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高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法

2023-06-11 14:26:31 2

專利名稱:高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法
技術領域:
本發明屬於天然植物提取製備領域,涉及一種從天然植物女貞子中用高速逆流色 譜分離製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法。
背景技術:
女貞子為木犀科(Oleaceae)植物女貞Ligustrum lucidum Ait乾燥成熟果實,是 我國傳統的扶正固本藥物。具有有養陰氣、平肝火、健腰膝、壯筋骨、滋補肝腎、烏鬚髮等功 效。近年來多用於治療慢性氣管炎、肝炎、高血脂症、糖尿病、更年期症候群、不孕症、動脈粥 樣硬化等。所含化學成分主要有有機酸、苷、萜類、留類、糖類、胺基酸及微量元素、揮髮油。 齊墩果酸為其主要五環三萜成分,特女貞苷和女貞苦苷是其水溶性裂環環烯醚萜苷成分。 結構如下
齊墩果酸現代藥理研究表明,女貞子具有強心、激素雙向調節、降血糖降血脂、調節機體免 疫功能、抗炎抗菌、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、能對化療或放療所致白細胞減少由升高白細 胞的作用。特女貞苷具有協同增加亞適量的ConA刺激淋巴細胞轉化的作用,並在一定程度 上有拮抗Dex的抑制作用。齊墩果酸具有護肝降酶、抗血小板聚集、降血脂、對免疫系統及 對II、III、IV型變態反應具有明顯抑制作用。為了對女貞子三萜及裂環環烯醚萜苷成分進 行更深入的藥理活性與作用機制等研究,同時需要三萜及裂環環烯醚萜等指標性成分對女 貞類藥材和相關中藥製劑進行質量控制,需要大量單體化合物。因此,提供一種快速、高效 的從女貞中分離純化特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸方法,對開發具有特殊療效的現代中 藥製劑和充分利用我國藥材資源等具有重要意義。採用普通色譜柱法、重結晶等傳統的分離方法分離植物中的有效單體,不僅費時 費力、汙染環境,且所用固定相對樣品有不可逆性吸附作用,這就需要一種新型的分離技術 來解決上述問題。高速逆流色譜(HSCCC)是近年來發展起來的一種連續的無需固體支撐物 的高效、快速的液液分配色譜分離技術,具有分離量大、樣品無損失、回收率高、分離環境緩 和、節約溶劑等特點,已廣泛應用於生物、醫藥、環保等領域化學物質的製備分離和純化。

發明內容
本發明的目的是提供高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法,以克服現有技術中存在的上述問題。本發明通過以下技術方案實現高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法,其包括以下步驟由粗提物的製備和粗提物的分離純化兩部分組成,其特徵在於粗提物的分離純化 應用高速逆流色譜,其基本工藝路線是 (1)將女貞子藥材粉碎,沸水水浴加熱提取,提取液趁熱過濾,冷卻,得到水取物和 殘留物;(2)特女貞苷、女貞苦苷的富集將水提物加入大孔吸附樹脂吸附,10-50%乙醇 梯度洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,得到特女貞苷、女貞苦苷混合粗提物;(3)齊墩果酸的提取將水提殘留物加入沸乙醇中回流提取1-1. 5小時,提取1-3 次,過濾得提取液,再加入活性炭回流脫色,過濾,濃縮脫色液得齊墩果酸流浸膏;(4)特女貞苷、女貞苦苷的純化將粗提物用高速逆流色譜分離法製得高純度特 女貞苷和女貞苦苷的純品。(5)齊墩果酸的純化將上述齊墩果酸流浸膏用高速逆流色譜分離法製得高純度 齊墩果酸純品。步驟(1)中所述的水提液料比為1 8_10(kg/L),提取時間為1. 5-2小時。步驟(2)中所述大孔吸附樹脂可選非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂,如 DlOU AB-8、DM301、HPD100 等大孔吸附樹脂。步驟(2)中所述洗脫條件為先用3-4倍柱體積10% -30%乙醇洗脫,再用4_5倍 柱體積35% -50%乙醇洗脫。步驟(3)中所述沸乙醇濃度為70% _95%,用量為殘留物質量的10_20倍;所述活 性炭用量為0.5% _1%,脫色0. 5-1小時。步驟(4) (5)中所述高速逆流色譜法對粗提物進行純化,先配製構成固定相、流動 相的溶劑體系,使逆流色譜儀柱子中充滿固定相,然後使柱子轉動,再將流動相泵入柱內, 由進樣閥進入製備好的粗提物,兩相溶劑體系以上相為固定相,下相為流動相,根據檢測譜 圖接收目標成份。步驟(4)中所述高速逆流色譜法對特女貞苷、女貞苦苷進行純化,溶劑體系由四 個組分構成,A組分可選自氯仿、二氯甲烷等滷代烴,B、C組分可選自甲醇、乙醇、丙醇、丙 酮、正丁醇、異丁醇等脂肪醇或脂肪酮,D組分為水,優選氯仿-甲醇-正丁醇-水體系,A、 B、C、D 的體積比為 1-5 2-10 0.5-5 2-10。步驟(4)中所述高速逆流色譜法對特女貞苷、女貞苦苷進行純化,溶劑體系由三 個組分構成,A組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯類,B組分可選自甲 醇、乙醇、丙醇、丙酮、正丁醇、異丁醇等脂肪醇或脂肪酮,C組分為水,優選乙酸乙酯-正丁 醇-水體系,A、B、C的體積比為1-4 1-2 2-5。步驟(5)所述高速逆流色譜法對齊墩果酸進行純化,溶劑體系由四個組分構成,A 組分可選自乙醚、氯仿、丙酮、正己烷或庚烷,B組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯 等脂肪酯類,C組分可選自乙醇或甲醇,D組分為水,優選氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水體系, A、B、C、D 體積比為 1-10 1-20 1-10 I-IO0所述的主機轉速為500-1000r/min,所述的流動相的流速為1. 0-5ml/min。
綜上所述,本發明存在以下優點(1)本分離過程可連續進行,操作簡便,效率高;(2)採用高速逆流色譜法製備,不存在不可逆吸附,避免了樣品的損耗,具有分離 效果好,溶劑用量少,無汙染,高效、快速等特點。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明。實施例1 1.取500g女貞子藥材粉碎成粗粉投入提取罐中,加8倍量沸水水浴加熱提取2h, 提取3次,趁熱過濾,冷卻,得到水提物和殘留物。 2.將水提物上AB-8大孔樹脂柱飽和吸附lh,先用4倍柱體積20%乙醇洗脫,再用 4倍柱體積50%乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,乾燥得到特女貞苷和女貞苦苷混合 粗提物;將水提殘留物加入15倍量的95%沸乙醇回流提取lh,提取2次,趁熱過濾得提取 液,加入2. 5g活性炭加熱回流脫色0. 5h,趁熱過濾,減壓濃縮得齊墩果酸流浸膏。3.應用高速逆流色譜分離純化粗提物。A.採用氯仿甲醇正丁醇水(2 8 1 7)的溶劑系統,轉速為750r/min, 上相為固定相,下相為流動相,流速5ml/min。具體操作步驟是按上述體積比配製溶劑系統置於分液漏鬥中,搖勻後,靜置分 層,等平衡一段時間後,將上、下相分開。接著,先用上相作為固定相,充滿整個柱子,調整 主機正轉,將下相流動相從柱子的首端泵入柱內;待整個體系建立動態平衡後,由進樣閥進 樣;然後根據檢測器的譜圖收集目標成分。B.將A分離得到的部分應用高速逆流色譜儀再次分離純化。採用乙酸乙酯正丁醇水(2 1 3)的溶劑系統,轉速為750r/min,上相為固 定相,下相為流動相,流速5ml/min,具體操作同A,將目標成分分別用甲醇重結晶即得特女 貞苷和女貞苦苷。C.採用氯仿乙酸乙酯甲醇水(3 15 5 5)的溶劑系統,轉速為750r/ min,上相為固定相,下相為流動相,流速5ml/min,具體操作同A,將目標成分用無水乙醇重 結晶即得到齊墩果酸。按上述條件得到特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的純度用HPLC進行檢測,結果都 彡 96%。HPLC分析條件色譜柱C18,流動相為MeOH H2O (40 60);檢測波長224nm。實施例2 1.取200g女貞子藥材粉碎成粗粉投入提取罐中,加10倍量沸水水浴加熱提取 1. 5h,提取2次,趁熱過濾,冷卻,得到水提物和殘留物。2.將水提物上AB-8大孔樹脂柱飽和吸附1. 5h,先用3倍柱體積10%乙醇洗脫,再 用4倍柱體積45%乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,乾燥得到特女貞苷和女貞苦苷混 合粗提物;將水提殘留物加入13倍量的85%沸乙醇回流提取1. 5h,提取3次,趁熱過濾得 提取液,加入2. 5g活性炭加熱回流脫色lh,趁熱過濾,減壓濃縮得齊墩果酸流浸膏。3.應用高速逆流色譜分離純化粗提物。
A.採用氯仿甲醇正丁醇水(4 8 2 7)的溶劑系統,上相作為固定相, 下相為流動相,轉速為560r/min,流速2. 5ml/min。具體操作步驟基本同「實施例1」。B.將A分離得到的部分應用高速逆流色譜儀再次分離純化。採用乙酸乙酯正丁醇水(3 2 4)的溶劑系統,轉速為560r/min,上相為固 定相,下相為流動相,流速2. 5ml/min,具體操作步驟基本同「實施例1 」。採用氯仿乙酸乙酯甲醇水(2 17 3 6)的溶劑系統,上相作為固定相, 下相為流動相,轉速為560r/min,流速2. 5ml/min。具體操作步驟基本同「實施例1」。所得產品經液相色譜分析表明純度均> 97 %。實施例3 1.取IOOOg女貞子藥材粉碎成粗粉投入提取罐中,加9倍量沸水水浴加熱提取 2h,提取2次,趁熱過濾,冷卻,得到水提物和殘留物。 2.將水提物上DM301大孔樹脂柱飽和吸附2h,先用4倍柱體積10%乙醇洗脫,再 用5倍柱體積40%乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,乾燥得到特女貞苷和女貞苦苷混 合粗提物;將水提殘留物加入16倍量的80%沸乙醇回流提取3h,提取2次,趁熱過濾得提 取液,加入9g活性炭加熱回流脫色0. 5h,趁熱過濾,減壓濃縮得齊墩果酸流浸膏。3.應用高速逆流色譜分離純化粗提物。A.採用氯仿甲醇正丁醇水(5 3 0.5 8)的溶劑系統,上相作為固定 相,下相為流動相,轉速為lOOr/min,流速2.5ml/min。具體操作步驟基本同「實施例1」。B.將A分離得到的部分應用高速逆流色譜儀再次分離純化。採用乙酸乙酯正丁醇水(4 1.5 5)的溶劑系統,轉速為560r/min,上相為 固定相,下相為流動相,流速4ml/min,具體操作步驟基本同「實施例1 」。採用氯仿乙酸乙酯甲醇水(2 17 3 6)的溶劑系統,上相作為固定相, 下相為流動相,轉速為lOOOr/min,流速4ml/min。具體操作步驟基本同「實施例1」。所得產品經液相色譜分析表明純度均> 96. 5%。
權利要求
高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法,由粗提物的製備和粗提物的分離純化兩部分組成,其特徵在於粗提物的分離純化應用高速逆流色譜,其基本工藝路線是(1)將女貞子藥材粉碎,沸水水浴加熱提取,提取液趁熱過濾,冷卻,得到水提物和殘留物;(2)特女貞苷、女貞苦苷的富集將水提物加入大孔吸附樹脂吸附,10 50%乙醇梯度洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,得到特女貞苷、女貞苦苷混合粗提物;(3)齊墩果酸的提取將水提殘留物加入沸乙醇中回流提取1 1.5小時,提取1 3次,過濾得提取液,再加入活性炭回流脫色,過濾,濃縮脫色液得齊墩果酸流浸膏;(4)特女貞苷、女貞苦苷的純化將粗提物用高速逆流色譜分離法製得高純度特女貞苷和女貞苦苷的純品。(5)齊墩果酸的純化將上述齊墩果酸流浸膏用高速逆流色譜分離法製得高純度齊墩果酸純品。
2.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(1)中所述的水提液料比為1 8-10 (kg/L),提取時間為1.5-2小時。
3.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(2)中所述大孔吸附樹脂可選非極性、弱極性或中極性大孔吸附樹脂,如 D101、AB-8、DM301、HPD100 等大孔吸附樹脂。
4.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(2)中所述洗脫條件為先用3-4倍柱體積10% -30%乙醇洗脫,再用4-5 倍柱體積35% -50%乙醇洗脫。
5.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(3)中所述沸乙醇濃度為70% -95%,用量為殘留物質量的10-20倍;所 述活性炭用量為0. 5% -1%,脫色0. 5-1小時。
6.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(4) (5)中所述高速逆流色譜法對粗提物進行純化,先配製構成固定相、 流動相的溶劑體系,使逆流色譜儀柱子中充滿固定相,然後使柱子轉動,再將流動相泵入柱 內,由進樣閥進入製備好的粗提物,兩相溶劑體系以上相為固定相,下相為流動相,根據檢 測譜圖接收目標成份。
7.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(4)中所述高速逆流色譜法對特女貞苷、女貞苦苷進行純化,溶劑體系由 四個組分構成,A組分可選自氯仿、二氯甲烷等滷代烴,B、C組分可選自甲醇、乙醇、丙醇、丙 酮、正丁醇、異丁醇等脂肪醇或脂肪酮,D組分為水,優選氯仿-甲醇-正丁醇-水體系,A、 B、C、D 的體積比為 1-5 2-10 0.5-5 2-10。
8.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(4)中所述高速逆流色譜法對特女貞苷、女貞苦苷進行純化,溶劑體系由 三個組分構成,A組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯類,B組分可選自甲 醇、乙醇、丙醇、丙酮、正丁醇、異丁醇等脂肪醇或脂肪酮,C組分為水,優選乙酸乙酯-正丁 醇-水體系,A、B、C的體積比為1-4 1-2 2-5。
9.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於步驟(5)所述高速逆流色譜法對齊墩果酸進行純化,溶劑體系由四個組分構 成,A組分可選自乙醚、氯仿、丙酮、正己烷或庚烷,B組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸 異丙酯等脂肪酯類,C組分可選自乙醇或甲醇,D組分為水,優選氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水 體系,A、B、C、D 體積比為 1-10 1-20 1-10 I-IO0
10.根據權利要求1所述的高速逆流色譜製備特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法, 其特徵在於所述的主機轉速為500-1000r/min,所述的流動相的流速為1. 0-5ml/min。
全文摘要
本發明涉及的是一種應用高速逆流色譜法從天然植物女貞子中分離製備高純度特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸的方法,其特點是不存在不可逆吸附,避免了樣品的損耗,具有分離效果好,溶劑用量少,無汙染,高效、快速和大製備量分離的優點。該方法適用於以各種途徑獲得的各種含特女貞苷、女貞苦苷和齊墩果酸中的一種或幾種成分的天然產物、天然產物的提取物為原料製備高純度單體,簡便易行。
文檔編號C07H1/08GK101955504SQ201010182759
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者劉東鋒, 楊成東, 郭琴 申請人:南京澤朗醫藥科技有限公司

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