鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體快繁技術的製作方法
2023-06-11 18:33:36
專利名稱：鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體快繁技術的製作方法
技術領域：
本發明為生物科技領域的快繁技術，涉及名貴藥材鐵皮石斛在非無菌條件下快速繁殖的方法。
背景技術：
石斛是我國常用中藥，我國藥典2010年版一部已把鐵皮石斛單列為一個品種收藏，因此呈現出其功效或價值比一般石斛更珍貴的獨特療效，鐵皮石斛DendrobiumOfficinale Kimura Et Migo具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳等功效,常用於熱病傷津，口乾煩渴、病後虛熱等多種病症。因森林生態破壞與資源過度開採，野生資源頻臨枯竭，1987年國務院將其列為國家重點保護植物。 為了實現鐵皮石斛資源的可持續發展，科研人員自20世紀70年代開始了人工栽培技術的研究工作，直到新世紀，新種子生產、組織培養和設施栽培等人工繁育關鍵技術才得以突破，並迅速推廣應用。現有的鐵皮石斛組培技術。從種子的萌發、原球莖及種苗的誘導，種子的生根、再到種苗的增殖及壯苗培養，其時間周期要9-12個月，其整個周期長，耗能大，人工成本高。本發明使用的培養快繁技術，包括開始的種子無菌萌發，原球莖及種子的誘導和培養，直到小苗形成後，開始在非無菌條件下繼代快繁，具有出苗時間快，節約能源和成本，所培育出的壯苗葉大莖粗的優質苗，本發明在近自然的條件下進行可明顯提高其成活率。
發明內容
本發明的目的是提供一種鐵皮石斛在非無菌條件下的繁殖技術，該方法成本低，操作簡便，節省能源和人力成本，較好的解決了目前存在鐵皮石斛組織培養過程成本高，組培周期長的問題。為了實現上述目的，本發明提供了以下技術方案I、種子的無菌萌發採摘鐵皮石斛的果實進行表面消毒處理，將種子播種常規石斛無菌萌發培養基上誘導種子無菌萌發2、原球莖及其種苗的誘導和培養播種後的培養瓶置於原球莖及種幼苗誘導條件下培養，培養條件為溫度10-30°C，光照為自然光或日光燈500-1500LUX，種子萌發形成原球莖和種苗3、也可將無菌苗繼續生根根據需要將上述條件下培養的種苗轉移到誘導生根的條件下培養以獲得大量形狀優良的無菌苗，誘導生根的培養條件為自然光、日光燈、led燈沒日光照12-14小時,光照強度為300-4000LUX，培養溫度為20-35°C鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體繁殖無根或有根的無菌苗洗去培養基晾乾待用
將松樹皮自然曬乾後打成粗粉(20目)備用可用1/2MS、MS、N6、CHB、B5等培養基，他們中的成分除不加蔗糖、瓊脂、維生素，其他的無機物和有機物均要激素同時加在培養基液體中，包括NAA及6BA，NAA的濃度為O. lmg/L-2mg/L, 6BA0. 2mg/L_2mg/L0配置培養基其固體基質如松樹皮粗粉加培養基液體如1/2MS(含激素)的比例為I : 2-5，以混勻後手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，一般以I :2. 5-3. 5為好，配置好的培養基 備用。裝並或託盤並子或託盤適當用消毒劑如1/2000高錳酸鉀溶液或1/1000的新潔而滅，擦洗消毒完後可裝入備用的培養基。實施環境是在密閉的容器(包括各種大小的容器、框架)或房間等，在生產中應用大型容器或房間為宜非無菌條件的快速繁殖將無菌條件下的培養成的幼苗(有2張葉以上)，用常水小心洗去培養基後，晾乾即可種入已裝有培養基的容器內，並將上述種好苗的容器(並子或託盤)，放置在密封的環境中，並開始通入二氧化碳氣體，二氧化碳的濃度為O. 1% -20%，其中以O. 5% -5%為好，光照開始5天為3000Lux，5-10天為5000Lux，10天後8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h-14h，密封環境內的溫度20°C -36°C，相對溼度60% -90 %，在上述條件下培養50-80天，待苗有5片以上，莖有以上粗即為大苗。培養出的大苗的馴化將在C02培養器(室)形成上述大苗取出後放置在有遮陰和自然溫度條件下，放置10-15天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。
具體實施例方式實施例I下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容。但本發明的內容並不僅僅局限於此。自廣西桂平採集的鐵皮石斛蒴果表面消毒，獲得無菌種子，種子播種在無菌萌發固體培養基上面，培養基組成為1/2MS，添加蔗糖2%，馬鈴薯提取物20%，煮20分鐘後攪成乳狀加入培養基中，激素O. 5mg/L，瓊脂為0.5%，PH值6. 2。培養瓶置於溫度為20-25°C，光照為自然光或日光燈1500LUX，培養2個月。將萌發的原球莖進行誘導和繁殖誘導和繁殖的方法為1/2MS，15%馬鈴薯，3%的蔗糖，煮沸半小時，攪成乳狀加入培養基中，另加NAAO. 5mg/L, 6BA0. 5mg/L,活性炭O. 2 %，瓊脂O. 6 %，在上述培養基中培養
一個月。
將上述繁殖的無菌幼苗可移植進行生根培養，培養基為1/2MS，香蕉提取物10%，蔗糖2%，瓊脂為0.5%，NAAO. 5mg/L，活性炭2g/L，PH5. 8，常規高壓滅菌，培養條件溫度20-32°C，光照度2500-3500Lux。培養時間一個月非無菌條件下快速繁殖，將無菌條件下培養的幼苗(2張葉以上)，包括生根或不生根的均可，用糖水洗去培養基後，即可種入無糖的培養基託盤中，無糖培養基的配方為松樹皮粗粉加1/2MS培養基，含激素，固體更液體的比例為I : 2. 5，以混勻後手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，裝入託盤，託盤預先用消毒劑抹洗乾淨，然後放入密閉的容器內，然後通入二氧化碳，二氧化碳濃度為I % -5 %，光照開始5天為3000LUX，5-10天為5000Lux, 10天後8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h_14h，密封環境內的溫度20°C -36°C，相對溼度60% -90%,在上述條件下培養50-80天，待苗有5片以上，莖有3mm-5mm以上粗即為大苗。將在C02培養器(室)形成上述大苗取出後放置在有遮陰和自然溫度條件下，放 置10-15天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。實施例2浙江樂親採集的鐵皮石斛蒴果表面消毒，獲得無菌種子，種子播種在無菌萌發固體培養基上面，培養基組成為1/2MS，添加蔗糖2 %，馬鈴薯提取物20 %，煮20分鐘後攪成乳狀加入培養基中，激素O. 5mg/L，瓊脂為O. 5%，PH值6. 2。培養瓶置於溫度為20_25°C，光照為自然光或日光燈1500LUX，培養2個月。將萌發的原球莖進行誘導和繁殖誘導和繁殖的方法為1/2MS，15%馬鈴薯，3%的蔗糖，煮沸半小時，攪成乳狀加入培養基中，另加NAAO. lmg/L,6BAl. Omg/L，活性炭O. 2%，瓊脂O. 6%，在上述培養基中培養
一個月。將上述繁殖的無菌幼苗可移植進行生根培養，培養基為MS，香蕉提取物15%，蔗糖3%，瓊脂為0.5%，NAAO. 5mg/L，活性炭2g/L，PH5. 8，常規高壓滅菌，培養條件溫度20-32°C，光照度2500-3500Lux。培養時間一個月非無菌條件下快速繁殖，將無菌條件下培養的幼苗(2張葉以上)，包括生根或不生根的均可，用常水洗去培養基後，即可種入無糖的培養基託盤中，無糖培養基的配方為松樹皮粗粉加MS培養基，含激素O. 5mg/L,固體與液體的比例為I : 2. 5，以混勻後手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，裝入託盤，託盤預先用消毒劑抹洗乾淨，然後放入密閉的容器內，然後通入二氧化碳，二氧化碳濃度為2% -10%，光照開始5天為3000LuX，5-10天為5000Lux，10天後8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h_14h，密封環境內的溫度20V -30V，相對溼度80% -90%,在上述條件下培養60-90天，待苗有5片葉以上，莖有3mm-5mm以上粗即為大苗。將在C02培養器(室)形成上述大苗取出後放置在有遮陰和自然溫度條件下，放置5-10天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。
權利要求
1.一種鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體繁殖技術，前期的種子無菌萌發、圓球莖的繁殖及種苗的誘導和培養直到長成幼苗均為常規的有糖無菌培養，當鐵皮石斛幼苗有2張葉以上時即可進行非無菌條件下的無糖微體繁殖階段。
(1)其實施環境 是在密閉的容器(包括各種大小的容器、框架)或房間等，在生產中應用大型容器或房間為宜。
(2)培養基質 採用松樹皮，經過天然陽光下曬乾，機械打碎成20目粗粉備用，亦可適當添加無機或有機的其他基質，如蛭石、珍珠巖、沙子、塑料泡沫、石棉、纖維素物質，一般添加的比例為0% -50%，還可適當加入活性炭和泥炭。
(3)培養基液體 可用1/2MS、MS、N6、CHB、B5等均可，他們中的成分除不加蔗糖、瓊脂、維生素，其他的無機物和有機物均要。
(4)激素 同時加在培養基液體中，包括NAA及6BA，NAA的濃度為O. lmg/L-2mg/L,6BA0. 2mg/L_2mg/L0 (5)配置培養基 其固體基質如松樹皮粗粉加培養基液體如1/2MS(含激素)的比例為I :2-5，以混勻後手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，一般以I :2. 5-3. 5為好，配置好的培養基備用。
(6)裝並或託盤 並子或託盤適當用消毒劑如1/2000高錳酸鉀溶液或1/1000的新潔而滅，擦洗消毒完後可裝入備用的培養基。
(7)非無菌條件的快速繁殖 將無菌條件下的培養成的幼苗(有2張葉以上)，用常水小心洗去培養基後，晾乾即可種入已裝有培養基的容器內，並將上述種好苗的容器(並子或託盤)，放置在密封的環境中，並開始通入二氧化碳氣體，二氧化碳的濃度為O. 1% -20%，其中以O. 5% -5%為好，光照開始5天為3000Lux，5-10天為5000Lux，10天後8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h-14h，密封環境內的溫度20°C -36°C，相對溼度60% -90%，在上述條件下培養50-80天，待苗有5片以上，莖有以上粗即為大苗。
2.根據權利要求I所述方法，其特徵是培養出的大苗的馴化方法為 將在C02培養器(室)形成上述大苗取出後放置在有遮陰和自然溫度條件下，放置10-15天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。
全文摘要
本發明為生物科技領域新的快繁技術，涉及鐵皮石斛在非無菌條件下的快速繁殖的方法，其主要步序是通過鐵皮石斛種子的無菌萌發、原球莖及幼苗的形成後，即可開始在非無菌下繼代快繁，用松樹皮粗粉加入1/2MS培養基為基質，不含糖及瓊脂，種植鐵皮石斛幼苗後放入密閉容器，並通二氧化碳，接近自然條件自養生長，相對在較短時間內促進幼苗的生根、增長和壯苗，其特點為縮短培苗的時間，在繼代培養時不用高壓滅菌，在常態下即可進行苗的繁殖生長，且不易汙染，培植出的苗葉大莖粗為優質苗。與常規鐵皮石斛的組培相比，有節省能源消耗和減少人工成本的優點，具有快、省、好三大優點的好方法。
文檔編號A01H4/00GK102835318SQ20121037426
公開日2012年12月26日 申請日期2012年10月8日 優先權日2012年10月8日
發明者荊樹漢 申請人:荊樹漢