對於肺部病症的治療的製作方法

2023-09-23 00:09:05 2

專利名稱：對於肺部病症的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及肺部病症，如例如嬰兒的支氣管肺發育不良(BPD)和慢性缺氧誘發的 肺動脈高壓的治療。
背景技術：
支氣管肺發育不良(BPD)通常發生在嬰兒，尤其是早產兒身上，其特徵為氧氣和/ 或機械通氣對肺的急性損傷，這導致了對肺泡和血管發育的幹擾或抑制(Jobe等人(2001) Am J Respir Crit Care Med 163 :1723_1729)。在動物模型中，吸入的NO促進氣體交換和 肺結構發育，但是對面臨BPD風險的嬰兒使用這一療法是有爭議的(Ballard等人(2006)N Engl J Med355 :343_353)。患有慢性肺病和紫紺型先天性心臟病的嬰兒通常患有缺氧。由於慢性缺氧對存 在和發育中的肺動脈的作用，其導致肺循環功能和結構的進行性改變。Shimoda L等人， Physiol Res(2000)49 549-560 ；Subhedar,N. V. ,Acta Paediatr suppl(2004)444 :29_32。 最終，慢性缺氧導致嚴重的肺動脈高壓，其最終引發右側心力衰竭和死亡。因此，治療諸如BPD和慢性缺氧誘發的肺動脈高壓的肺部病症，尤其是在例如嬰 兒中的上述病症的方法代表了本領域中長期和持續的需求。發明概述本發明提供了治療個體的諸如支氣管肺發育不良(BPD)和慢性缺氧誘發的肺動 脈高壓的肺部病症的方法和組合物。在某些實施方案中，向患有BPD和/或相關併發症和/或面臨患有BPD和/或與 BPD有關的併發症的風險的個體給藥有效量的一氧化氮前體。在某些實施方案中，所述一氧 化氮前體包括瓜氨酸、在體內產生瓜氨酸的前體、其藥學可接受的鹽及其組合中的至少一 種。在某些實施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化氮前體口服給藥。在某些實施方案中，將諸 如瓜氨酸的一氧化氮前體靜脈內給藥。在某些實施方案中，向患有慢性缺氧誘發的肺動脈高壓和/或相關併發症和/或 面臨患有慢性缺氧誘發的肺動脈高壓和/或與慢性缺氧誘發的肺動脈高壓有關的併發症 的風險的個體給藥有效量的一氧化氮前體。在某些實施方案中，所述一氧化氮前體包括瓜 氨酸、在體內產生瓜氨酸的前體、其藥學可接受的鹽及其組合中的至少一種。在某些實施方 案中，將諸如瓜氨酸的一氧化氮前體口服給藥。在某些實施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化 氮前體靜脈內給藥。因此，本發明旨在提供對個體的肺部病症的治療。當與附圖和下文詳細描述的實施例相聯繫時，會隨著說明書的進行而清楚本發明 的上述目的、其它目的。
附圖簡述

圖1為尿素循環的示意圖。圖2為實施例中所採用的研究步驟的流程圖。圖3為表示在對照小豬(η = 6)、慢性缺氧小豬(η = 11)和用L-瓜氨酸治療的慢 性缺氧小豬(η = 6)中的平均肺動脈壓的測量結果的條形圖。所有值均為平均值士SEM。* 與對照不同；+與慢性缺氧不同；P < 0.05，事後比較檢驗(post-hoc comparison test)的 ANOVA。圖4為表示在對照小豬(η = 6)、慢性缺氧小豬(η = 11)和用L-瓜氨酸治療的慢 性缺氧小豬(η = 6)中計算的肺血管阻力的條形圖。所有值均為平均值士SEM。*與對照 不同；+與慢性缺氧不同；P < 0. 05，事後比較檢驗的AN0VA。圖5為表示在對照小豬(η = 6)、慢性缺氧小豬(η = 11)和用L-瓜氨酸治療的慢 性缺氧小豬(η = 5)中呼出的一氧化氮的條形圖。所有值均為平均值士SEM。*與對照不 同；+與慢性缺氧不同；P < 0. 05，事後比較檢驗的AN0VA。圖6為表示在對照小豬(η = 17)、慢性缺氧小豬(η = 9)和用L-瓜氨酸治療的慢 性缺氧小豬(η = 5)的肺灌注液中的亞硝酸鹽/硝酸鹽積累的條形圖。所有值均為平均值 士SEM。*與對照不同；+與慢性缺氧不同；ρ < 0. 05，事後比較檢驗的AN0VA。圖7Α為對照小豬(η = 3)、慢性缺氧小豬(η = 3)和用L-瓜氨酸治療的慢性缺氧 小豬(η = 3)的肺組織的肌動蛋白再探測的eNOS蛋白的免疫印跡圖像。圖7B為表示對照小豬(η = 3)、慢性缺氧小豬(η = 3)和用L-瓜氨酸治療的慢性 缺氧小豬(η = 3)的肺組織的歸一化為肌動蛋白的eNOS的光密度測定的條形圖。發明詳述早產是產科學和新生兒學的主要挑戰，其是新生兒中大部分的圍產期死亡率和長 期神經病變的原因。BPD是可以與早產有關的許多併發症之一。BPD可以與早產兒住院時 間延長、在生命最初的幾年中多次再住院和發育遲緩有關。幸運的是，BPD目前在出生體 重超過1，200g或孕期超過30周的情況下並不常見(Jobe等人(2001) Am J Respir Crit Care Medl63 1723-1729)。定義為在末次月經年齡36周時的氧需求的BPD的發病率對於 出生體重< 1，OOOg 的嬰兒為約 30% (Jobe 等人(2001)Am J Respir Crit Care Med 163 1723-1729)。這些嬰兒中的一些患有嚴重的肺病，需要通氣和/或補充氧氣達數月或者甚 至數年之久。多種因素促成了 BPD，並且可能進行累加或協同作用來促成損傷。傳統的觀 點認為，BPD主要是由氧化劑介導的損傷和通氣介導的損傷引起的(Jobe等人(2001) Am J Respir Crit Care Med 163:1723-1729)。機械通氣和氧氣可以幹擾早產兒的肺 泡和血管發育，並且促成了 BPD的產生(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med 163 :1723-1729)。肺泡數目的減少可以導致表面積的大量減少，其與異形肺微血管系統 (dysmorphic pulmonary microvasculature)的減少有關。這些解剖學變化與呼吸道樣 品中白細胞和細胞因子水平的持續增加有關(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Medl63 :1723_1729)。炎症也可以在BPD的產生中起到作用。多種促炎症和趨化性因子存在於通氣的 早產兒的氣腔中，並且在隨後產生BPD的嬰兒的氣腔中發現了更高濃度的這些因子(Jobe等人(2001) Am J Respir Crit Care Medl63 :1723_1729)。被認為對 BPD 的產生具有重 要性的其它因素包括鈴蟾肽樣肽、高氧、缺氧、營養不良、糖皮質激素治療以及腫瘤壞死因 子- α、TGF-α、IL-6 或 IL-11 等細胞因子的過表達(Jobe 等人(2001) Am J Respir Crit Care Med 163 1723-1729)。診斷BPD通常包括在生命的初始幾周內監測嬰兒的呼吸，以發現肺部發育延緩以 及連續和/或增加的對輔助呼吸的依賴性的徵兆。為了輔助BPD的診斷而進行的診斷測 試可以包括血氧測試、胸透和超聲心動圖。在月經後36周時，當嬰兒需要補充供氧時，通 常診斷為患有BPD。在BPD的診斷和定義中所用的較新的定義包括「輕微」、「中等」和「嚴 重，，BPD 的具體標準(Ryan, R. Μ. (2006) J Perinatology 26 :207_209)。治療BPD可以包括多方面的治療所述病症的症狀並為嬰兒的肺部提供發育機會 的方法。目前可用的治療可以包括給藥表面活性劑以改善肺通氣、用機械呼吸機補償呼吸 衰竭、補充供氧以確保充足的血氧、用支氣管擴張藥物治療改善肺部氣流、用皮質類固醇減 少呼吸道的腫脹和炎症、通過流體控制以避免肺水腫、治療動脈導管未閉和適當的營養。通過吸入給藥一氧化氮對肺部發育的改善已在動物幼仔模型中得到證實 (Ballard等人(2006) N Engl J Med 355 :343_353)。然而，通過吸入給藥NO對人類個體是 有爭議的。因此，根據本發明的某些實施方案，向患有BPD的個體給藥瓜氨酸或其他NO前 體從而增加體內的NO合成可以為BPD治療提供NO吸入的替代選擇。由於慢性缺氧對存在和發育中的肺動脈的作用，其導致肺循環功能和結構的進 行性改變。Shimoda L 等人，Physiol Res (2000) ；49 :549_560 ；Subhedar, N. V.，Acta Paediatr suppl (2004) ；444 :29_32。最終，慢性缺氧導致嚴重的肺動脈高壓，其最終引發 右側心力衰竭和死亡。目前用於患有與持續性或間斷性缺氧有關的慢性心肺病症的嬰兒的 肺動脈高壓的療法主要局限於改善根本的心肺病症並試圖實現充分的氧合。Abman，S. H.； Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed(2002)87 :F15-F18 ；Allen, J. and ATS subcommittee AoP, Am JRespir Crit Care Med(2003) 168 :356_396 ；Mupanemunda, R. H. , Early Human Development(1997)47 :247_262 ；Subhedar，N. V. ,Acta Paediatr suppl(2004)444 :29_32。 因此，根據本發明的某些實施方案，提供了新的治療方法，其包括向患有慢性缺氧誘發的肺 動脈高壓的個體給藥瓜氨酸。瓜氨酸是尿素循環和產生一氧化氮(NO)的關鍵中間體。在尿素循環中，瓜氨酸是 從頭合成精氨酸的前體。可以通過精氨酸酶使精氨酸脫氨以產生尿素，其隨後可以被排洩 以清除身體的廢氮，特別是氨。或者，精氨酸可以通過一氧化氮合酶產生N0。就這點而論， 完整的尿素循環功能不僅對氨的排洩是重要的，而且對維持充分的精氨酸(N0前體)組織 水平也是重要的。一氧化氮是利用精氨酸作為底物通過一氧化氮合酶合成的。NO合成的限速因素是 細胞精氨酸的利用率，並且用於NO合成的精氨酸的優選來源是從瓜氨酸從頭合成。精氨酸 的體內合成途徑以鳥氨酸開始。鳥氨酸與氨甲醯磷酸結合產生瓜氨酸，其又在三磷酸腺苷 的存在下與天冬氨酸結合產生精氨琥珀酸。在最終步驟中，延胡索酸從精氨琥珀酸斷開產 生精氨酸。精氨酸的降解途徑是通過精氨酸酶的水解作用產生鳥氨酸和尿素。這些反應形 成了尿素循環。還參見圖1。作為用於尿素合成的降解的替代選擇，精氨酸可以通過一氧化氮合酶提供合成NO所需的底物。另外，外源瓜氨酸可以進入尿素循環並提供精氨酸的體內合成，其隨後可以提 供NO合成。因此，向個體給藥瓜氨酸可以增加精氨酸合成，並且隨後增加NO產生，從而預防 和/或治療BPD或慢性缺氧誘發的肺動脈高壓，所述個體包括但不限於對BPD或慢性缺氧 誘發的肺動脈高壓敏感或者診斷為患有BPD或慢性缺氧誘發的肺動脈高壓的個體。還可以 提供在體內產生瓜氨酸的瓜氨酸前體。作為對瓜氨酸的替代選擇，可以提供其它NO前體。 例如，可以提供作為NO前體的精氨酸或在體內產生精氨酸的前體。I.治療方法本發明提供了增加個體中的NO合成的方法和組合物。在某些實施方案中，向個體 給藥有效量的瓜氨酸或其它NO前體以增加NO合成。在某些實施方案中，所述NO前體選自 包括但不限於瓜氨酸、在體內產生瓜氨酸的前體、精氨酸、在體內產生精氨酸的前體或其組 合的組。在某些實施方案中，將瓜氨酸或其它NO前體口服給藥。在某些實施方案中，將瓜 氨酸或其它NO前體靜脈內給藥。本發明還提供了治療個體的BPD和/或相關併發症的方法和組合物。在某些實施 方案中，向患有BPD和/或相關併發症和/或面臨患有與BPD有關的併發症的風險的個體 給藥有效量的瓜氨酸或其它NO前體。在某些實施方案中，所述NO前體選自包括但不限於 瓜氨酸、在體內產生瓜氨酸的前體、精氨酸、在體內產生精氨酸的前體或其組合的組。在某 些實施方案中，將瓜氨酸或其它NO前體口服給藥。在某些實施方案中，將瓜氨酸或其它NO 前體靜脈內給藥。在某些實施方案中，待治療個體為患有與BPD有關的急性病症的個體。上 文中公開了這些病症的代表性實例。本發明還提供了治療個體的慢性缺氧誘發的肺動脈高壓和/或相關併發症的方 法和組合物。在某些實施方案中，向患有慢性缺氧誘發的肺動脈高壓和/或相關併發症和 /或面臨患有與慢性缺氧誘發的肺動脈高壓有關的併發症的風險的個體給藥有效量的瓜氨 酸或其它NO前體。在某些實施方案中，所述NO前體選自包括但不限於瓜氨酸、在體內產生 瓜氨酸的前體、精氨酸、在體內產生精氨酸的前體或其組合的組。在某些實施方案中，將瓜 氨酸或其它NO前體口服給藥。在某些實施方案中，將瓜氨酸或其它NO前體靜脈內給藥。 在某些實施方案中，待治療個體為患有與慢性缺氧誘發的肺動脈高壓有關的急性病症的個 體。上文中公開了這些這樣的病症的代表性實例。在某些實施方案中，所述一氧化氮前體包括瓜氨酸、在體內產生瓜氨酸的前體、其 藥學可接受的鹽及其組合的至少一種。參見圖1。在某些實施方案中，所述一氧化氮前體選 自包括但不限於瓜氨酸、精氨酸或其組合的組。在某些實施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化 氮前體口服給藥。在某些實施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化氮前體靜脈內給藥。在某些實施方案中，所述個體患有低瓜氨酸血症。在某些實施方案中，所述低瓜氨 酸血症的特徵在於血漿瓜氨酸水平為< 37 μ mol/升，在某些實施方案中為< 25 μ mol/升， 在某些實施方案中為< 20 μ mol/升，在某些實施方案中為< 10 μ mol/升，在某些實施方案 中為≤5μπιο1/升。在某些實施方案中，患有本文公開的病症的個體還患有相對低瓜氨酸血症 (relative hypocitrullinemia)。術語「相對低瓜氨酸血症」指這樣的狀態，其中與未患有 病症的個體相比，患有病症的個體具有降低的血漿瓜氨酸。本文所用的短語「治療」是指為改善個體的病症(例如，疾病過程開始後或者在損傷後)、為改善個體的與病症有關的併發症而設計的幹預措施，以及為預防個體的病症發生 而設計的幹預措施。換言之，術語「治療」及其語法變體旨在被廣義地解釋為涵蓋意指減少 病症的嚴重性和/或治癒病症的含義，以及意指預防的含義。在後一方面，「治療」可以指在 例如但不限於面臨罹患病症的風險的個體中「預防」至任何程度；或者以其它方式增強個體 抵抗病症過程的能力。在本發明的許多實施方案中治療的個體期望地為人類個體，但是應當理解本發明 的原理表明本發明對於包括諸如哺乳動物和鳥類的溫血脊椎動物在內所有脊椎動物物種 是有效的，其意圖被包括在術語「個體」中。在本文的語境中，哺乳動物被理解為包括期望 治療的任何哺乳動物物種，例如但不限於農業哺乳動物物種和飼養哺乳動物物種。因此，本發明提供了對諸如人的哺乳動物的治療，以及對以下哺乳動物的治療，其 由於瀕臨絕種而對人類具有重要性(例如西伯利亞虎)、對人類具有經濟重要性(為人類食 用而在農場飼養的動物)和/或對人類具有社會重要性(作為寵物或在動物園中飼養)，例 如除人以外的食肉動物(如貓和狗)、豬(swine)(小豬(pig)、肉豬(hog)和野豬)、反芻動 物(例如牛(cattle)、閹牛(oxen)、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)和馬。本發明還 提供了對鳥類的治療，包括對瀕臨滅絕的鳥、飼養在動物園中的鳥，以及家禽(fowl)，更特 別的是馴養家禽，即諸如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞等家禽(poultry)的治療，因為它們也對 人類具有經濟重要性。因此，本發明提供了對家畜的治療，所述家畜包括但不限於家豬(小 豬和肉豬)、反芻動物、馬、家禽等。II.藥物組合物將有效劑量的本發明的組合物向有此需要的個體給藥。「有效量」是足以產生可測 量的反應(例如正在接受治療的個體中的生物或臨床相關的反應)的組合物的量。可以改 變本發明的組合物中的活性成分的實際劑量水平，從而以有效實現特定個體的期望治療反 應的量將活性化合物給藥。所選的劑量水平取決於治療組合物的活性、給藥途徑、與其它藥 物或療法的組合、被治療的病症的嚴重性以及被治療的個體的病症和既往醫療史。以示例 而非限制的方式，組合物的劑量可以以低於實現期望療效所需的水平開始，並且逐漸地增 加劑量直至實現期望的效果。組合物的效力可以變化，因此「有效量」可以變化。閱讀了本文所提供的本發明的公開內容之後，考慮到具體製劑、用所述組合物實 施的給藥方法以及治療的具體疾病，本領域技術人員可以為單獨的個體制定劑量。劑量的 進一步計算可以考慮個體的身高和體重、性別、症狀的嚴重性和階段，以及其它有害身體病 症的存在。以其它實例的方式，可以與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量取決於 待治療個體和具體給藥方式而變化。例如，意圖向人類給藥的製劑可以含有與合適且方便 的量的載體材料混合的0. 5mg至5g的活性劑，所述載體材料可以為全部組合物的約5% 至約95%不等。例如，在成人中，每人每次給藥的劑量通常為Img至500mg，並且每天多達 數次。因此，單位劑型通常含有約Img至約500mg的活性成分，通常為25mg、50mg、lOOmg、 200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg 或 IOOOmg 的活性成分。在某些實施方案中，以約0. Olmg至約1，OOOmg的劑量將一氧化氮前體給藥，在某 些實施方案中，劑量為約0. 5mg至約500mg，並且在某些實施方案中，劑量為約1. Omg至約 250mg。在某些實施方案中，還可以以約IOOmg至約30，OOOmg的劑量將一氧化氮前體給藥，並且在某些實施方案中，劑量為約250mg至約1，OOOmgo代表性劑量為3. 8g/m2/天的精氨 酸或瓜氨酸(摩爾當量，麗L-瓜氨酸175. 2，麗L-精氨酸174. 2)。代表性的靜脈內瓜氨酸溶液可以包括100mg/ml(10%)的溶液。代表性的靜脈內 瓜氨酸劑量可以包括200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg和800mg/kg。在某些實施方案中，所述 劑量例如但不限於600mg/kg或800mg/kg，可以將所述劑量減少50mg/kg至100mg/kg的量 以緩和所觀察到的對全身血壓的不期望作用。在某些實施方案中，在諸如1天的給定時間 內，可以給藥一次或多次的劑量。在某些實施方案中，藥物組合物包含有效地升高血漿瓜氨酸水平以治療個體的本 文公開的病症的量的瓜氨酸。在某些實施方案中，所述水平是通過將待治療個體的血漿瓜 氨酸水平與在未患有所述病症的個體中所觀察到的血漿瓜氨酸水平進行比較而測定的。在 某些實施方案中，瓜氨酸的量將個體的血漿瓜氨酸水平有效升高到至少5 μ mol/升，任選 至少10 μ mol/升，任選至少20 μ mol/升，任選至少25 μ mol/升，以及任選約37 μ mol/升。在某些實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其包含一氧化氮前體和藥學可接 受的載體，如在人類中藥學可接受的載體。在某些實施方案中，本發明提供了藥物組合物， 其包含上述劑量的瓜氨酸或精氨酸。通常以單位劑量製劑(dosage unit formulation)將本發明的組合物口服或胃腸 外給藥，所述製劑視需要含有標準無毒的藥學可接受的載體、佐劑和媒介物(vehicle)。本 文所用的術語「胃腸外」包括靜脈內、肌肉內、動脈內注射或輸注技術。根據已知技術，利用合適的分散劑或潤溼劑及助懸劑配製諸如無菌注射水性或油 性懸浮液的注射製劑。所述無菌注射製劑還可以為在無毒可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌 注射溶液或懸浮液，例如，1，3_ 丁二醇中的溶液。可用的可接受的媒介物和溶劑中包括水、林格溶液(Ringer』 s solution)和等滲 氯化鈉溶液。另外，通常將無菌非揮髮油用作溶劑或懸浮介質。為了該目的，可以使用包括 合成甘油單酯或甘油二酯在內的任何溫和的非揮髮油。此外，諸如油酸的脂肪酸可用於注 射劑的製備。示例性載體包括用磷酸鹽、乳酸鹽、Tris等緩衝的中性鹽溶液。在代表性實施方案中，可以在相關治療期間向個體給藥若干次的劑量，其包括但 不限於1、2、3、4、5、6或更多次的劑量。然而，應當理解，對於任何特定個體的具體劑量水平取決於多種因素，其包括年 齡、體重、一般健康、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排洩速率、藥物組合以及在治療的特 定疾病的嚴重性。
實施例本發明包括以下實施例以示例本發明的代表性方式。根據本公開內容和本領域的 一般技術水平，本領域技術人員應當理解，由於可以在不偏離本發明的精神和範圍的情況 下採用多種變化、修改和改變，以下實施例僅僅旨在示例。實施例1-4下列實施例評價在將新生小豬暴露於10天的慢性缺氧期間，口服補充L-瓜氨酸 是否會預防肺動脈高壓的產生和NO產生的隨之減少。實施例1-4所用的方法
動物護理將總共17隻缺氧小豬和17隻對照小豬進行研究。參見圖2。在從農場抵達的當 天研究12天大的對照動物。將缺氧的豬(2天大)置於常壓的缺氧室中達10天至11天。 利用壓縮空氣和氮氣提供常壓缺氧以產生8-11%的吸入氧氣(PO2 60-72ΤΟΠ·)，並且通過 用鹼石灰的吸收來將CO2保持在3-6ΤΟΠ·。監測動物的每日體重並且每日體檢兩次。用籠 中飼餵裝置的豬乳替代物隨意地飼養它們。L-瓜氨酸補充將17隻缺氧小豬中的6隻在缺氧暴露的第一天開始口服補充L-瓜氨酸。參見圖 2。以0.13-gm/千克體重的劑量，利用注射器每日口服遞送兩次來提供L-瓜氨酸補充。如 果研究人員覺得小豬沒有攝入大部分的劑量，則重複該步驟。利用0. 13克每升蒸餾水的濃 度的製劑(Sigma Pharmaceuticals, St. Louis,Missouri,United States ofAmerica,純度 98% )來混合L-瓜氨酸，並且當完全溶解時，將該溶液通過0. 20微米過濾器。體內血流動力學在對照小豬中的6隻和全部缺氧小豬中測量體內血流動力學。參見圖2。對於這 些測量，將這些動物稱重，然後用氯胺酮(15mg/kg)和乙醯丙嗪(2mg/kg)進行肌肉內預麻 醉。然後利用用於鎮靜的靜脈內戊巴比妥，如以前所描述進行氣管造口術，置入靜脈和動脈 導管以及熱敏電阻。Fike, C. D.等人，JAppl Physiol (2000)88 1797-1803。測量肺動脈 壓、左心室舒張末期壓以及心輸出量。通過熱稀釋技術(9520型熱稀釋法心輸出量計算機， Edwards Laboratory, Irvine, California, United States of America)，利用主動脈弓中 的熱敏電阻以及作為注入孔的左心室導管來測量心輸出量。在呼氣末將心輸出量測量為 3ml普通鹽水(0°C)的3次注射的平均值。如下所述測量呼出的N0。在體內測量期間，利 用活塞型通氣機以15-20cc/kg的潮氣量、2mmHg的終末呼氣壓以及每分鐘15-20次呼吸的 呼吸速率，用室內空氣將動物通氣。呼出的一氧化氮測量對於被麻醉的動物中的呼出NO測量，如前所述，每3分鐘時間段將呼出氣體取樣2 至 3 次，並通過化學發光分析儀(270B 型 NOA ；Sievers, Boulder, Colorado, United States ofAmerica) 貝Ijfi NO &貞。Fike， C. D. 入，American Journal of Physiology (Lung, Cellular and Molecular Phyiology 18) (1998) 274 :L517_L526。利用每分鐘通氣量和所 測量的呼出的NO濃度來計算呼出的NO產量(nmol/min)。分離的肺灌注物在37°C下，將肺分離，並用含有mol.wt.為70，000的5%葡聚糖的克雷布-林格 碳酸氫鹽(Krebs Ringer bicarbonate，KRB)溶液進行原位灌注，並且如前所述地用常氧 氣體混合物(21% O2 和 5% CO2)進行通氣。Fike, C. D.等人，J Appl Physiol (2000)88 1797-1803。將肺灌注30-60min直至達到穩定的肺動脈壓。然後在60分鐘的時間段內， 每IOmin從左心房插管中除去灌注液樣品(1ml)。將灌注液樣品離心，並且將上清液貯存 在-80°C下以用於下述以後的亞硝酸鹽/硝酸鹽(Ν0χ_)濃度分析。在灌注末尾，測量保留 在迴路和儲氣泡中的灌注液體積。在某些情況下，在灌注後立即收集肺組織，將其用液氮冷 凍，然後貯存於-80度下以用於下述以後的eNOS含量測量。N0X_ 測量
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在每次收集時間，使用前述化學發光分析來測定灌注液NOx-濃度(nmol/ml)。 Fike, C. D.等人，J Appl Physiol (2000) 88 1797-1803 ；Turley, J. E.等人，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2003) 284 :L489_L500。將灌注液(20 μ 1)注入化學發光 NO 分析 儀(170B型Ν0Α，Sievers)的反應室中。該反應室含有在IM HCl中的氯化釩(III)，其被 加熱到90°C以將亞硝酸鹽和硝酸鹽還原為NO氣體。利用恆定的N2氣流，通過含有用於除 去HCl蒸汽的IM NaOH的除泡器(gas bubble trap)將NO氣體帶入分析儀中。通過向蒸 餾水中添加已知量的NaNO3,並且如所述地測定灌注樣品來生成標準曲線。通過以下方法計算每次收集時間的灌注液NOx-濃度(nmol/ml)將樣品收集時間 時的灌注液NOx-濃度乘以樣品收集時間時的體系體積(灌注迴路+儲藏)，加上所有以前 樣品除去的Ν0χ_的量。從與灌注液中Ν0χ_的量比收集時間段的最初60分鐘的時間擬合的 線性回歸線的斜率來測定Ν0χ_的產生速率。血漿胺基酸測量在血流動力學測量和/或肺灌注研究的當天，對於對照動物與用L-瓜氨酸治療和 未治療的慢性缺氧動物，在開始研究之前抽取血液，並將血漿在-80度下冷凍以用於以後 的胺基酸水平測定。對於用L-瓜氨酸治療的缺氧動物，獲得血液樣品的時間為L-瓜氨酸 的最後給藥後約12小時，因此其為低谷水平。在某些用L-瓜氨酸治療的動物(η = 3)中， 對低谷水平血液取樣後，通過經鼻胃管給予一次劑量的L-瓜氨酸。在該次給藥之後，在90 分鐘(體內研究的時間長度)的每30分鐘抽取血液樣品。將全部樣品離心，收集血漿並 在-80度下冷凍以用於胺基酸分析。通過無蛋白提取物的胺基酸分析來測定血漿瓜氨酸和精氨酸的濃度。利用 Hitachi L8800 胺基酸分析儀(Hitachi USA, San Jose, California, United States of America)，通過陽離子交換色譜來分離胺基酸。在測試小豬樣品前進行分析儀的校準。肺組織中ENOS的蛋白質印跡利用前述標準免疫印跡技術，我們分析了來自對照動物(η = 3)、未治療的缺氧 動物(η = 3)以及用L-瓜氨酸治療的缺氧動物(η = 3)的全肺勻漿樣品的eNOS。我們 使用了 10微克總蛋白、1 500的第一eNOS抗體稀釋液(BD轉導)和1 5000的與辣 根過氧化物酶結合的第二抗小鼠抗體稀釋液。Fike，C.D.等人，American Journal of Physiology(Lung, Cellular and Molecular Physiology 18)(1998) 274 :L517_L526。計算和統計學從體內血流動力學測量計算肺血管阻力(肺動脈壓_左心室舒張末期壓)+ (心
輸出量/體重)。將數據表示為平均值士SE。使用具有Fisher保護的最小顯著差異(Fisher』 s protected least significant difference) (PLSD)的單向 ANOVA 事後比較測試來比較對 照動物、未治療的缺氧動物和用L-瓜氨酸治療的缺氧動物之間的數據。將小於0. 05的ρ 值視為顯著。Meier，U.，Pharm Stat (2006) 5 :253_263。實施例1體內血流動力學測量在12-13天大的動物的研究當天，與年齡相當的對照小豬相比，用L-瓜氨酸治療 的缺氧動物和未治療的缺氧動物均具有較低的心輸出量和重量以及較高的LVEDP測量值(表1)。組群中的主動脈壓和血氣指數的測量值類似(對照小豬中的PaO2為74士5Τοπ·， 未治療的缺氧小豬中的PaO2為74 士 STorr，用L-瓜氨酸治療的缺氧小豬中的pa02為 78士7Torr ；對照小豬中的paC02為39士2，未治療的缺氧小豬中的paC02為41 士4，用L-瓜 氨酸治療的缺氧小豬中的paC02為30士 1. 0)。明顯地，如圖3所示，與未治療的缺氧動物相 比，用L-瓜氨酸治療的缺氧動物具有明顯較低的肺動脈壓(ρ值為0.01)。在常氧對照動物 和用L-瓜氨酸治療的缺氧動物之間的肺動脈壓並無不同(ρ = 0. 08)。另外，如圖4所示，在用L-瓜氨酸治療的這些缺氧動物中計算的肺血管阻力 (0.071 士0.003)明顯低於未治療的缺氧動物的肺血管阻力(P值為0.001)。而且，用L-瓜 氨酸治療的缺氧動物與常氧對照動物的肺血管阻力類似(P值為0. 07)。實施例2呼出的NO輸出量和灌注液N0X_如圖5所示，對照動物與用L-瓜氨酸治療的缺氧動物中的呼出的NO輸出量高於 未治療的缺氧動物中的呼出的NO輸出量(ρ值分別為0.001和0.032)。然而，對照動物與 用L-瓜氨酸治療的缺氧動物之間呼出的NO輸出量並無差別(ρ = 0. 124)。如圖6所示，與未治療的缺氧動物的肺相比，對照動物(p = 0.02)和用L-瓜氨酸 治療的缺氧動物(P = 0. 04)的肺具有明顯更高的NOxI只累速率。而且，用L-瓜氨酸治療 的缺氧動物的肺與常氧對照動物的肺的NOx-積累速率並無差別。實施例3血漿胺基酸如表2所示，儘管沒有達到統計顯著性(P = 0. 05)，但是未治療的缺氧小豬中的 血漿L-瓜氨酸水平低於治療過的缺氧小豬中的低谷L-瓜氨酸水平。而且，當在給藥後 90分鐘抽取時，治療過的缺氧動物的L-瓜氨酸水平幾乎是未治療的缺氧動物的2倍(ρ = 0. 001)。然而，不管抽取樣品的時間如何，當與未治療的缺氧動物相比，用L-瓜氨酸治療的 慢性缺氧動物中的血漿精氨酸水平不會更高。實施例4肺ENOS蛋白的蛋白質印跡如圖7A和7B所示，存在於對照動物的肺組織中的eNOS蛋白的量明顯高於存在於 未治療的缺氧動物的肺中的eNOS蛋白的量。而且，存在於用L-瓜氨酸治療的缺氧小豬的肺 組織中的eNOS蛋白的量與未治療的缺氧動物的肺組織中的eNOS蛋白的量沒有明顯差異， 並且明顯低於對照動物中的eNOS蛋白水平。表1對照小豬、慢性缺氧小豬和用L-瓜氨酸治療的慢性缺氧小豬的數據N =動物 數目，值為平均值士SEM，*p < 0. 05比對照，事後比較檢驗的ANOVA
權利要求
治療支氣管肺發育不良的方法，所述方法包括向有此需要的個體給藥有效量的一氧化氮前體。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、在體內產生瓜氨酸 的前體、精氨酸、在體內產生精氨酸的前體及其組合。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述給藥包括口服給藥、靜脈內給藥及其組合。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述個體為嬰兒。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述嬰兒為早產兒。
6.如權利要求1所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約IOOmg至約30，OOOmg的劑量給藥。
7.如權利要求6所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約250mg至約1，OOOmg的劑量給藥。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述個體患有低瓜氨酸血症，其特徵在於血漿瓜氨 酸水平為彡37μπι01/升。
9.治療慢性缺氧誘發的肺動脈高壓的方法，所述方法包括向有此需要的個體給藥有效 量的一氧化氮前體。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、在體內產生瓜氨酸 的前體、精氨酸、在體內產生精氨酸的前體及其組合。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述給藥包括口服給藥、靜脈內給藥及其組合。
12.如權利要求9所述的方法，其中所述個體為嬰兒。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述嬰兒為早產兒。
14.如權利要求9所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約IOOmg至約30，OOOmg的劑量給藥。
15.如權利要求14所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約250mg至約1，OOOmg的劑量給藥。
16.如權利要求9所述的方法，其中所述個體患有低瓜氨酸血症，其特徵在於血漿瓜氨 酸水平為彡37μπι01/升。
17.藥物組合物，其包含藥學可接受的載體以及有效升高血漿瓜氨酸水平以治療個體 的支氣管肺發育不良或缺氧誘發的肺動脈高壓的量的瓜氨酸，其中所述水平是通過將待治 療個體的血漿瓜氨酸水平與在未患有支氣管肺發育不良或缺氧誘發的肺動脈高壓的個體 中所觀察到的血漿瓜氨酸水平進行比較而測定的。
18.如權利要求17所述的藥物組合物，其中瓜氨酸的量將個體的血漿瓜氨酸水平有效 升高到至少5 μ mol/升，任選至少10 μ mol/升，任選至少20 μ mol/升，任選至少25 μ mol/ 升，以及任選約37 μ mol/升。
19.如權利要求17所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物適合於靜脈內或口服給藥。
全文摘要
本發明涉及治療個體的諸如支氣管肺發育不良或缺氧誘發的肺動脈高壓的肺部病症的方法和組合物，其包括向所述個體給藥有效量的一氧化氮前體，如瓜氨酸。
文檔編號A61P11/00GK101969974SQ200980109150
公開日2011年2月9日 申請日期2009年2月2日 優先權日2008年1月31日
發明者C·D·菲克, J·L·阿施納, 弗雷德裡克·E.·巴爾, 馬歇爾·L.·薩默 申請人:範德比爾特大學