用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統和方法

2023-06-11 11:07:21

專利名稱：用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統和方法
技術領域：
本發明屬於生物晶片領域。具體而言，本發明涉及一種用於對禽流感病毒全部亞型進行檢測和分型的基因晶片，製備該基因晶片使用的型特異性探針、質控探針，利用該基因晶片進行檢測和分型的方法，以及檢測和分型研究中使用的多重RT-PCR引物、多重不對稱RT-PCR引物和通用引物。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza，AI)，是由流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類感染和疾病的總稱。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染，而對家養的雞和火雞引起的危害最為嚴重，候鳥、觀賞鳥、散禽攜帶病毒遷徙可能是禽流感世界性流行的主要原因，豬等也可作為「混合器」傳播本病。禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)血清型亞型眾多、變異性強，存在抗原飄移和抗原轉變，不同亞型、不同分離株病毒的差異很大，目前在全世界各種家禽和野生禽類中，已分離到上千株禽流感病毒，並已證明家禽或舍飼禽類在感染後，可表現為亞臨床症狀、輕度呼吸系統疾病、產蛋量降低或急性致死性疾病。國際獸疫局(OIE)將高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)確定為A類動物疫病，並列入國際生物武器公約動物類傳染病名單，我國也將其列為I類傳染病。
禽流感的爆發一直是困擾全球養禽業的一個難題，尤其是HPAI對世界養禽業及人類健康構成了嚴重威脅。從1959年第一次報導H5亞型的HPAI暴發以來，HPAI共有24次較大的流行，其中19次是在家禽中爆發，且每次都帶來重大經濟損失。禽流感的暴發幾乎波及世界各地。多個國家先後爆發禽間高致病性禽流感疫情，並且出現人間禽流感疫情，全球共有近200人感染禽流感，病死率達51.7％。禽流感的爆發不僅造成了巨大的經濟損失，而且帶來了嚴重的公共衛生問題。
禽流感病原為正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的A型流感病毒，AIV病毒核酸型為單股負鏈RNA，基因組分為8個片段，病毒粒子呈球形，亦可呈絲狀，直徑約80-120nm，有囊膜，表面有放射狀排列的長度為12-14nm的數百個纖突，可分為兩類，分別是棒狀的三聚體血凝素(HA)和呈蘑菇狀的四聚體神經氨酸酶(NA)，根據其表面血凝素(HA)抗原性的不同，可分為16個亞型，即H1～H16，根據神經氨酸酶(NA)抗原性的不同可分為9個亞型，即N1～N9。禽流感病毒存在眾多亞型，核酸為多節段性使得抗原性容易發生漂移、基因突變及重排而不斷變異，可在動物體中表型混合及核衣殼移植變異為新的致病亞型，而現有的檢測方法只能鑑定我國僅有的幾個亞型，無法鑑定國外已經發現的和可能發生的新變異型，導致檢疫中存在漏檢的隱患，而基因晶片可以檢測數以萬計的不同特異性基因序列，因此是進行病毒快速分型檢測的強有力的工具。美國疾控中心從2003年就已經開始了禽流感病毒分型檢測基因晶片的研究工作，香港也在著手這種新型檢測技術的研究。分型檢測基因晶片技術將幫助提供更好的全球流感監測方法，並使鑑定嚴重的流感病毒株變得更容易，這也使得基因晶片技術成為今後禽流感病毒新型檢測技術研究的發展趨勢。因此，建立一種既可以特異、快速的檢測16個HA和9個NA亞型，又可以及時發現新的變異或基因重排病毒的高通量、快速、敏感可靠方法是非常必要和及時的，這對有效監控各種亞型禽流感疫情和AIV的變異以及為迅速有效防制禽流感具有重要意義。
目前，禽流感的主要診斷及檢測方法主要包括病原學、免疫學、分子生物學三個方面AIV的分離和HA/HI試驗是經典的實驗室診斷方法，結果可靠但時間太長；瓊脂擴散(AGP)試驗由於具有簡便快速的特點，成為AI檢疫診斷中應用最廣泛的血清學方法之一，也是我國禽流感診斷國家標準指定的方法之一，但此法的敏感性較低；中和試驗(NT)準確且易操作常用於實驗室診斷，但需較長的時間和花費較多的材料；螢光抗體(FA)試驗具有快速、簡便、易行、較敏感等特點，也常用於臨床診斷；免疫酶標記技術(EIA)以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)為主，儘管其重複性和穩定性有待提高，但具有快速、敏感度高(其敏感度要高於AGP試驗和HI試驗)的特點，常用於大批樣品和血清學檢測檢疫。我國在這些診斷技術方面的研究已經較成熟，許多都實現了商品化，為我國禽流感病毒的檢測診斷髮揮了重要作用，但這些方法一次只能檢測一個亞型。
隨著分子生物學技術的發展，基因體外擴增技術PCR/RT-PCR成為一種重要的疾病診斷技術，它能在數小時內將單分子的靶基因特異地擴增上百萬倍，由此檢出痕量、甚至一個病毒粒子(病原分子)的存在，從而極大地提高了對病原分子的檢測和分析能力，具有靈敏、特異、快速、準確和易於操作的特點。因此PCR/RT-PCR技術在疾病的檢測、鑑別診斷方面得到廣泛應用，並成為人們研究開發的重點方向。Wright等報導應用RT-PCR方法區分A、B、C型禽流感，此法關鍵在特異引物的設計。針對N1～N9亞型的RT-PCR反應分型在理論上可行，但目前還未見成功報導。David Suarez等將RT-PCR技術與螢光探針檢測技術結合後，推出了實時螢光監測的RRT-PCR技術，敏感性遠遠高於普通的RT-PCR。2005年我國禽流感H5、H7、H9亞型多重RRT-PCR檢測試劑盒在深圳研製成功，這意味著我國禽流感病毒檢測獲得重大突破，該成果將讓螢光RT-PCR一次只能檢測一個禽流感亞型成為歷史，實現一次同時檢測三個禽流感亞型。
常規PCR/RT-PCR技術一次PCR反應只能檢測診斷一種病原體，當臨床出現多種病原體混合感染或一種病原多個亞型時，就必須進行多次的PCR/RT-PCR反應才能最後確診。多重PCR技術是一項特殊的PCR方法，具有高效性，系統性，經濟簡便性等優點，對混合感染病原體的鑑別檢測只需一次PCR反應，就可同時鑑別多種病原體或一種病原的多個亞型，這不僅節約昂貴的生物試劑，而且簡化了操作程序，加快了檢測診斷速度，具有很高的臨床應用價值，很多學者已進行了大量研究。
基因晶片技術是20世紀90年代發展起來的融生物學、物理學、化學、計算機科學和微電子學一體的高度交叉的前沿技術。基因晶片技術不僅具有快速、敏感、特異、高通量和自動化的優點，而且通過計算機軟體進行數據處理和結果判定，減少了結果判定受主觀因素影響的可能，提高了檢測結果的可靠性與穩定性，其獨到的優點是一次可同時鑑別診斷多個病毒或者一個病毒的多個亞型，因此，基因晶片技術在快速鑑別診斷和檢測方面具有十分廣闊的應用前景。美國、香港等一些國家和地區早已著手研究檢測禽流感病毒基因晶片。該技術是一種比較系統、完善的檢測技術，該方法的建立不僅有助於禽流感疫情的有效監控，而且可在第一時間內準確的發現新變異或基因重排的新亞型病毒，為應對新疫情暴發提供可靠的技術儲備，禽流感基因晶片技術將成為目前禽流感防控的理想技術。
本發明根據Genebank中已發表的禽流感病毒不同亞型的基因組序列，利用DNAStar、Bioedit、Primer5.0和OMIGA軟體進行分析篩選，並成功地設計了進行禽流感病毒基因晶片技術研究的多重不對稱RT-PCR分型檢測的25對特異性引物、1對通用引物和進行禽流感病毒基因晶片分型技術的52條特異性探針和3條質控探針，通過優化反應條件，建立了特異性強、敏感性高的禽流感病毒基因晶片分型檢測方法。

發明內容
本發明目的在於提供一種用於多重不對稱RT-PCR擴增進而用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統。
本發明的另一目的在於提供一種利用所述引物系統進行禽流感病毒檢測和分型的方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現收集Genebank中發表的不同亞型禽流感病毒的基因組序列，用DNAStar/Bioedit軟體分別對已發表的所有型AIV的全基因序列進行分析，選擇保守基因片段作為目的擴增片段，利用Primer5.0和OMIGA軟體進行引物設計，對可獲得標準毒株的亞型用所設計的型特異性引物對直接進行RT-PCR擴增(在P3實驗室、按照CDC規定標準操作)，對無法獲得標準毒株的亞型，設計滿足搭橋PCR要求的引物對，通過搭橋PCR擴增獲得相應的目的片段。將擴增產物純化回收後連接於T載體上在JM109中克隆擴增並保存菌種(以備後用)，再以保存的陽性質粒為模板將25對引物分成四組進行多重PCR，根據核酸電泳結果對引物進行篩選或重新設計，直到擴增出理想的目的條帶，並通過調整反應體系中的鎂離子濃度和對退火溫度進行優化，最後以病毒樣品為模板把四組多重引物進行多重RT-PCR(在P3實驗室、按照CDC規定標準操作)進行驗證並做敏感性特異性試驗。在多重RT-PCR建立的基礎上，設計出1對通用引物並對25特異性引物進行修飾建立多重不對稱RT-PCR。最後用保存菌液樣品和病毒樣品進行多重不對稱PCR/RT-PCR驗證，具體試驗過程參見實施例1-11。
一個方面，本發明提供了一種用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統，其中包括25對多重不對稱RT-PCR引物和1對通用引物，其中每一對所述多重不對稱RT-PCR引物各針對一種禽流感病毒亞型，所述引物對應的型別及其核苷酸序列如表3所示。其中的TAMRA為螢光染料。
特異性和敏感性試驗結果證明本發明提供的引物對都具有良好的型特異性和敏感性。可用於對待檢樣品進行多重不對稱RT-PCR擴增，進而用於禽流感病毒檢測和分型。
另一方面，本發明提供了一種不對稱擴增禽流感病毒RNA的方法，該方法包括下列步驟1)病毒RNA的提取採集樣品，常規方法提取RNA；2)多重不對稱RT-PCR擴增以步驟1)中提取的RNA為模板進行多重不對稱RT-PCR擴增，其中使用本發明所述的引物系統，PCR擴增的反應條件為50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20個循環；然後94℃20s，70℃90s，共20個循環；最後72℃延伸10min；擴增產物可用於通過核酸雜交所進行的禽流病毒的檢測和分型。
另一方面，本發明提供了使用本發明所述引物系統對禽流感病毒進行檢測和分型的方法，該方法包括下列步驟1)病毒RNA的提取採集樣品，常規方法提取RNA；2)多重不對稱RT-PCR擴增以步驟1)中提取的RNA為模板進行多重不對稱RT-PCR擴增，其中使用權利要求3所述的引物系統，擴增的反應條件為50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20個循環；然後94℃20s，70℃90s，共20個循環；最後72℃延伸10min；3)雜交與洗滌加入步驟2)得到的多重不對稱擴增產物與基因晶片，在適於與所選基因晶片進行雜交的條件下反應足夠的時間，然後洗滌後甩幹；4)結果判定將晶片插入晶片掃描儀中進行掃描分析，保存結果，然後根據出現陽性結果的微矩陣排列位置，查找該微矩陣排列位置點樣時所對應的禽流感病毒亞型。
在本發明的一個具體實施方案中，所述檢測和分型的方法包括下列步驟(1)採集樣品和核酸的提取按常規方法提取RNA。
(2)多重不對稱RT-PCR以提取的RNA為模板進行多重不對稱RT-PCR。反應體系在0.2mL反應管中依次加入10μL QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，上、下遊通用引物分別為0.5μL和5μL(10μM)，上、下遊特異性引物分別為0.5μL和1μL(10μM)，RNA模板5μL，補RNas-freewater至50μL。將樣品管放入MJ RESEARCH PTC-200PCR儀後，設置如下條件進行反應50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20個循環；然後94℃20s，70℃90s，共20個循環；最後72℃延伸10min。
(3)基因晶片的雜交試驗與洗滌取多重不對稱RT-PCR擴增產物5.2μL，加雜交緩衝液6μL，質控探針0.8μL混勻，95℃變性5min，立即冰浴3min，4000rpm離心5～10s，將離心管放回冰浴；在雜交盒(HybriCassettesTM，北京博奧生物晶片有限責任公司)的溝槽中加入200μL蒸餾水以防雜交體系蒸發，將晶片正面向上放入盒中。用移液器吹打均勻後取樣品雜交液7μL於晶片點樣區，迅速蓋上蓋片和雜交盒並密封，水平放到52℃水浴中雜交2.5hr。雜交完畢，將雜交盒水平拿出，立即將晶片取出，放入預熱至45℃的洗滌液I(2×SSC，0.1％SDS)中，100rpm洗滌5min。取出晶片放入45℃的洗滌液I中再洗一次。取出晶片，放入預熱至45℃的洗滌液II(0.2×SSC，0.1％SDS)，100rpm洗滌5min，洗滌兩次。取出晶片，放入洗液III(0.2×SSC)，100rpm室溫洗滌5min。將晶片在無水乙醇中浸提幾次，然後把晶片放入晶片盒中，1000r/min離心5min甩幹。
(4)基因晶片的掃描將晶片插入PerkinElmer ScanArray Gx plus掃描儀中進行掃描分析，保存結果。
(5)晶片掃描結果的判讀根據禽流感基因晶片的微矩陣排列進行判讀。


圖1圖示的是用所設計的引物進行的多重RT-PCR瓊脂糖核酸電泳結果，其中M為DL 2000DNA Marker。圖1A為第一組結果(泳道1、2、3、4、5、6和7分別為H1N1、H3N2、H5N1、H6、H7N1、H9N2和陰性對照)；圖1B為第二組結果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分別為H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15、H16和陰性對照)；圖1C為第三組結果(泳道1、2、3、4、5、6分別為H14、N4、N6、N7、N9和陰性對照)；圖1D為第四組結果(泳道1、2、3、4、5分別為H12、N3、N5、N8和陰性對照)。
圖2圖示的是多重RT-PCR特異性試驗核酸電泳結果，其中M為DL 2000DNA Marker。圖2A為第一組試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9和10分別為雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性鼻炎、H7N1和H5N1混合RNA、H3N2和H9N2混合RNA、H1N1RNA、陰性對照)。圖2B為第二組試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分別為雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性鼻炎、H8、H15和陰性對照)；圖2C為第三組多特異性試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分別為雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性鼻炎、N4、N9和陰性對照)；圖2D為第四組試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分別為雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性鼻炎、N3、N5和陰性對照)。
圖3圖示的是用所設計的引物進行的多重不對稱RT-PCR瓊脂糖核酸電泳結果，其中M為DL 2000 DNA Marker。圖3A為第一組試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6和7分別為H1N1、H3N2、H5N1、H6、H7N1、H9N2和陰性對照)；圖3B為第二組試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8分別為H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15、H16和陰性對照)；圖3C為第三組試驗結果(泳道1、2、3、4、5、6分別為H14、N4、N6、N7、N9和陰性對照)；圖3D為第四組試驗結果(泳道1、2、3、4、5分別為H12、N3、N5、N8和陰性對照)。
圖4圖示的是晶片表面的探針微矩陣排列分布圖。QC質控探針 PC陽性探針 NC陰性參照 DP(H1-16，N1-9)檢測探針圖5圖示的是應用所涉及探針和引物進行基因晶片研究的基因晶片掃描結果圖5-1為陰性對照；圖5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-21、5-22、5-23、5-24、5-25、5-26、5-27和5-28分別為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、8個常見亞型AIV和25個亞型AIV的雜交掃描結果。
本發明的優點1.本發明的試劑及檢測方法充分利用了PCR技術的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和螢光檢測技術的敏感性，對不同型禽流感進行快速、敏感、準確的檢測。利用本發明所述引物系統和檢測及分型方法，能同時準確、快速的鑑定出禽流感病毒株的各種神經氨酸酶亞型(N1～9)，還能區分感染人的H3N2、H2N2、H1N1、和H1N2等亞型。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。本領域技術人員應理解，這些實施例僅用於說明本發明而絕不對本發明的範圍構成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常採用常規條件例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的方法。
實施例實施例1引物的設計和合成根據Genebank中發表的不同亞型禽流感病毒的基因組序列，利用DNAStar/Bioedit軟體對其進行序列分析，採用Primer5.0、OMIGA和Beacon Designer 2.1軟體設計25對引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列如表1所示。
表1.多重PCR/RT-PCR的引物


注Y＝(C，T)，W＝(A，T)。
實施例2可獲得標準毒株的禽流感病毒亞型的RT-PCR擴增本實施例中，對於能夠獲得標準毒株的8個禽流感病毒亞型(H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2)，通過從標準毒株提取RNA，然後以此為模板直接進行常規RT-PCR擴增。
2.1模板RNA的提取按QIAamp Viral RNA Mini Kit(購自QIAGEN公司)說明書提供的方法，從禽流感病毒標準株中提取禽流感病毒基因組RNA。
2.2RT-PCR反應體系參照一步法RT-PCR試劑盒(購自QIAGEN公司)操作說明，稍加修改進行。反應體系在0.2mL反應管中依次加入QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)10μL，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，上、下遊引物各0.5μL(10μM)，RNA模板5μL，補RNas-free water至50μL。其中所使用的上下遊引物為選自針對H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2其中之一亞型的引物對。反應條件為50℃30min，95℃15min，然後94℃30s，52℃40s，72℃1min，共40個循環，最後72℃延伸10min。反應結束後取5μL產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳-溴化乙錠染色分析。
電泳結果表明擴增得到了預期大小的目的DNA片段。對回收產物進行測序鑑定，測序鑑定表明所設計引物特異敏感，然後把上述擴增產物連於T載體克隆保存以備後用。
實施例3無法獲得標準毒株的禽流感病毒基因亞型相應基因片段的人工合成本實施例中，對於其餘17個不能獲得標準毒株的亞型(包括H2、H4、H8、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，則通過搭橋PCR擴增合成得到相應的目的DNA片段。
本實施例中合成了上述所有17個基因型的目的DNA片段，在此僅以H15為例詳細記述合成過程，其餘16個基因型目的DNA片段的合成過程，除分別選用相應的不同引物對外，其他步驟都相同。
3.1引物設計利用DNAStar和Bioedit軟體分別對已發表的所有H15型AIV的全基因序列分析，採用Primer5.0和OMIGA軟體設計五條上遊引物H15-F、H15-F1、H15-F2、H15-F3、H15-F4，五條下遊引物H15-R、H15-R1、H15-R2、H15-R3、H15-R4。H15-F和H15-R按常規的引物合成原則進行設計和合成。而其它引物的設計和合成則需滿足搭橋PCR的要求，其長度為59bp，其中H15-F1/H15-R1、H15-R1/H15-F2、H15-F2/H15-R2、H15-R2/H15-F3、H15-F3/H15-R3、H15-R3/H15-F4、H15-F4/H15-R4之間各有平均20bp的互補鹼基，引物序列見表4。
表2.搭橋PCR合成H15亞型目的片段所用引物


3.2DNA片段延伸首先由H15-F1/H15-R1、H15-F2/H15-R2、H15-F3/H15-R3、H15-F4/H15-R4四對引物進行DNA鏈延伸反應，得到四個短片段；將前兩個短片段進行DNA鏈延伸、後兩個短片段DNA鏈延伸，可得到兩個中等長度片段；接著將這兩個中等長度片段進行DNA鏈延伸，得到預期大小的DNA片段即為所要的目的基因。
3.2.1短片段DNA鏈延伸的反應體系和條件10×buffer 5μL，dNTP 4μL，H15-F1/H15-R1(H15-F2/H15-R2、H15-R2/H15-F3、H15-F3/H15-R3、H15-F4/H15-R4)上下遊引物各1μL，AccuPoLTMDNA Polymerase 1μL，補滅菌無離子水至50μL。反應條件為94℃30s，72℃15min。
3.2.2中等長度片段DNA鏈延伸的反應體系和條件10×buffer 1μL，dNTP 4μL，AccuPoLTMDNA Polymerase 1μL，兩個短DNA片段產物(由3.2.1產生)各22μL，總體系為50μL。反應條件為94℃30s，72℃15min。
3.3目的DNA片段的合成和鑑定以3.2.2中鏈延伸反應獲得的DNA片段為模板，H15-F/H15-R為引物進行PCR反應，反應體系10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上下遊引物各1μL，AccuPoLTMDNA Polymerase 1μL，模板2μL，補滅菌無離子水至50μL。反應條件94℃5min；94℃30s，52℃40s，72℃1min，共40個循環；72℃，10min。
經過電泳和測序鑑定結果表明，擴增獲得了預期的300bp的目的DNA片段。證明本發明設計合成的引物特異敏感。將目的DNA片段連接於T載體克隆保存以備後用。
實施例4多重RT-PCR擴增將禽流感病毒25個亞型分為四組。第一組為已獲得禽流感病毒標準毒株的亞型組。第二、三、四組為禽流感病毒其餘17亞型的隨機分組，具體為第一組H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2；第二組為H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15、H16；第三組為H14、N4、N6、N7、N9；第四組為H12、N3、N5、N8。
4.1多重RT-PCR反應體系參照一步法RT-PCR試劑盒操作說明，稍加修改進行。反應體系在0.2mL反應管中依次加入10μL QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，上、下遊特異性引物各0.5μL(10μM)，RNA模板5μL，補RNas-free water至50μL。
4.2多重RT-PCR反應條件將樣品管放入MJ RESEARCH PTC-200PCR儀後，設置如下條件進行反應50℃預變性30min；95℃，15min；94℃，30s，52℃，40s，72℃，1min，40個循環；72℃，10min。反應結束後，取5μl擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。
實施例5多重不對稱RT-PCR擴增
5.1多重不對稱PCR/RT-PCR的引物的設計和合成在表1中引物序列的5』端加上相應通用引物序列(即特異性上遊引物加通用上遊引物，特異性下遊引物加通用下遊引物)，並在下遊引物的5』端進行螢光修飾，得到不對稱擴增引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表3。
表3不對稱多重PCR/RT-PCR的引物


其中TAMRA為螢光染料。
參照一步法RT-PCR試劑盒操作說明，進行修改。反應體系在0.2mL反應管中依次加入10μL QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，表3中的上、下遊通用引物分別為0.5μL和5μL(10μM)，上、下遊特異性引物(表3中的引物)分別為0.5μL和1μL(10μM)，RNA模板5μL，補RNas-free water至50μL。
將樣品管放入MJ RESEARCH PTC-200 PCR儀後，設置如下條件進行反應50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20個循環；然後94℃20s，70℃90s，共20個循環；最後72℃延伸10min。反應結束後取5μL產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳-溴化乙錠染色分析。
實施例6基因晶片的製備6.1探針的設計與合成根據Genebank中發表的不同亞型禽流感病毒的基因組序列，利用Bioedit、Primer5.0和OMIGA軟體分別對已發表的所有型AIV的全基因序列進行分析篩選，設計了進行禽流感基因晶片分型技術的52條特異性探針和3條質控探針，由上海生工生物工程有限公司合成，見表4。
表4禽流感基因晶片探針


6.2基因晶片的製備晶片設計的微矩陣為14×9陣列(見圖4)，矩陣設計圖包括4個部分QC為點樣陽性參照，8個重複位點；NC為陰性參照，10個重複位點；PC為雜交陽性參照，2個重複位點；其它位點為檢測探針，25個亞型52條特異性探針，每條探針2個重複位點。委託北京華大基因研究中心點樣。晶片使用的固相載體為醛基玻片(購自CELAssociates，Inc.Pearland，Texas)。
實施例7利用基因晶片的雜交試驗(1)雜交緩衝液(提前配製)ddH2O 0.84μL，20×SSC 1.80μL，50×Denhardt’s 1.80μL，50％硫酸葡聚糖3.60μL，4％SDS 1.80μL。
(2)雜交反應體系雜交緩衝液6μL，多重不對稱擴增產物5.2μL，質控探針0.8μL混勻。
(3)將(2)中的雜交反應體系95℃變性5min，立即冰浴3min，立即冰浴3min，4000rpm離心5～10s，將離心管放回冰浴。
(4)在雜交盒(HybriCassettesTM，北京博奧生物晶片有限責任公司)的溝槽中加入200μL蒸餾水以防雜交體系蒸發，將晶片正面向上放入盒中。
(5)用移液器吹打均勻後取取樣品雜交液7μL於晶片點樣區，迅速蓋上蓋片和雜交盒並密封，水平放到52℃水浴中雜交2.5hr。
(6)雜交完畢，將雜交盒水平拿出，立即將晶片取出，放入預熱至45℃的洗滌液I(2×SSC，0.1％SDS)中，100rpm洗滌5min。取出晶片放入45℃的洗滌液I中再洗一次。
(7)取出晶片，放入預熱至45℃的洗滌液II(0.2×SSC，0.1％SDS)，100rpm洗滌5min，洗滌兩次。
(8)取出晶片，放入洗液III(0.2×SSC)，100rpm室溫洗滌5min。
(9)將晶片在無水乙醇中浸提幾次，然後把晶片放入晶片盒中，1000r/min離心5min甩幹，用PerkinElmer ScanArray Gx plus進行晶片掃描。
實施例8基因晶片檢測有效性試驗將禽流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H6N2、H7N1和H9N2型多重不對稱RT-PCR擴增產物等比例混合後與晶片雜交，又將全部亞型的擴增產物等比例混合與晶片雜交，結果表明在所有對應的檢測位點都能檢測到陽性雜交信號(如

5-27、5-28所示)。
實施例9基因晶片檢測敏感性試驗通過噬斑形成試驗對禽流感病毒(H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2)尿囊液進行病毒定量，用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，並對其進行10倍遞進稀釋，進行多重不對稱RT-PCR(見實施例5)，然後按照實施例6進行基因晶片的雜交與洗滌(每型AIV作3個晶片微矩陣的重複試驗)，最後將晶片1000r/min離心5min甩幹，用PerkinElmer ScanArrayGx plus進行晶片掃描和結果判讀。
敏感性試驗結果以H5N1為例，噬斑總數為2.47×107pfu/mL，其敏感度可達247pfu/mL。
實施例10基因晶片檢測特異性試驗按常規方法分別提取各亞型AIV、傳染性支氣管炎病毒(IBV)AV10、禽呼腸孤病毒(ARV)AV2311 CEK3、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)等常見病毒核酸，進行基因晶片檢測。
每個樣品重複3次，結果相一致。除各亞型AIV檢測結果在相應位點出現陽性雜交信號外，其他病毒的檢測結果均為陰性傳染性支氣管炎病毒(IBV)AV10、禽呼腸孤病毒(ARV)AV2311 CEK3、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)基因晶片檢測結果均為陰性，除QC和PC陽性參照螢光信號外其它位點均無檢測信號(結果如

5-1所示)；而每個亞型AIV的檢測結果只在各自相應的位點出現陽性信號(結果如

5-2～5-26所示)。
實施例11基因晶片檢測初步應用試驗對395份口岸檢樣(4省20多個地區)，分別採用基因晶片和經典病原分離兩種檢測方法進行了平行檢測。兩種方法檢測結果完全一致，表明所建立基因晶片檢測技術具有良好的可靠性與實用性。
序列表110中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所120用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統和方法130
16052170PatentIn version 3.1210121119212DNA213人工序列220
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40048ggtttcggat gttacagcgt ccggaatagc ctgaccaatt 402104921139212DNA213人工序列220
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40049tcacttgctt ccgttgaggg ggcamtgatg tatggatgg392105021140212DNA213人工序列220
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40050ggtttcggat gttacagcgt aagaatagct ccatcgtgcc 402105121139212DNA213人工序列220
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40051tcacttgctt ccgttgaggt tctatgctct cagccaagg392105221140212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(40)
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40052ggtttcggat gttacagcgt tggcatacgc attcagattc 40
權利要求
1.一種用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統，其中包括25對多重不對稱RT-PCR引物和1對通用引物，其中所述多重不對稱RT-PCR引物其中每一對各針對禽流感病毒的一種亞型，所述引物所對應的型別及其核苷酸序列分別為
其中TAMRA為螢光染料。
2.一種不對稱擴增禽流感病毒RNA的方法，該方法包括下列步驟1)病毒RNA的提取採集樣品，常規方法提取RNA；2)多重不對稱RT-PCR擴增以步驟1)中提取的RNA為模板進行多重不對稱RT-PCR擴增，其中使用權利要求3所述的引物系統，擴增的反應條件為50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20個循環；然後94℃20s，70℃90s，共20個循環；最後72℃延伸10min；擴增產物可用於通過核酸雜交所進行的禽流病毒的檢測和分型。
3.一種用於禽流感病毒檢測和分型的方法，該方法包括下列步驟1)病毒RNA的提取採集樣品，常規方法提取RNA；2)多重不對稱RT-PCR擴增以步驟1)中提取的RNA為模板進行多重不對稱RT-PCR擴增，其中使用權利要求3所述的引物系統，擴增的反應條件為50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20個循環；然後94℃20s，70℃90s，共20個循環；最後72℃延伸10min；3)雜交與洗滌加入步驟2)得到的多重不對稱擴增產物與基因晶片，在適於與所選基因晶片進行雜交的條件下反應足夠的時間，然後洗滌後甩幹；4)結果判定將晶片插入晶片掃描儀中進行掃描分析，保存結果，然後根據出現陽性結果的微矩陣排列位置，查找該微矩陣排列位置點樣時所對應的禽流感病毒亞型。
全文摘要
本發明提供了用於禽流感病毒檢測和分型的引物系統和不對稱擴增禽流感病毒RNA的方法。本發明採用根據Genebank中已發表的禽流感病毒所有亞型的基因組序列設計篩選出了25對多重不對稱RT－PCR引物、1對通用引物，以及52條特異性探針和3條質控探針，所述25對多重不對稱RT－PCR引物其中的每一對各針對禽流感病毒的一種亞型，由所述25對多重不對稱RT－PCR引物和1對通用引物組成的引物系統可用於禽流感的檢測和分型。進一步，使用所述引物系統建立了不對稱擴增禽流感病毒RNA的方法和檢測和分型禽流感病毒的方法。通過有效性試驗、特異性試驗、敏感性試驗檢測，證明本發明建立的方法特異性強、敏感性高，並進行了初步應用。
文檔編號C12N15/11GK101058833SQ20071000345
公開日2007年10月24日 申請日期2007年2月8日 優先權日2007年2月8日
發明者韓雪清, 林祥梅, 吳紹強, 梅琳, 朱忠武, 廉慧峰, 賈廣樂 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所