羧基磁珠及其製備方法和應用與流程

2023-09-23 05:35:51

1.本發明涉及功能高分子改性領域領域，特別涉及羧基磁珠及其製備方法和應用。


背景技術：

2.磁珠指均勻分散在一定基液中的膠態複合材料，其自身具有超順磁性、較高的比表面積、可修飾功能基團等特性，因此可將抗原/抗體、酶、核酸/寡核苷酸、小分子藥物等固定在其表面，使其在生物醫療領域有著廣泛的應用。基於磁珠表面基團的可修飾性，一些表面含有氨基、羧基、甲苯磺醯基、羥基等基團的磁珠在體外診斷領域得到了廣泛的使用，其中羧基磁珠的應用更為常見。在使用羧基磁珠進行抗原或抗體包被時，通常包被後的磁珠會有磁吸載機凝集、熱加速信號值降低等問題。通過對比研究發現，通常羧基磁珠經活化後，抗原或抗體的包被過程容易出現多層包被、活材自身吸附過多，這些表面的抗原或抗體由於自身的疏水性吸附或者磁珠之間空間位阻小表現為分散性以及穩定性差。
3.現有的專利或者文獻報導中，對於羧基磁珠的改性修飾通常使用的是高分子化合物，這些高分子化合物的合成通常需要迭代合成，工藝比較複雜且成本較高。


技術實現要素：

4.有鑑於此，本發明提供了羧基磁珠及其製備方法和應用。本發明提供了一種羧基磁珠的修飾方法及其應用。使用本發明修飾方法的羧基磁珠，改善了活材寶貝後磁珠的分散性及穩定性問題。
5.為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
6.本發明提供了n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺在修飾羧基磁珠中的應用。
7.本發明還提供了修飾後羧基磁珠，其被n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾。
8.本發明還提供了所述修飾後羧基磁珠的製備方法：取羧基磁珠，在偶聯劑存在的條件下，與n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺溶液偶聯，偶聯產物在氮氣存在的條件下，與交聯劑、丙烯酸和引發劑聚合，即獲得修飾後羧基磁珠。
9.在本發明的一些具體實施方案中，所述羧基磁珠的羧基含量包括30～63μmol/g；和/或
10.所述羧基磁珠的粒徑包括0.98～1.45μm。
11.在本發明的一些具體實施方案中，所述n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺溶液的濃度包括2.5～10mg/ml；和/或
12.所述偶聯劑包括edc溶液；所述edc溶液的濃度包括10～30mg/ml；和/或
13.所述偶聯的偶聯時間包括1～3h。
14.在本發明的一些具體實施方案中，所述丙烯酸的濃度包括6.2～24.8mg/ml；和/或
15.所述交聯劑包括n,n-亞甲基雙丙烯醯胺；所述n,n-亞甲基雙丙烯醯胺的濃度為1～5mg/ml；和/或
16.所述引發劑包括過硫酸銨或偶氮二異丁腈
。
17.在本發明的一些具體實施方案中，所述聚合的溫度包括40～60℃；和/或
18.所述聚合的時間包括8～12h。
19.在本發明的一些具體實施方案中，所述製備方法具體包括：
20.將羧基磁珠清洗後去除上清液，加入edc溶液，振蕩1～3h後磁吸去除上清，加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺溶液繼續振蕩偶聯，得到n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠。此步驟的目的是將n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺提前修飾到羧基磁珠的表面，為下一步利用自由基聚合將丙烯酸進一步連接在羧基磁珠表面做準備，也是本發明將普通羧基磁珠通過鏈延長得到空間位阻更大的羧基磁珠的關鍵步驟之一。
21.所述製備方法還包括：
22.將得到的n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠磁吸後去除上清，加入n,n-亞甲基雙丙烯醯胺、丙烯酸和引發劑，在氮氣氛圍、40～60℃條件下振蕩聚合8～12h，得到修飾後的鏈延長羧基磁珠。此步驟的目的是利用引發劑、交聯劑將丙烯酸和第一步得到的n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠(該磁珠表面此時伸展出來的是n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯)進行連接，進一步將n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺和丙烯酸通過交聯劑進行連接，至此得到最終修飾後的羧基磁珠，該修飾後的羧基磁珠表面通過兩步的修飾，表面羧基基團是具有一定的空間位阻的，這是修飾後的羧基磁珠與未經修飾的羧基磁珠之間的主要區別，也是將普通羧基磁珠修飾為鏈延長、空間位阻更大的羧基磁珠的關鍵步驟之一。
23.本發明還提供了一種試劑，其包括以下任意項以及可接受的助劑：
24.(i)、所述修飾後羧基磁珠；和/或
25.(ii)、所述製備方法製得的修飾後羧基磁珠。
26.本發明還提供了以下任意項在製備體外診斷檢測試劑盒中的應用：
27.(i)、所述修飾後羧基磁珠；和/或
28.(ii)、所述製備方法製得的修飾後羧基磁珠；和/或
29.(iii)、所述試劑。
30.本發明還提供了一種試劑盒，其包括以下任意項，以及可接受的助劑或載體：
31.(i)、所述修飾後羧基磁珠；和/或
32.(ii)、所述製備方法製得的修飾後羧基磁珠；和/或
33.(iii)、所述試劑。
34.本發明取得了包括且不限於如下有益效果：
35.使用所述n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺和丙烯酸修飾的羧基磁珠，可改善磁珠包被抗原/抗體後的分散性及穩定性，進而提升體外診斷試劑盒的質量，提高客戶的使用體驗感。
附圖說明
36.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
37.圖1示n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺、交聯劑(n,n-亞甲基雙丙烯醯胺)、丙烯酸和羧基磁珠的示意圖；
38.圖2示n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾羧基磁珠的示意圖；
39.圖3示n,n-亞甲基雙丙烯醯胺作為交聯劑，n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺和丙烯酸通過自由基聚合修飾後磁珠的示意圖；
40.圖4示默克羧基磁珠與本發明修飾的羧基磁珠在不同項目中分散性對比；
41.圖5示默克羧基磁珠、丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠以及本發明修飾的羧基磁珠在pⅲnp項目中分散性的對比。
具體實施方式
42.本發明公開了一種羧基磁珠及其製備方法和應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
43.本發明的目的在於提供一種羧基磁珠的修飾方法，利用自由基聚合的方式，將n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺和丙烯酸通過交聯劑n,n-亞甲基雙丙烯醯胺聚合在一起，使普通的羧基磁珠表面的羧基基團通過化學修飾後得到了延長，即磁珠表面的羧基基團具有了一定的空間結構，在抗原/抗體包被時，修飾的磁珠和羧基基團之間的長鏈結構，起到了抗原/抗體和磁珠之間的「橋梁」。經過該方法修飾的羧基磁珠，包被抗原/抗體過程中，穩定性更高；通過改善包被抗原/抗體後磁珠之間的空間位阻，包被後的磁珠分散性更好。
44.本發明的目的還在於提供一種體外診斷試劑盒，使用n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺和丙烯酸修飾的羧基磁珠，可改善磁珠包被抗原/抗體後的分散性及穩定性，進而提升體外診斷試劑盒的質量，提高客戶的使用體驗感。
45.為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：將羧基磁珠清洗後去除上清液，加入edc溶液，振蕩一段時間後磁吸去除上清，加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺溶液繼續振蕩偶聯，得到n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠。將得到的n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠磁吸後去除上清，加入n,n-亞甲基雙丙烯醯胺、丙烯酸和引發劑，在氮氣氛圍、一定溫度條件下振蕩聚合一段時間，得到修飾的鏈延長羧基磁珠。
46.本發明產生的積極效果如下：
47.本發明修飾的羧基磁珠，磁珠表面的羧基基團具有了一定的空間結構，在抗原/抗體包被時，修飾的磁珠和羧基基團之間的長鏈結構，起到了抗原/抗體和磁珠之間的「橋梁」。經過該方法修飾的羧基磁珠，包被抗原/抗體過程中，能夠顯著減少非特異性吸附，化學連接比例更多穩定性更高；通過改善包被抗原/抗體後磁珠之間的空間位阻，包被後的磁珠分散性更好。該方法能夠明顯改善磁珠表面基團的空間結構，提高包被活材過程及包被後的分散性和穩定性。
48.如無特殊說明，本發明提供的羧基磁珠及其製備方法和應用中所用原料及試劑均可由市場購得。
49.下面結合實施例，進一步闡述本發明：
50.製備例1本發明修飾的羧基磁珠的製備
51.(1)取默克羧基磁珠(批號：m8998，羧基含量：30μmol/g，粒徑：0.98μm，濃度：
100mg/ml，30μl)，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(10mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h。
52.(2)使用磁鐵磁吸後去除上清，加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺(2.5mg/ml，60μl)和40μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h。
53.(3)使用磁鐵磁吸後去除上清，分別加入n,n-亞甲基雙丙烯醯胺(1mg/ml，20μl)、丙烯酸(6.2mg/ml，60μl)、過硫酸銨(10mg/ml，20μl)和100μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)，充入氮氣後密封，於40℃下持續振蕩8h，得到本發明修飾的羧基磁珠。
54.製備例2本發明修飾的羧基磁珠的製備
55.(1)取默克羧基磁珠(批號：m9163，羧基含量：47μmol/g，粒徑：1.25μm，濃度：100mg/ml，30μl)，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(20mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h。
56.(2)使用磁鐵磁吸後去除上清，加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺(6.5mg/ml，60μl)和40μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩2h。
57.(3)使用磁鐵磁吸後去除上清，分別加入n,n-亞甲基雙丙烯醯胺(3mg/ml，20μl)、丙烯酸(15.5mg/ml，60μl)、過硫酸銨(10mg/ml，20μl)和100μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)，充入氮氣後密封，於50℃下持續振蕩10h，得到本發明修飾的羧基磁珠。
58.製備例3本發明修飾的羧基磁珠的製備
59.(1)取默克羧基磁珠(批號：m8727，羧基含量：63μmol/g，粒徑：1.45μm，濃度：100mg/ml，30μl)，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(30mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h。
60.(2)使用磁鐵磁吸後去除上清，分別加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺(10mg/ml，60μl)和40μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩3h，得到n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠。
61.(3)使用磁鐵磁吸後去除上清，向n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾的羧基磁珠中分別加入n,n-亞甲基雙丙烯醯胺(5mg/ml，20μl)、丙烯酸(24.8mg/ml，60μl)、過硫酸銨(10mg/ml，20μl)和100μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)，充入氮氣後密封，於60℃下持續振蕩12h，得到本發明修飾的羧基磁珠。
62.製備例4丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠的製備
63.(1)取默克羧基磁珠(批號：m8727，羧基含量：63μmol/g，粒徑：1.45μm，濃度：100mg/ml，30μl)，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(30mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h。
64.(2)使用磁鐵磁吸後去除上清，分別加入丙烯醯胺(10mg/ml，60μl)和40μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩3h，得到丙烯醯胺修飾的羧基磁珠。
65.(3)使用磁鐵磁吸後去除上清，向丙烯醯胺修飾的羧基磁珠中分別加入n,n-亞甲基雙丙烯醯胺(5mg/ml，20μl)、丙烯酸(24.8mg/ml，60μl)、過硫酸銨(10mg/ml，20μl)和100μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)，充入氮氣後密封，於60℃下持續振蕩12h，得到丙烯
醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠。
66.實施例1羧基磁珠包被anti-ssa抗原的穩定性和分散性
67.分別取未修飾羧基磁珠(即默克羧基磁珠(批號：m8998，羧基含量：30μmol/g，粒徑：0.98μm，濃度：100mg/ml，30μl))和製備例1所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠，使用磁鐵磁吸後去除上清，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(20mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h；使用磁鐵磁吸後去除上清，加入anti-ssa抗原(3mg/ml，15μl)和85μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩2h，繼續使用磁鐵磁吸後去除上清，使用封保液封閉3次後定容至3ml。
68.anti-ssa項目使用默克羧基磁珠(批號：m8998)和製備例1所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被後，磁吸加速3天並載機30min後的分散性對比如圖4所示，可以看出，經過本發明方法修飾的羧基磁珠包被出的成品分散性明顯好於常規未經修飾的羧基磁珠，其優秀的分散性得利於本發明方法修飾的羧基磁珠之間具有比較大的空間位阻，使磁珠之間更加分散。
69.anti-ssa項目使用默克羧基磁珠(批號：m8998)和製備例1所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被後，平行放置4℃和37℃10天後，採用安圖生物a2000plus型號的儀器，檢測羧基磁珠包被anti-ssa抗原後的穩定性。
70.穩定性結果如表1所示：
71.表1anti-ssa磁微粒熱加速穩定性(r10為熱加速10天)
[0072][0073][0074]
由表1可以看出：anti-ssa項目使用不經修飾的羧基磁珠包被後的發光值與通過本發明提供的羧基磁珠修飾方法修飾後得到的羧基磁珠包被後的發光值相比，本發明修飾的羧基磁珠包被效價稍低於不經修飾的羧基磁珠包被效價，但本發明修飾的羧基磁珠包被後的熱加速穩定性明顯優於不經修飾的羧基磁珠，我們認為本發明修飾的羧基磁珠表面基團的空間結構抑制了一部分吸附作用，提高了化學連接率，進而改善了熱加速穩定性。
[0075]
實施例2羧基磁珠包被β2-mg抗體穩定性和分散性
[0076]
分別取未修飾羧基磁珠(即默克羧基磁珠(批號：m9163，羧基含量：47μmol/g，粒徑：1.25μm，濃度：100mg/ml，30μl))和製備例2所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠，使用磁鐵磁吸後去除上清，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(20mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h；使用磁鐵磁吸後去除上清，加入β2-mg抗體(5mg/ml，15μl)和85μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩2h，繼續使用磁鐵磁吸後去除上清，使用封保液封閉3次後定容至3ml。
[0077]
β2-mg項目使用默克羧基磁珠(批號：m9163)羧基磁珠和製備例2所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被後，磁吸加速3天並載機30min後的分散性對比如圖4所示，可以看出，經過本發明方法修飾的羧基磁珠包被出的成品分散性明顯好於常規未經修飾的羧基磁珠，其優秀的分散性得利於本發明方法修飾的羧基磁珠之間具有比較大的空間位阻，使磁珠之間更加分散。
[0078]
β2-mg抗體項目默克羧基磁珠(批號：m9163)和製備例2所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被後，平行放置4℃和37℃10天後，採用安圖生物a2000plus型號的儀器，檢測羧基磁珠進行β2-mg抗體包被後的穩定性。
[0079]
穩定性結果如表2所示：
[0080]
表2β2-mg磁微粒熱加速穩定性(r10為熱加速10天)
[0081][0082]
由表2可以看出：β2-mg項目使用不經修飾的羧基磁珠包被後的發光值與通過本發明提供的羧基磁珠修飾方法修飾後得到的羧基磁珠包被後的發光值相比，本發明修飾的羧基磁珠包被效價稍低於不經修飾的羧基磁珠包被效價，但本發明修飾的羧基磁珠包被後的熱加速穩定性明顯優於不經修飾的羧基磁珠，我們認為本發明修飾的羧基磁珠表面基團的
空間結構抑制了一部分吸附作用，提高了化學連接率，進而改善了熱加速穩定性。
[0083]
實施例3羧基磁珠包被pⅲnp抗原的穩定性和分散性
[0084]
分別取默克羧基磁珠(批號：m8727，羧基含量：63μmol/g，粒徑：1.45μm，濃度：100mg/ml，30μl)、製備例3所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠和製備例4所製備得到的丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠，使用磁鐵磁吸後去除上清，清洗3次(0.1mol/l pbs，300μl/次)去除上清，加入edc溶液(20mg/ml，100μl)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩1h。使用磁鐵磁吸後去除上清，加入pⅲnp抗原(5mg/ml，5μl)和95μl緩衝液(0.1mol/l pbs緩衝液，ph7.4)在快速混勻器震蕩均勻後放置振蕩器上震蕩2h，繼續使用磁鐵磁吸後去除上清，使用封保液封閉3次後定容至3ml。
[0085]
pⅲnp項目使用默克羧基磁珠(批號：m8727)、製備例4所製備得到的丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠、製備例3所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被後，磁吸加速3天並載機30min後的對比圖如圖5所示，可以看出，本發明修飾中使用的n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺得利於其較為伸展的空間結構，最終本發明修飾的羧基磁珠分散性明顯優於丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠和默克羧基磁珠(批號：m8727)，這是本發明修飾的羧基磁珠之間更大的空間位阻帶來的優勢。
[0086]
pⅲnp項目使用默克羧基磁珠(批號：m8727)、製備例4所製備得到的丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠、製備例3所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被後，平行放置4℃和37℃10天後，採用安圖生物a2000plus型號的儀器，檢測羧基磁珠進行pⅲnp抗原包被後的穩定性。
[0087]
穩定性結果如表3所示：
[0088]
表3pⅲnp磁微粒熱加速穩定性(r10為熱加速10天)
[0089][0090]
由表3可以看出：pⅲnp項目使用默克羧基磁珠(批號：m8727)、製備例4所製備得到的丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠、製備例3所製備得到的本發明修飾的羧基磁珠包被的熱加速穩定性依次變好，其中丙烯醯胺+丙烯酸修飾的羧基磁珠包被抗原後熱加速穩定性相比本發明修飾的羧基磁珠的熱加速穩定性仍有差距，本發明中使用的n-(3-氨基丙基)甲基丙烯醯胺修飾在磁珠表面後，由於它的碳鏈長度要比丙烯醯胺的長，因此二者修飾的羧基磁珠表面羧基基團之間的位阻是不一致的，本發明修飾的羧基磁珠化學連接率更高因此更加穩定。
[0091]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應
視為本發明的保護範圍。