉化率達到99％以上(以轉化後存在底物含量計).
實施例5 Pimelobacter simplex DM18菌、按實施列1發酵28小時，離心收集菌體，用Tris-HCl緩衝液(pH7.2)製備菌懸液，調整反應液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和60g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計算濃度為60g/L)，同時加入200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(或攪拌反應)26小時，獲得259g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶於溶液中，底物轉化收率達到99％以上(以轉化後存在底物含量計)。
實施例6 Pimelobacter simplex DM18菌、按實施列1發酵28小時，離心收集菌體，用Tris-HCl緩衝液(pH7.2)製備菌懸液，調整反應液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和60g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計算濃度為60g/L)，同時加入200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(或攪拌反應)26小時，獲得257g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶於溶液中，底物轉化收率達到99％；離心分離產物和反應液，在回收反應液中再加入200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(或攪拌反應)28小時，獲得221g/L的D-蘋果酸鈣鹽，底物轉化收率達到99％以上(以轉化後存在底物含量計).
實施例7 Pimelobacter simplex DM18菌、按實施列1發酵28小時，離心收集菌體，用Tris-HCl緩衝液(pH7.2)製備菌懸液，調整反應液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和60g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計算濃度為60g/L)，同時加入400g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(或攪拌反應)42小時，獲得487g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶於溶液中，底物轉化收率達到99％以上(以轉化後存在底物含量計)。
權利要求
1.一種轉化馬來酸製備D-蘋果酸的菌株，其特徵在於該菌株是簡單脂肪桿菌(簡單棲油桿菌)(Pimelobacter Simplex)DM18菌株，已由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號CCTCC M 204088；該菌為革蘭氏陽性，無芽孢；過氧化物酶試驗陽性。
2.根據權利要求1所述菌株製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於用Pimelobactersimplex DM18菌的馬來酸水合酶轉化馬來酸製備D-蘋果酸，反應路線為
3.根據權利要求2所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽為可溶性鹽。
4.根據權利要求3所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽的可溶性鹽為鈉鹽或鉀鹽。
5.根據權利要求3或4所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於採用間歇添加高濃度的馬來酸可溶性鹽，維持馬來酸可溶性鹽濃度低於80g/L，進行反應。
6.根據權利要求2所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽為難溶性鹽。
7.根據權利要求6所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽的難溶性鹽為鈣鹽或鋇鹽。
8.根據權利要求6或7所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵在於反應過濾分離出D-蘋果酸難溶性鹽後，在母液中加入馬來酸難溶性鹽，繼續反應。
9.根據權利要求2所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵是發酵液無需大量的碳氮源，一般固體碳氮源的含量為0-50g/l，並用檸康酸作為誘導劑，發酵為好氧發酵。
10.根據權利要求2所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵是反應物用馬來酸難溶性鹽和少量馬來酸可溶性鹽，馬來酸可溶性鹽添加量在30～120g/L，並充分攪拌。
11.根據權利要求10所述製備D-蘋果酸的方法，其特徵是馬來酸難溶性鹽是鈣鹽或鋇鹽，馬來酸可溶性鹽是鈉鹽或鉀鹽。
全文摘要
本發明屬於有機酸製備技術領域，具體涉及一種簡單脂肪桿菌(簡單棲油桿菌)(Pimelobacter simplex)DM18菌株製備D－蘋果酸的方法。本發明採用高活性菌株簡單脂肪桿菌DM18產生的馬來酸水合酶，將馬來酸難溶性鹽或可溶性鹽轉化為D蘋果酸鹽，轉化率可達99％，菌體培養條件簡單，活性穩定，利於產業化大規模生產。
文檔編號C12P7/46GK1632104SQ20041006538
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月30日 優先權日2004年11月30日
發明者何冰芳, 柏中中, 章雲, 周華, 韋萍, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學