能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的製作方法

2023-06-11 17:05:46

能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的製作方法
【專利摘要】本發明涉及適合用於治療或預防幽門螺桿菌感染的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株。
【專利說明】能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株
[0001]本發明涉及益生菌領域。具體地說，本發明涉及用於治療或預防幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染的新德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)菌株。
[0002]根據美國國家酸奶協會(NYA)或國際生命科學會(ILSI)最近批准的定義，益生菌是在以充足量消化時發揮超出基本營養之外的健康益處的活微生物。在屬於乳品工業常用的屬乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)的種類中已描述了益生菌。認為益生菌通過阻止致病微生物的發展和/或更直接地作用於免疫系統而在腸道微生物叢水平上進行幹預。
[0003]幽門螺桿菌(H.pylori)是革蘭氏陰性螺旋形細菌，其寄居在超過50%世界人口的人胃粘液層中。而被幽門螺桿菌感染的大多數個體是無症狀的，雖然他們的胃上皮出現炎症體徵，15%至20%的幽門螺桿菌感染個體出現疾病。實際上，幽門螺桿菌是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾病、萎縮、化生、發育異常、胃癌和胃黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的主要病原體(參見綜述Fox和Wang, 2007以及Polk和Peek, 2010)。[0004]在感染期間，幽門螺桿菌特通過該細菌產生的多個粘附分子(粘附素)如BabA和SabA蛋白特異性地與內襯胃上皮的胃上皮細胞結合。粘附至胃上皮細胞使細菌免受流體流動、蠕動和粘液層的脫落。幽門螺桿菌粘附至胃黏膜誘導胃上皮細胞內的信號轉導途徑，通過氧化應激、細胞凋亡和/或自體吞噬機製造成胃上皮細胞損傷和萎縮。因此，幽門螺桿菌粘附至胃上皮細胞是建立胃黏膜感染的關鍵步驟。
[0005]對幽門螺桿菌感染患者的標準治療是兩種抗生素聯合質子泵抑制劑(PPI)，所謂的三聯療法。然而，由於抗生素耐藥性或較差的順應性，三聯療法治療後的幽門螺桿菌的根除率在下降。此外，儘管有幾次臨床試驗，目前尚無有效的疫苗上市。
[0006]由上述內容可見，需要對用於治療或預防幽門螺桿菌感染的三聯療法的替代療法或補充療法。
[0007]已提出使用產生乳酸、細菌素和其它抗菌物質的益生乳酸菌(LAB)作為替代療法。Boyanova等人(2009)已發現幾種德式乳桿菌保加利亞亞種(L.bulgaricus)菌株,其以菌株依賴性方式在體外(使用瓊脂孔擴散法)抑制幽門螺桿菌菌株包括耐抗生素菌株的生長。然而，所研究的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株未被明確鑑定出來，且是公眾不能獲得的。Simova等人(2009)篩選了幾種產生細菌素的乳酸菌。之後，他們通過採用兩種體外方法(瓊脂孔擴散法及Barefoot和Klaenhammer的臨界稀釋試驗)來分析這些菌株的無細胞上清液(CFS)的抗微生物活性而測定了所述菌株的抗微生物活性。他們發現，由於其抗微生物活性，德式乳桿菌保加利亞亞種BB18菌株的CFS抑制了廣譜致病微生物(細菌或酵母菌)包括幽門螺桿菌菌株的生長。
[0008]本申請發明人分離了一種新的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株並發現該菌株在體外和體內抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。這種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株(命名為DN_100_0602或CNCM 1-4428)因而能夠用於通過靶向建立這一感染的主要步驟(即通過抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞)治療或預防幽門螺桿菌感染。
[0009]因此，本申請的保護主題是根據布達佩斯條約於2011年2月3日在CNCM(國家培養物和微生物保藏中心((Collection Nationale de Cultures de Microorganismes),25rue du Docteur Roux,巴黎)以保藏號CNCM 1-4428保藏的菌株德式乳桿菌保加利亞亞種。
[0010]該菌株CNCM 1-4428具有以下特性:
[0011]-形態學:革蘭氏陽性微生物，不動的、杆狀的、具有顆粒的長桿菌，
[0012]-代謝:同型發酵(homofermentive),過氧化氫酶(-),
[0013]-糖發酵(在37°C下在MRS培養基中採用API50CH試驗持續48h獲得的結果):葡萄糖、果糖、甘露糖和乳糖。
[0014]此外，該菌株能夠在體外和體內抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。
[0015]如本文所用，術語「抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞」是指顯著抑制(即全部或部分抑制)幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。可以如下面實施例1中所示在體外測量幽門螺桿菌菌株對上皮細胞粘附的抑制。
[0016]本發明還涵蓋了突變菌株或由親本菌株CNCM 1-4428衍生的遺傳轉化菌株，前提條件是它們能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。這些突變體或遺傳轉化菌株可以是其中親本菌株的一種或多種內源性基因已經突變，例如以改變一些其代謝性質(例如其發酵糖的能力、其耐酸性、其在胃腸道轉運的存活力、其酸化後性質或其代謝產物的生成)的菌株。它們也可以是由親本菌株CNCM 1-4428通過一種或多種目標基因進行遺傳轉化得到的菌株，例如為了賦予所述遺傳轉化的菌株額外的生理特徵，或允許其表達具有治療或疫苗益處的蛋白，人們希望通過所述菌株給予這樣的蛋白。這些菌株可以由CNCM1-4428菌株通過用於乳酸菌屬隨機誘變或定點誘變以及遺傳轉化的常規技術，如Gury等人(2004)或Perea V6lez等人(2007)描述的那些，或者通過被稱為「基因組改組」的技術(Patnaik等人，2002和Wang等人，2007)獲得。
[0017]本發明的保護主題也是用於獲得能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的方法，該方法包括誘變或遺傳轉化菌株CNCM 1-4428的步驟。
[0018]本發明的保護主題也是細胞組分(cell fractions),其可以由如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428獲得，前提條件是它們能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。它們特別是由所述菌株的培養物獲得的DNA製劑或細菌細胞壁製劑。它們還可以是培養物上清或這些上清的部分。舉例來說，菌株CNCM 1-4428的無細胞上清(CFS)可以通過使用用於從Simova等人(2009)公開的另一種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株獲得CFS的方法而獲得。[0019]本發明的保護主題也是用於獲得能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的細胞組分的方法，該方法包括以下步驟:
[0020]a)培養如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM1-4428，以及
[0021]b)由步驟a)中的培養物獲得細胞組分。
[0022]本發明的保護主題也是包含根據本發明的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428，或由根據本發明的所述菌株獲得的細胞組分的組合物。
[0023]在本發明的組合物中，所述菌株可以以全菌形式使用，所述全菌可以是活的或死的。可選地，所述菌株可以以細菌裂解物的形式或以細菌成分的形式使用；例如，可以通過測試它們在幽門螺桿菌對上皮細胞的粘附方面的性質來選擇適合這種用途的細菌成分。優選細菌細胞以活的、有生命力的細胞存在。
[0024]本發明的組合物可以是任何適合施用特別是經口施用的形式。這包括例如固體、半固體、液體和粉末。液體組合物由於更易施用，例如作為飲料，而是普遍優選的。
[0025]組合物可以包含每克如上所述的至少一種細菌菌株乾重至少IO5個cfu、優選至少IO6 個 cfu。
[0026]組合物還可以包含除了根據本發明的菌株以外的其他細菌菌株，特別是益生菌菌株，如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬或乳球菌屬菌株。
[0027]當細菌是活細菌形式時，組合物可以通常包含每克組合物乾重IO5至IO13個菌落形成單位(cfu),優選至少IO6個cfu,更優選至少IO7個cfu,更優選至少IO8飛cfu以及最優選至少IO9個cfu。在液體組合物的情況中，這一般對應於IO4至IO12個菌落形成單位(cfu),優選至少IO5個cfu,更優選至少IO6個cfu,更優選至少IO7個cfu,以及最優選至少IO9 個 cfu/ml ο
[0028]組合物可以是營養組合物，包括食品、食品補充劑和功能性食品。〃食品補充劑〃是指由一般在食 品中使用的化合物製成的產品，但其是以片劑、粉劑、膠囊劑、飲劑的形式或一般與食物不相關的任何其它形式，且其對人們的健康是有益處的。"功能性食品"是對人們的健康也有益處的食物。具體地說，食品補充劑和功能性食品能夠對疾病例如慢性疾病具有保護性或治療性的生理效應。
[0029]根據本發明的營養組合物也包括嬰兒食品、嬰兒乳配方或嬰兒後續配方(infantfollow-on formula) 0優選地，本發明組合物是營養品或藥物產品、營養補充劑或醫療食
品O
[0030]組合物可以是乳製品，優選發酵乳製品。發酵產品可以以液體形式存在或者以通過乾燥發酵的液體獲得的乾粉形式存在。乳製品的實例包括凝固、攪拌或可飲用形式的發酵乳和/或發酵乳清、乳酪和酸乳酪。
[0031]發酵產品也可以是發酵的植物，如凝固、攪拌或可飲用形式的發酵的大豆、穀物和/或水果。
[0032]在優選的實施方案中，發酵的產品是新鮮產品。未經過劇烈的熱處理步驟的新鮮產品具有如下優點:細菌菌株以活體形式存在。
[0033]本發明的保護主題也是用作藥物的如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物。
[0034]本發明的保護主題也是用作用於治療或預防幽門螺桿菌感染的藥物的如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物。
[0035]本發明的保護主題也是如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物作為藥物優選用於治療或預防幽門螺桿菌感染的藥物的用途。[0036]本發明的保護主題也是如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物在製備藥物優選用於治療或預防幽門螺桿菌感染的藥物中的用途。
[0037]本發明的保護主題也是用於治療或預防有需要的受試者中幽門螺桿菌感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM 1-4428，或如上面所定義的組合物。
[0038]治療有效量的確定對於本領域技術人員是公知的，尤其是考慮到本文所提供的詳細公開內容後。
[0039]本發明的保護主題也是用於生產藥物，優選用於治療或預防幽門螺桿菌感染的藥物的方法，所述方法包括將如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優選菌株CNCM
1-4428，或者如上面所定義的組合物併入到至少一種藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑中。
[0040]如本文所用，治療或預防由其涵蓋:預防感染、穩定幽門螺桿菌的載量和/或降低幽門螺桿菌的載量。治療或預防還涵蓋緩解下面所述的與幽門螺桿菌相關的至少一種症狀。
[0041]用於診斷幽門螺桿菌感染的方法是本領域中已知的。舉例來說，可以通過血液抗體試驗、糞便抗原試驗或碳尿素呼氣試驗來進行幽門螺桿菌感染的診斷。也可以通過內窺鏡下活組織檢查之後進行尿素酶試驗、組織學檢查或微生物培養來進行幽門螺桿菌感染的診斷。
[0042]與幽門螺桿菌感染相關的症狀或疾病是胃痛、胃灼熱、酸反流、腹痛、反胃、嘔吐、噯氣、胃氣脹、噁心、胃炎如慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾病、萎縮、化生、發育異常、胃癌和胃黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。
[0043]根據下面的進一步描述可以更清楚地理解本發明，即示出CNCM 1-4428菌株的抗感染性質的實施例以及隨附的附圖。
[0044]圖1顯示了對接受對照產品的被幽門螺桿菌SSl感染的小鼠或被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-4428治療的小鼠或被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1632 (Lbl30)治療的小鼠在治療前(第一棒)、治療後3周(第二棒)及處死前(第三棒)測量的體重變化(以克計)。
[0045]圖2顯示了通過免疫組織化學使用抗-幽門螺桿菌抗體在(i)未被幽門螺桿菌感染的小鼠、(ii)接受對照產品(非發酵乳品)的被幽門螺桿菌SSl感染的小鼠、(iii)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1632 (Lbl30)治療的小鼠以及(iv)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-4428治療的小鼠中獲得的感染得分。得分的定義:0:無感染腺；1:極少感染腺，2:25%感染腺，3:25至50%感染腺，4:>50%感染腺。
[0046]圖3顯示了通過實時PCR在⑴未被幽門螺桿菌感染的小鼠、(ii)被幽門螺桿菌SSl感染但接受對照產品(非發酵乳品)的小鼠、(iii)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-4428治療的小鼠以及(iv)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1632 (Lbl30)治療的小鼠中獲得的幽門螺桿菌SSlDNA的量化。
[0047]實施例1:選擇德式乳桿菌保加利亞亞種菌株評估其對幽門螺桿菌對胃上皮細胞的粘附的作用
[0048]使用經過改良的OleastiO等人(2008)描述的方法來評估兩種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株(CNCM 1-4428和於1995年10月25曰在CNCM保藏的CNCM1-1632)對幽門螺桿菌對上皮細胞的粘附性質的作用。
[0049]1.1材料&方法
[0050]測試了兩種幽門螺桿菌菌株:菌株J99 (BabA2 ；ATCC號:700824)和菌株
09.193 (BabAl，由Yoshio Yamaoka在日本分離得到，來自Oita大學)。米用50的MOI (感染複數)對這些菌株進行測試。將幽門螺桿菌細胞在幽門瓊脂(Bi0m6rieUX，法國)中培養24h之後轉移到PBS緩衝液中。將兩種幽門螺桿菌菌株的細菌懸浮液的濃度分別標準化至
2.108cfu/mL(對應於 OD60cinm=I)。
[0051]採用50的MOI對這兩種德式乳桿菌保加利亞亞種懸浮液進行測試(對應於每孔25 μ L標準化的德式乳桿菌保加利亞亞種的懸浮液)。
[0052]在感染實驗前一天在500 μ L補充有10%胎牛血清的DMEM培養基F12中接種100000 個上皮 AGS 細胞(ATCC 號:CRL_1739)。
[0053]幽門螺桿菌懸浮液的染色
[0054]在1000Og下將ImL幽門螺桿菌懸浮液離心10分鐘。將沉澱物(pellet)重懸浮於ImL稀釋液A (Diluent A)(來自PKH2綠色螢光細胞連接試劑盒(PKH2Green FluorescentCell Linker Kit), Sigma Aldrich, Saint-Louis),並加入 2.5 μ L PKH2 (Sigma Aldrich,Saint-Louis)。將懸浮液在室溫下孵育2分鐘30秒。通過加入2mL胎牛血清停止染色。然後加入4mL DMEM/F12培養基，之後在1000Og下離心懸浮液10分鐘。將沉澱物重懸浮於4mL培養基中並在1000Og下離心10分鐘。將該洗滌步驟重複兩次以除去多餘的螢光染料。
[0055]粘附的測暈
[0056]用PBS洗滌3次以除去未粘附的細菌之後，採用胰蛋白酶遵循標準條件解離上皮AGS細胞。通過流式細胞術分析螢光發射。使用FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson)測量螢光。以三重重複進行每種條件。
[0057]在兩種條件下進行幽門螺桿菌感染
[0058]-在感染前(pre)條件下:在用幽門螺桿菌感染前lh30將待測試的德式乳桿菌保加利亞亞種懸浮液加入到上皮AGS細胞。在感染後lh30(孵育時間共計3h)通過流式細胞術分析細胞；
[0059]-在同時感染(Co)條件下:同時將待測試的德式乳桿菌保加利亞亞種懸浮液和幽門螺桿菌菌株加入到上皮AGS細胞，並在孵育lh30後通過流式細胞術分析細胞。
[0060]XiS
[0061]採用與幽門螺桿菌菌株一起孵育lh30的上皮AGS細胞獲得螢光強度的對照值。
[0062]相對於未暴露於德式乳桿菌保加利亞亞種的幽門螺桿菌對上皮AGS細胞的粘附(其被設定為100%)給出粘附百分比值。
[0063]根據三重重複獲得的平均值分析結果，並且當根據Student’s檢驗結果是顯著不同(P〈0.05)時對其進行評分。
[0064]1.2 結果
[0065] 結果在下文表1中示出。[0066]復1:用2種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株獲得的它們對幽門螺桿菌對上皮AGS
細胞的粘附的作用結果。
[0067]
【權利要求】
1.一種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，特徵在於其以編號1-4428保藏在CNCM。
2.一種用於獲得能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的方法，所述方法包括誘變或遺傳轉化權利要求1的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的步驟。
3.一種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株,特徵在於其能夠通過根據權利要求2所述的方法獲得，以及其能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞。
4.一種用於獲得能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞的細胞組分的方法，所述方法包括以下步驟: a)培養根據權利要求1或3所述的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，和 b)從步驟a)的培養物中獲得細胞組分。
5.一種細胞組分，特徵在於其能夠通過權利要求4所述的方法獲得，以及其能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞。
6.一種組合物，其包含根據權利要求1或3所述的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株或根據權利要求5所述的細胞組分。
7.根據權利要求6所述的組合物，特徵在於其包含每克根據權利要求1或3所述的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株乾重至少105個cfu,優選至少106個cfu。
8.根據權利要求6或7所述的組合物，特徵在於其是營養組合物。
9.根據權利要求8所述的組合物，特徵在於其是乳製品。
10.根據權利要求1或3所述的菌株或根據權利要求6或7所述的組合物，其用作藥物。
11.根據權利要求10所述的菌株或組合物，特徵在於所述藥物用於治療或預防幽門螺桿菌感染。
【文檔編號】C12R1/225GK103987839SQ201180072799
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2011年8月9日 優先權日:2011年8月9日
【發明者】佩吉·加羅, 加埃勒·凱雷, 拉斐爾·布爾代-西卡爾, 弗朗西斯·梅格勞德 申請人:熱爾韋·達諾尼公司