鈉/鉀三磷酸腺苷酶及膽固醇相關的材料和方法

2023-09-23 20:21:30 2

專利名稱：鈉/鉀三磷酸腺苷酶及膽固醇相關的材料和方法
技術領域：
本發明涉及生物學、化學及醫學領域。本發明具體涉及與心血管疾病相關的離子轉運蛋白質、小的藥物活性分子、研究工具、診斷學、試劑盒及處理方法。影響膽固醇介導的心血管疾病的強心類固醇拮抗劑及組合物在本發明領域內。其他領域，如物理學及生物化學也為本發明提供了框架。
背景技術：
本發明部分基於對鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結構構象及功能的闡明，尤其是對新的結合位點及相互作用的闡明。本發明提供了 Na/K ATPase及與Na/KATPase相互作用的化合物之間的驚人的結構及功能關係的應用。本發明提供了解決方案，其在化學上影響了 Na/K ATPase相互作用以及已知的上遊和下遊的調節子。Na/K-ATPase起初是作為位於質膜內的活性離子轉運子發現的。功能性的Na/K-ATPase主要是由α和β亞基構成。α亞基為催化亞基，因為其包含配體及核苷酸結合位點。儘管其長期以離子轉運子為人所知，近期的研究表明Na/K-ATPase除了其離子泵功能外，還能夠進行多種其他功能。例如,發現Na/K-ATPase與Src激酶相互作用，形成功能性信號傳導複合物，能夠將細胞外信號轉導進入而激活細胞內激酶級聯。有趣的是，證明了進行信號傳導的Na/K-ATPase主要位於專門的質膜微結構域(稱為穴樣內陷(「小窩」))並與穴樣內陷標記物——窖蛋白-I蛋白質相互作用。窖蛋白-I蛋白質是一種 22-kD蛋白質，主要位於質膜中。除了其在穴樣內陷的生物形成中的作用外，已知其在細胞膽固醇體內平衡中起作用。已經證明其與膽固醇以1:1的比率相結合，並參與膽固醇在質膜和細胞內細胞器之間的運輸。進一步地，細胞膽固醇的耗盡使得窖蛋白-I重新分配至核周區域。在另一方面，Na/K-ATPase調控窖蛋白-I的細胞膜運輸。Na/K-ATPase α I的梯度敲除導致窖蛋白-I在穴樣內陷結構域內移動，並使得窖蛋白-I重新分配至核周區域。細胞膽固醇的耗盡使得Na/K-ATPase α I重新分配到穴樣內陷之外。發明概述在其他廣泛的實施方式中，提供了鑑定能夠調製細胞內膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括a.在膽固醇運輸測試模型中將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑑定步驟a.是否產生細胞內膽固醇濃度的調製。還提供了鑑定能夠調製質膜膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括a.在膽固醇運輸測試模型中將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑑定步驟a.是否產生細胞內膽固醇濃度的調製。優選的是上述權利要求的任何項，其中調製為細胞內膽固醇濃度的降低，其中測試模型為細胞培養物，其中測試模型為哺乳動物的，其中測試模型選自肝細胞；腎細胞；腦細胞；神經細胞；胰腺細胞；肺細胞；皮膚細胞；心臟細胞；齧齒動物細胞；人細胞；小鼠；大鼠；豚鼠；猴；以及人，其中測試模型選自以下的測試模型=NPCl病；病理性脂質積累；脈管疾病；心臟病；中風；超重；肥胖；糖尿病；代謝症候群；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關節硬化；心力衰竭；心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；亨廷頓病；泰薩二氏病；以及神經退行性疾病。
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還提供了鑑定能夠調製膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括a.將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑑定步驟a.是否產生對Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域的結合。優選的那些方法中，步驟a.是以選自體外和體內的形式完成的。還提供了影響細胞中膽固醇轉運的方法，包括影響Na/K ATPase的膽固醇結合活性。優選的是那些方法，其中Na/K ATPase的膽固醇結合活性以以下方式受到影響降低；增加；消除；階段性破壞；以及階段性增強。還提供了在需要這種改善的器官中改善由於病理性細胞內膽固醇累積導致的神經退行的方法,包括降低Na/K ATPase的膽固醇結合活性。還提供了治療Cl型Neumann Pick病的方法,包括專門降低Na/K ATPase結合膽固醇的能力，其中降低是以選自以下的方式完成的拮抗Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域；以及抑制Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域。還提供了鑑定能夠治療膽固醇相關疾病狀態的組合物的方法，包括a.將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑑定步驟a.是否產生對膽固醇結合Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域的能力的拮抗。優選的是所描述的那些方法，其中疾病狀態選自NPCl ;病理性脂質積累；脈管疾病；心臟病；中風；超重；肥胖；糖尿病；代謝症候群；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關節硬化 』心力衰竭;心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；亨廷頓病；泰薩二氏病；以及神經退行性疾病。還提供了在膽固醇運輸測試模型中下調Na/K ATPase的方法，包括在測試模型中耗盡質膜膽固醇濃度。還提供了在膽固醇運輸測試模型中將Na/K ATPase的α I亞基重新分配到細胞內區室的方法，包括在測試模型中耗盡質膜膽固醇濃度。還提供了在膽固醇運輸測試模型中影響窖蛋白-I的運輸和表達的方法，包括下調質膜的Na/K ATPase的α I亞基。還提供了治療NPCl病的方法，包括改變Na/K ATPase的α I亞基的表達，以改善NPCl病的症狀。本領域技術人員在參考附隨的圖示並閱讀以下優選實施方式的詳述本發明的多個方面後將清楚本發明的多個方面。附圖簡述本專利或申請文件可以包含一個或多個彩色圖片及/或一張或多張照片。帶有彩色圖片及/或照片的本專利或專利申請出版物的副本將由美國專利商標局在收到請求及必要的支付費用時進行提供。
圖I. Μβ -⑶引起的膜膽固醇的急性耗盡下調了 Na/K-ATPase α I。在無血清培養基中用IOmM M β-⑶處理LLC-PKl細胞，在37°C進行lh，洗滌，並在洗滌後的細胞於無血清培養基中培養0、6和24h後收集細胞。

圖1A.測量不同時間點的細胞裂解物中膽固醇含量，根據蛋白質水平進行調整並比較。圖1B.代表性的Western印跡顯示了 Na/K-ATPase α I、胰島素受體β亞基及α-微管蛋白(用作上樣對照)的水平。結合四次獨立的實驗得出定量數據，表示為平均值土SE. *，Ρ〈0. 05。圖1C.顯示了未處理細胞及Μβ-⑶處理的細胞中Na/K-ATPase α I的細胞內分布的代表性共聚焦圖像。圖2.慢性膽固醇耗盡下調了 Na/K-ATPase α I。將LLC-PK1細胞在含有10%FBS(對照)或10%無血清或10%無脂蛋白FBS的DMEM中培養48h，裂解並測量α I亞基以及α -微管蛋白，如圖2Α的圖所示，膽固醇情況在圖2Β中顯示。結合四次獨立的實驗得出定量數據，表示為平均值土 SE. *，Ρ〈0. 05。圖3.化合物U18666A耗盡質膜膽固醇並特異性下調Na/K-ATPase α I。圖3Α.將LLC-PKl細胞以不同劑量的U18666A處理24h，然後進行菲律賓菌素處理(上圖)及α I免疫染色(下圖)。代表性的圖片顯示了 U18666A化合物對膽固醇及Na/K-ATPase α I的細胞分配的劑量依賴性影響。圖3Β.三次獨立實驗的代表性Western印跡顯示了細胞處理48h後，U18666A對Na/K-ATPase α I、窖蛋白-I以及α -微管蛋白的影響(上圖)。三次獨立實驗的代表性Western印跡分別顯示了細胞受U18666A處理24h和48h後，U18666A對Na/K-ATPase α I、胰島素受體β亞基及α -微管蛋白的蛋白質水平的影響(下圖)。標尺20 μ m。U，U18666A。圖3C.細胞表面的Na/K-ATPase通過3H-烏本苷結合進行定量。圖4.膜膽固醇耗盡導致對Na/K-ATPase α I的細胞內吞。圖4Α.將LLC-PK1細胞以10 μ g/ml的U18666A處理24h。如本文所描述的方法提取總RNA並進行定量RT-PCR以探測α I和GAPDH的mRNA。數據來自三次獨立實驗。圖4B.在暴露於不同劑量的U18666A以24小時之前，將LLC-PKI細胞以IO μ g/ml放線菌酮處理Ih。然後固定細胞並就Na/K-ATPasea I進行免疫染色。顯示了代表性的共聚焦圖像。CHX，放線菌酮。U，U18666A。圖4C.在暴露於5 μ g/ml U18666A以另外的24h之前，將LLC-PKl細胞以YFP-a I轉染24h。將細胞固定並以菲律賓菌素對膽固醇進行染色，顯示了 YFP-a I、膽固醇的代表性共聚焦圖像和合併圖片。箭頭指向YFP-Ci I和膽固醇的共定位。相同的實驗重複至少三次。標尺20 μ m。圖4D.在暴露於5 μ g/ml U18666A以24h之前，將LLC-PKl細胞以RFP_rab7轉染24h。之後，固定細胞並以Na/K-ATPase α I進行免疫染色。顯示了 α I染色、RFP_rab7的代表性共聚焦圖像以及合併圖片。箭頭指向RFP_rab7和α I的共定位。相同的實驗重複至少三次。標尺20μηι。圖5. NBD-膽固醇直接與純化的Na/K-ATPase相互作用。從豬腎髓質中製備純化的Na/K-ATPase膜樣品(PKE )。圖5A. PKE樣品的SDS-PAGE凝膠顯示有兩條帶，Na/K-ATPasea I和β 1，如箭頭所顯示的。圖5Β.在4 °C下將PKE用IOmM Μβ-CD或IOmMM β -⑶/ImM膽固醇處理Ih。測量不同處理的PKE中的膽固醇含量。圖5C.膽固醇及NBD-膽固醇的結構示意圖。將Μβ-⑶處理的ΡΚΕ(200ηΜ)與不同劑量的NBD-膽固醇一同孵育。以473nm或295nm的激發在530nm處檢測NBD信號(圖OT)或FRET信號(圖5E)。顯示了三次獨立實驗中代表性的劑量依賴飽和曲線。NBD-CH，NBD-膽固醇。將62. 5nM的NBD-膽固醇與不同劑量的經Μβ -⑶處理的PKE —同孵育。以473nm或295nm的激發在530nm處檢測NBD信號(圖5F)或FRET信號(圖5G)。顯示了三次獨立實驗中典型的劑量依賴飽和曲線。圖5H.用GST下拉測定來純化GST和帶GST標籤的蛋白質。純化的蛋白質進行SDS-PAGE電泳並用考馬斯亮藍染色。顯示了代表性的考馬斯亮藍染色的凝膠。圖51.將62. 5nM NBD-膽固醇與不同劑量的純化的蛋白質一同孵育。以295nm的激發在530nm處檢測FRET信號。顯示了三次獨立實驗中典型的劑量依賴飽和曲線。圖5J.將IOOnM純化的蛋白質與不同劑量的NBD-膽固醇一同孵育。以295nm的激發在530nm處檢測FRET信號。顯示了三次獨立實驗中典型的劑量依賴飽和曲線。圖5K.將IOOnM PKE與30nM NBD-膽固醇相混合，然後加入不同劑量的膽固醇以競爭NBD-膽固醇對PKE的結合。顯示了 FRET信號，其為膽固醇劑量增加的結果。圖6.膽固醇調控的α I膜運輸和表達需要膽固醇/α I相互作用。將野生型大鼠α I-修復的細胞(圖6Α)或膽固醇結合結構域突變體大鼠α I-修復的細胞(圖6Β)以不同 劑量的U18666A化合物處理24h，並進行菲律賓菌素(上圖)和Na/K-ATPase α I (下圖)染色。標尺20μηι。圖6C.四次獨立實驗的代表性Western印跡顯示了 10 μ g/ml U18666A及不同劑量的TAT-CRAC對細胞處理24h後，LLC-PKl細胞中大鼠Na/K-ATPase α I以及α_微管蛋白的水平。定量數據顯示於下文，表示為平均值土S.E. 相比於未處理對照，p〈0. Ol0圖7.對BALB/cnpcnih/npcnih小鼠的靶標器官中Na/K-ATPase α I的下調。圖7Α.代表性Western印跡顯示了 NPCl敲除對腦Na/K-ATPase α I、α 2、α 3及胰島素受體β亞基的影響。在胰島素受體雜交中較低的條帶旁的星號表示非特異性條帶。圖7Β.顯示了 NPC1+/+和NPC1+/+小鼠的肝臟樣品中Na/K-ATPase α I和胰島素受體β的代表性Western印跡結果。來自5NPC1+/+和5NPC1+/+小鼠的所有Western印跡結果都進行定量，顯示於右圖並表示為平均值土SE. **，ρ〈0·01。發明詳述本發明人研究了細胞膽固醇耗儘是否導致細胞表面Na/K-ATPase α I的下調，隨後導致窖蛋白-I進行重新分配。在本發明中，發明者證明了質膜膽固醇的耗盡導致對Na/K-ATPasea I的細胞內吞及下調。如Cl型Niemann-Pick(NPCl)病中所顯示出的對細胞內膽固醇運輸的破壞與細胞表面Na/K-ATPase α I的耗盡相關。另外，Na/K-ATPase α I能夠通過其N末端膽固醇相互作用基序與膽固醇直接相互作用。α I-膽固醇相互作用影響膽固醇耗盡誘導的α 下調。最後，證明了 NPCl小鼠模型的肝臟和腦中的Na/K-ATPaseal有下調。由於已知Na/K-ATPase參與細胞生長及存活，因此本發明提供了新的解釋，將膽固醇運輸缺陷與NPCl病中大量的神經退行相關聯。本發明提供了質膜膽固醇調控細胞表面的Na/K-ATPase α I亞基含量這一發現的實際應用。質膜中膽固醇耗盡導致細胞表面α I的細胞內吞及降低。α I表達的降低不僅在體外培養的LLC-PKl細胞中觀察到，也在來自NPCl突變體小鼠的腦和肝細胞中得到體內的驗證。有趣的是，已知Na/K-ATPase對神經元細胞生長和存活至關重要。因此，這些發現為脂質儲存障礙如NPCl病中的神經退行效應的分子機制提供了新的解釋。細胞表面Na/K-ATPase受到質膜膽固醇的調控。膽固醇富集於專門的質膜脂質結構域——穴樣內陷中。維持穴樣內陷需要有膽固醇的存在，因為膽固醇耗盡導致穴樣內陷結構的破壞。此外，細胞表面膽固醇的降低動員穴樣內陷標記物窖蛋白-1，並將其從穴樣內陷重新分配至細胞質。上述膽固醇耗盡效應與Na/K-ATPase α I對穴樣內陷窖蛋白-I蛋白質的敲除效應有驚人的類似之處。因此，有人提出膽固醇耗盡可以下調細胞表面Na/K-ATPasea 1，後者有助於窖蛋白-I的重新分配。該命題得到本發明的數據的支持。例如，不管是細胞膽固醇的急性或慢性耗盡都導致Na/K-ATPase的下調(圖I和2)。此外，細胞內膽固醇運輸抑制劑U18666A (其破壞晚期內體/溶酶體和質膜之間的運輸)也下調細胞表面Na/K-ATPase α I (圖3)。由於U18666A處理的細胞中總細胞膽固醇未顯示顯著差異，因此這些結果清楚地表示是質膜膽固醇含量調控了細胞表面Na/K-ATPase。這種膽固醇耗盡效應似乎是特異性針對Na/K-ATPase α I的，因為胰島素受體表達水平並未改變(圖3Β)。在這一點上，檢查膽固醇耗盡如何下調細胞表面α I很有意義。免疫染色表明了在膽固醇耗盡時α I從細胞表面向細胞內區室的重新分配(圖IC和3Α)。這些觀察提示有兩種可能的情況或者是新合成的α I無法轉運到細胞表面，或者是表面α I在表面膽固醇耗盡後受到細胞內吞。隨後的研究指向第二種情況。首先，α I的轉錄在U18666A處理的 細胞中看上去很正常，因為mRNA水平未變化。第二，對蛋白質翻譯進行普遍的阻斷未阻止α I的重新分配。最後，α I在U18666A處理後與膽固醇以及晚期內體標記物Rab7共定位(圖4)。總而言之，這些數據有力地提示了質膜蛋白質庫調控細胞表面的α 含量。質膜膽固醇庫的降低導致對細胞表面αI的細胞內吞和下調。Na/K-ATPase α I直接與膽固醇相互作用，且膽固醇調控的α I細胞內吞依賴於α I-膽固醇相互作用。我們的之前的研究表明Na/K-ATPase α I和膽固醇之間的膜分布有相互調控；這兩種廣泛表達的分子可以直接相互作用。其他的研究顯示膜膽固醇含量影響了 Na/K-ATPase的活性，甚至有一項研究提出了 Na/K-ATPase和膽固醇之間有直接結合。然而，在本研究之前，缺少所述問題的直接證據。在本發明中，發明者相反地使用了 FRET分析以闡明該問題，並證明純化的豬腎Na/K-ATPase直接與膽固醇類似物——NBD-膽固醇相互作用(圖5)。本發明人進一步將膽固醇結合位點定位於α I亞基內的NT，並顯示了 CRAC基序對於結合是至關重要的(圖5)。有趣的是，似乎CRAC基序對於膽固醇調控的α I的細胞內吞很重要，因為定點誘變造成此基序的破壞使得α I對質膜膽固醇耗盡不敏感。進一步地，向細胞中加入膜通透性的CRAC肽保護α I使之不受U18666A的下調，這與上述觀點一致(圖6)。因為CRAC突變體α I正常定位在質膜內(圖6Β)，所以α I-膽固醇相互作用不大可能穩定細胞表面的Na/K-ATPase0相反，膽固醇可能加速Na/K-ATPase進入脂後的分選,這介導了 Na/K-ATPase的細胞內吞。有人提出脂筏(鞘脂類和膽固醇的集合體)對於蛋白質運輸中的蛋白質分選很重要。此外，顯示一種類型的脂筏——穴樣內陷能濃縮Na/K-ATPase並介導其內吞作用。考慮到本發明中的結果，令人信服的是α I-膽固醇相互作用是在應答多種信號時對Na/K-ATPase進行恰當的分選進入脂筏如穴樣內陷並產生隨後的細胞內吞作用的關鍵。Na/K-ATPase α I為潛在的質膜膽固醇感受子。作為所有哺乳動物中至關重要的分子，膽固醇水平受到細胞的嚴格調節。研究最多的細胞膽固醇調控機制包括處於ER膜內的HMG-CoA還原酶和SCAP-SREBP2複合物，它們的蛋白質豐度和活性依賴於ER膽固醇庫。然而，大多數細胞膽固醇在質膜中定位並起作用，ER膽固醇庫受到質膜膽固醇含量的控制。因此，有人提出存在質膜膽固醇感受子，其調控質膜和內膜之間的膽固醇運輸。本發明人研究了 Na/K-ATPase α I是否為質膜膽固醇感受子。首先，像膽固醇一樣，α I在所有哺乳動物中廣泛表達並主要定位於質膜內。第二，α I通過調控窖蛋白-I (一種參與細胞內膽固醇運輸的α蛋白質)的膜運輸而控制質膜和細胞內區室之間的膽固醇運輸。第三，膽固醇可與α I相互作用，且質膜膽固醇的耗盡下調其細胞表面的水平。最後，在體內α I的減少導致質膜膽固醇的降低，這隨後減少了 ER膽固醇庫，並激活SREBP2通路。因此，建立了 α 調控細胞膽固醇含量典型的負反饋循環。NPCl病中的Na/K-ATPase。NPCl病特徵為細胞內膽固醇在晚期內體/溶酶體中的積累，這被認為是由內膜和質膜間膽固醇運輸缺陷所導致。但是該疾病的主要問題在於中樞神經系統中大量神經元細胞的死亡。然而，還不很了解這兩個事件如何相聯繫。在另一方面，Na/K-ATPase是神經系統中一種至關重要的分子，因為其是維持靜止膜電位的主要驅動力之一。近期的研究已經表明其還調控細胞生長，並在細胞存活/細胞死亡中起關鍵作用。Na/K-ATPase α亞基中的突變與神經退行相聯繫。因為用U18666A處理細胞能模擬NPCl病的表型，U18666A對Na/K-ATPase α I的下調使得我們研究NPCl動物模型中的α I 表達水平。有趣的是，本發明人發現了 α I水平在NPCl突變體小鼠的腦和肝臟中都有下降(圖7)。該現象似乎特異性針對α I分子，因為另一種質膜信號傳導蛋白質(胰島素受體)的表達水平不受U18666A或NPCl突變的影響(圖3和7)。進一步地，NPCl腦中的其他兩種α異構體(α2和α 3)未顯示出顯著差異(圖7Α)。因此，NPCl腦中α I的特異性下調為細胞內膽固醇積累和神經退行之間的聯繫提供了新的可能的解釋。這提高了我們對細胞膽固醇代謝的認識，也促進了關於Na/K-ATPase α I作為治療神經退行疾病新型靶標的新的藥物開發。質膜膽固醇耗盡導致LLC-PKl細胞中Na/K-ATPase α I的下調。先前的研究已經表明細胞膽固醇或Na/K-ATPase的耗盡將窖蛋白_1重新分配至核周區域，且膽固醇的耗盡將Na/K-ATPase α I重新分配出穴樣內陷結構域。本發明人研究了細胞膽固醇水平的變化是否影響Na/K-ATPase的表達和重新分配，而調控合適的窖蛋白_1分配。首先，將細胞用膽固醇耗盡藥物環糊精(Μβ-⑶)進行處理。因為其對膽固醇有高的親和力，Μβ-⑶能夠特異性將膽固醇從質膜中抽取出來，這極大地降低了細胞表面膽固醇庫並重新分配窖蛋白-I。此外，本發明人實驗室先前的工作證明用IOmM M β-⑶在37 °C下處理LLC-PKl細胞30-60分鐘顯著地降低了質膜膽固醇庫。因此，本發明人在這些研究中使用了相同的條件。在M β -⑶處理耗盡細胞膽固醇後，本發明人洗去藥物並通過將細胞在無血清培養基中孵育來補充細胞膽固醇。然後，本發明人在不同時間點收集細胞裂解物並檢查蛋白質和膽固醇水平。如圖IA中所示，Μβ -CD造成的細胞膽固醇耗盡導致α I水平有 40%的降低。有趣的是，Μβ-CD處理還導致細胞膽固醇水平的類似的降低(圖1Β)。細胞恢復後6小時，α I和膽固醇還保持在類似的低水平，這表示細胞需要更長時間恢復。然而，細胞恢復24小時後，α I和膽固醇水平回到對照水平(圖IA和1Β)。應當注意的是α I和膽固醇水平的變化都顯示了在膽固醇耗盡和補充過程中類似的形式，這表明細胞α I水平與膽固醇水平正相關。此外，膽固醇耗盡對α I表達的影響不是對所有膜蛋白質的普遍影響，因為另一種質膜蛋白質胰島素受體在膽固醇耗盡和補充過程中沒有變化(圖IA和1Β)。為進一步驗證此結果，本發明人在Μβ-⑶的膽固醇耗盡後進行了 α 免疫染色。與Western印跡數據相一致，本發明人在來自Μβ-CD處理的細胞的質膜中檢測到了較低的α 信號。此外，本發明人在Μβ-CD處理的細胞中觀察到很多細胞內α I信號，這表示膽固醇耗盡導致α 重新分配到細胞內區室(圖1C)。上述數據表明急性膽固醇耗盡下調質膜的α I水平。為測試慢性膽固醇耗儘是否具有類似的效應，本發明人接著將細胞於作為對照培養基的正常培養基(加血清的DMEM)及無血清培養基(只有DMEM)或無脂蛋白培養基(加了物質蛋白血清的DMEM)中培養48小時。正如所預期的，在兩種膽固醇耗盡的培養基中培養細胞導致細胞膽固醇水平的減少(圖2Α)。因此，α I水平在兩種膽固醇耗盡的培養基中培養的細胞中有降低(圖2Β)。進一步地，α I和膽固醇水平在無脂蛋白培養基中顯示了類似的減少百分比再一次提示了 αI水平與細胞膽固醇水平正相關。為了進一步確認細胞表面膽固醇庫調控了質膜α 1，本發明人用細胞內膽固醇運輸抑制劑U18666A處理細胞。所述U化合物為一種破壞內膜和細胞表面之間細胞內膽固醇運輸的兩親分子，這導致膽固醇在晚期內體/溶酶體內的積累(模擬了 NPCl突變體細胞的表型)。用U18666A處理LLC-PKl導致游離膽固醇從質膜向細胞內區室的重新分配。α I信 號在質膜中減少但在細胞內區室中增加，這與膽固醇分布形式相關(圖3Α)。進一步地，U18666A對α I表達的下調是劑量和時間依賴性的(圖3Β)。與膽固醇耗盡類似，U化合物對α I表達的作用似乎不是對所有質膜蛋白質的普遍作用，因為胰島素受體含量在U18666A處理後保持不受幹擾(圖3Β)。最後，為確證U18666A下調了細胞表面α I,本發明人進行了 3Η-烏本苷結合測定。結果驗證了質膜膽固醇的減少導致細胞表面α I的下調(圖3C)。最後，與表面α I調控窖蛋白-I的運輸和表達這一觀點一致，U18666A也下調了窖蛋白-I的蛋白質水平(圖3Β)。總而言之，這些數據證明αI蛋白質水平受到質膜膽固醇水平的調控。質膜膽固醇耗盡導致Na/K-ATPase α I的細胞內吞。為探索質膜膽固醇耗盡對α I分布及表達的作用的分子機制，本發明人進行了下列實驗。首先，對於α I下調的一個可能的解釋是質膜膽固醇耗盡降低了 α I的合成。為測試這種可能性，本發明人從對照及U18666A處理的細胞中提取總mRNA並進行定量PCR分析。如圖4A所示，a ImRNA水平相對於對照未顯示出差異，這表示質膜膽固醇耗儘可能不影響α I的從頭合成。另一個可能性是其破壞了新合成的α I從內質網向質膜的運輸。因此，其局限在特定的細胞區室內，因為本發明人在Μβ-CD和U18666A處理的細胞中觀察到更多的細胞內α I信號(圖IC和3Α)。為測試這種可能性，本發明人在向細胞加入U18666A之前用蛋白質合成抑制劑環糊精處理細胞。如圖4Β所示，環糊精阻斷蛋白質從頭合成沒有阻止U18666A誘導的α I向細胞內區室的重新分配。此結果表明U18666A可能誘導了細胞表面α I的內化作用。因為U18666A的處理也導致了膽固醇在細胞內區室的積累(圖3Α)，本發明人下一步檢查了 α I和膽固醇是否局限在相同的細胞區室。對游離膽固醇的染色操作流程需要與αI的那些不同的固定試劑，而且不可能在相同視野中觀察膽固醇和內源αI二者。為了解決這個問題，本發明人用YFP-α I轉染LLC-PKl細胞，隨後進行U18666A處理和膽固醇染色。這些結果證明在U18666A處理後大多數內化的α I與游離膽固醇共定位(圖4C，箭頭指向共定位區域)。根據文獻，U18666A處理導致游離膽固醇在晚期內體/溶酶體中的積累。因此，本發明人研究了 αI是否受到細胞內吞併與膽固醇一同在晚期內體/溶酶體中積累。本發明人在加入U18666A之前用RFP標籤的Rab7 (晚期內體/溶酶體的標記物)對LLC-PKl細胞進行瞬時轉染。如圖4D中所示，在未處理的對照細胞中大多數位於質膜內，沒有檢測到α I和Rab7之間的共定位。然而，U18666A處理導致了大量的細胞內α I積累，其中大多數明顯的與Rab7信號共定位(箭頭指向共定位區域)。這確認了在U18666A處理時α I積累於晚期內體/溶酶體之內。總而言之，在LLC-PKl細胞中通過阻斷其細胞內運輸而造成的質膜膽固醇耗盡不僅誘導了 αI的細胞內吞，還導致αI在晚期內體/溶酶體內的積累。Na/K-ATPase α I能夠在體外通過N末端膽固醇結合基序與膽固醇直接相互作用。如本發明人先前證明的，質膜中的Na/K-ATPase α I調控細胞膽固醇分布。在另一方面，本研究的數據顯示質膜膽固醇也調控Na/K-ATPase α I的膜分布。因此，本發明人研究了這兩種廣泛表達的分子是否與彼此有直接的相互作用。為測試這項命題，本發明人首先使用一種已經建立很好的方法從豬腎外髓質獲得細胞膜片段內的純化的Na/K-ATPase。
為確保此方法能有效地運行，將純化的豬腎酶(PKE )樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳並用考馬斯亮藍溶液對膠進行染色。如圖5A所示，在膠中檢測到兩條帶，具有Na/K-ATPase α I和β I的對應大小。進一步的Western印跡分析確認了上方條帶代表α I亞基而下方條帶代表β I亞基(數據未顯示)。由於純化的細胞膜片段含有大量膽固醇，其可能已經飽和了 Na/K-ATPase上的結合位點，所以大多數膽固醇成分由Μβ -CD抽取出來(圖5Β)。為研究Na/K-ATPase和膽固醇之間的結合，使用一種膽固醇類似物，25-[N-[ (7-氮-2-1，3-苯並惡二唑-4-基)甲基]氨基]-27-降膽甾醇(NBD膽固醇)進行結合測定。NBD-膽固醇在之前就用於研究蛋白質-膽固醇相互作用。和膽固醇不同，NBD-膽固醇當在473nm處激發時能夠發射峰在 530nm處的螢光信號，因為在C25位置處的甲基基團被NBD基團取代(圖5C)。在水溶液中，其螢光大部分淬滅了。然而當其結合於蛋白質並暴露於疏水環境時，螢光信號會增加。此外，其具有比膽固醇(30nM)更高的臨界微團濃度( 650nM)，這樣，在結合測定中可使用較高濃度的NBD-膽固醇。將200nM的PKE與不同劑量的NBD-膽固醇一同孵育並測量NBD螢光信號，觀察到NBD-膽固醇的劑量依賴性飽和曲線(圖OT)。Kd值為100nM-200nM。膽固醇競爭了NBD-膽固醇和純化的PKE之間的結合(圖5K)。為進一步驗證這些結果代表了脂類-蛋白質相互作用而不是脂類-脂類相互作用，本發明人測量了螢光共振能量轉移(FRET)信號。當NBD-膽固醇結合於蛋白質時，胺基酸色氨酸可在295nm處激發並且在 350nm處發射，這與NBD-膽固醇的激發譜相重疊。在將PKE與NBD-膽固醇一同孵育並在295nm處激發Trp後，本發明人在530nm處檢測到FRET信號的NBD-膽固醇劑量依賴性飽和曲線(圖5E)。為驗證這些結果，本發明人將62. 5nM的NBD-膽固醇與不同濃度的PKE —同孵育。與前述實驗相一致，將NBD-膽固醇與PKE —同孵育產生了 NBD信號(圖5F)和FRET信號(圖5G) 二者的PKE劑量依賴性飽和曲線。總而言之，這些觀察表明純化的Na/K-ATPase能夠在體外直接與NBD-膽固醇相互作用。為進一步解析Na/K-ATPase中的膽固醇結合位點，本發明人搜索文獻並發現在大多數已知的膽固醇結合蛋白質中都鑑定有一段膽固醇識別/相互作用胺基酸序列及一致模式(CRAC)。隨後的研究進一步表明CRAC負責膽固醇結合且將CRAC中間的關鍵胺基酸Tyr突變完全消除了其的膽固醇結合親和力。在本發明人搜索人Na/K-ATPase α I的一級序列時，發現在N末端結構域(NT)內有一個CRAC (Leu51-Arg61)且此CRAC基序在哺乳動物種屬之間是高度保守的。為測試NT是否是Na/K-ATPase-膽固醇相互作用的關鍵因素，本發明中首先將穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)標籤連接於NT肽並通過GST下拉測定法純化GST-NT (圖5H)。然後進行了如圖5E NBD-膽固醇結合測定。如圖51和5J所顯示的，GST自身不誘導出FRET信號，而GST-NT誘導了劑量依賴性的FRET信號飽和曲線，表明NT具有膽固醇結合親和力。進一步地，本發明人將CRAC中間的胺基酸Tyr53突變為Ser53並且進行了同樣的NBD-膽固醇結合測定。有趣的是，突變體NT-Y53S未顯示出膽固醇結合親和力。這表明NT中的CRAC是膽固醇結合的關鍵因素。Na/K-ATPase α I的CRAC對於膽固醇調控的α I膜運輸至關重要。前節的數據表明Na/K-ATPase α I的NT能夠在體外通過CRAC與膽固醇相互作用。因此，探索CRAC是否在膽固醇耗盡誘導的α I細胞內吞中起作用很有意義。首先，本發明人用U18666A處理野生型大鼠α I修復的細胞——AAC-19，並對α I和膽固醇二者進行染色。如圖6Α所示，LLC-PKl細胞中的野生型大鼠α I與內源豬α I作用相同(圖3Α)。質膜膽固醇的耗盡以劑量依賴的形式導致α I的細胞內吞作用。接著，本發明人通過定點誘變方法將大鼠a ICRAC中關鍵的Tyr55(對應豬α I中的Tyr53)突變為Ser55並生成穩定的突變體大鼠α I修復的細胞系(PY-17-Y55S)。在細胞系建立時，本發明人對其進行了在AAC-19細胞上進行的相同實驗。有趣的是，與野生型大鼠α I相反，所述Y55s突變體大鼠α I未顯示對U18666A處理的應答的明顯細胞內吞作用(圖6Β)。為確認這些發現，本發明人合成了具有陽性電荷的前導肽HIV-TAT的CRAC，將其標記於CRAC的N末端以使TAT-CRAC肽具有細胞通透性。理論上，將TAT-CRAC肽加入細胞可能通過競爭抑制打斷內源α I和膽固醇之間的結合。如圖6C所示，TAT-CRAC肽以劑量依賴的形式修復了 U18666A引起的α I下調作用。總而言之，膽固醇調控的Na/K-ATPase α I膜運輸依賴於膽固醇-α I相互作用。Na/K-ATPase α I在NPCl突變體小鼠的肝臟和腦中下調。如上文提到的，兩親化合物U18666A對細胞的處理導致NPCl-樣表型。U18666A處理的細胞中Na/K-ATPase α I的下調促使我們檢測此作用是否在生理學上於NPCl疾病相關。因為NPCl疾病是一種脂類儲存障礙並顯示有顯著的中樞神經系統的神經退行，所以本發明人聚焦於兩種最相關的器官腦和肝臟。如圖7Α所示，Na/K-ATPase α I蛋白質表達水平在NPC-/-小鼠腦中下降了 大約40%，這與我們前面的體外數據相一致。因為腦細胞表達α亞基的三種異構體，所以本發明人檢測了 α2和α3的蛋白質水平。α2水平有少量但不顯著的增加，而α 3在對照與NPCl小鼠腦中未顯不任何差異。進一步地，與前文數據相一致，胰島素受體蛋白質水平在NPCl小鼠腦中沒有改變(圖7Α)。因此，似乎NPCl病中的膽固醇運輸缺陷特異性影響α I的表達。最後，發現了 α 水平在NPCl小鼠肝細胞中也減少至一半，而胰島素受體未顯示出明顯的差異(圖7Β)。然而，α I下調的作用似乎為器官特異性的，因為心臟和腎臟中的α I水平未顯示出顯著差
巳
實施例
實施例I.材料細胞培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Invitrogen。抗體及其來源如下用於Western印跡分析的小鼠單克隆抗-Na/K-ATPase α I抗體(a6F)購自愛荷華大學的發育研究雜交瘤細胞庫(Developmental Studies Hybridoma Bank)。用於免疫細胞化學的小鼠單克隆抗-Na/K-ATPase α I 抗體購自 Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid,NY)。小鼠單克隆抗-胰島素受體β亞基抗體、兔多克隆抗-窖蛋白-I抗體、小鼠單克隆抗_α -微管蛋白抗體及所有二抗來自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)。兔多克隆抗-Na/K-ATPase α 2抗體(HERED)及兔多克隆抗-Na/K-ATPase α 3抗體由德克薩斯科技大學的 Thomas A. Pressley 博士惠贈。Optitran 硝酸纖維素膜來自 Schleicher&Schuell。增強型化學發光SuperSignal試劑盒購自Pierce。Μ β -⑶、環糊精和菲律賓菌素獲自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。U18666A 化合物來自 Cayman Chemical (Ann Arbor,MI)。Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen。Amplex Red Cholesterol Assay Kit 購自Molecular Probes, Inc. (Eugene, 0R)o [3H]烏本苷來自 PerkinElmer Life Sciences(Waltham, MA)。NBD-膽固醇來自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)。QuikChange 定點誘變試劑盒獲自Stratagene (La Jolla，CA)。TAT-CRAC肽是高純度(>95%)合成的。通過高效液相色譜質譜確定其特性及純度。細胞培養LLC-PKl細胞獲自美國模式培養物保藏中心。大鼠α I修復的Na/K-ATPase α I敲除細胞(AAC-19)以及窖蛋白-結合基序突變體大鼠α I修復的Na K-ATPase α I敲除細胞(mCBM)衍生自如前文所描述的LLC-PKl細胞。所有細胞都培養於含有10%胎牛血清、青黴素(100 單位 /ml) / 鏈黴素(100 μ g/ml)的 Dulbecco's modified Eagle’s 培養基(DMEM)中，在5%C02-增溼培養箱中培養。除非另有說明，在細胞達到100%融合度時，將其進行24小時的血清飢餓並用於實驗。質粒構建物及轉染大鼠a ICRAC突變體(Tyr55至Ser55)是通過在如前文所生成的pRc/CMV-alAACml質粒上進行基於PCR的定點誘變而產生。然後使用相同的先前描述的操作流程建立Y55S突變體α I敲入細胞系。pEYFP-a I質粒是按之前描述的方法生成的。RFP_rab7質粒獲自WWW. addgene. org。表達GST融合蛋白質的質粒構建物是按前文所描述的方法由PGEX-4T-1而製備的。GST-NT (Alal至Serl60)和GST-NT-Y55S表達載體基於豬腎Na/K-ATPasea I亞基的序列而構建。所有構建物都通過DNA測序得到確認。在轉染時，使細胞生長到大約70%的融合度並按前文所述的方法使用Lipofectamine 2000轉染對應的質粒。隨後的實驗在轉染後34小時進打。實驗動物BALB/c 遺傳背景的 NPCl+/-小鼠購自 The Jackson Laboratory。NPCl+/+ 和NPCl-/-小鼠是通過交配兩隻NPCl+/-小鼠產生的。從尾巴活檢組織獲得DNA並用於基於PCR的基因分型。所有小鼠在12-h的黑夜/白天循環中生長並自由攝取標準食物。所有動物實驗都在同窩小鼠間進行。所有步驟都得到託雷多大學醫學院校區的學院動物飼養和使用委員會的認可。所有小鼠都在10周齡時處死，小心地解剖出包括腦、肝臟、心臟和腎臟的器官，並進行稱重。所有組織立即冷凍於液氮並儲存於_80°C用於進行Western印跡分析。
實施例2.方法Μβ -⑶的細胞膽固醇耗盡以及恢復使LLC-PKl細胞在6cm培養皿中生長至100%融合度，並進行24小時的血清飢餓。然後對細胞用IOmM M β-⑶處理I小時。下一步，將Μβ-⑶從細胞中移除，讓細胞在DMEM中分別恢復0、6、24小時，然後在RIPA緩衝液中用細胞刮刮下細胞。用細胞裂解物進行蛋白質測定及Western印跡分析。Western 印跡分析細胞裂解物及組織勻漿的蛋白質濃度使用來自Bio-Rad (Hercules, CA)的Protein Assay Kit進行測量。將等量的蛋白質加樣至凝膠並在10%的SDS-PAGE上分離，轉移至Optitran膜，並用對應的抗體進行探測。用ECL試劑盒檢測蛋白質信號。通過免費軟體Image J對Western印跡條帶的灰度進行分析。 免疫細胞化學Na/K-ATPase α I的染色按先前描述的方法進行。簡言之，將細胞進行24小時的血清飢餓並在蓋玻片上進行處理。然後用冰冷的甲醇對細胞進行30min的固定並用來自Invitrogen的Signal Enhancer進行封閉。接著，將細胞與單克隆抗-Na/K-ATPase α I抗體在4°C孵育過夜。用PBS洗滌三次，加入二抗Alex 488-綴合的抗小鼠抗體並在室溫孵育3小時。洗滌蓋玻片，並封片，用Leica共聚焦顯微鏡拍照。膽固醇測定及菲律賓素染色膽固醇測定及菲律賓素染色是按Chen等人Regulation of intracellularcholesterol distribution by Na/K-ATPase. Journal Biological Chemistry, Volume284，pages 14881-14890(2009)的方法進行的。[3H]烏本苷結合[3H]烏本苷結合是按 Tian 等人在 Changes in sodium pump expressiondictate the effects of ouabain on cell growth, Journal of Biological Chemistry,14921-1429(2009)中描述的方法進行的。定量RT-PCR對Na/K-ATPase α I和GAPDH的mRNA水平進行定量RT-PCR，是按照Tian等人在 Changes in sodium pump expression dictate the effects of ouabain on cellgrowth, Journal of Biological Chemistry, 14921-1429 (2009)中描述的方法進行的。NBD-膽固醇結合測定NBD-膽固醇結合測定是按 Petrescu 等人 Steroidogenic acute regulatoryprotein binds cholesterol and modulates mitochondrial membrane sterol domandynamics, Journal Biological Chemistry, Volume 276, pages 36970-36982 (2001)中描述的方法進行。Na/K-ATPase和GST-融合蛋白質的純化使用Jorgensen方法從豬腎外髓質中純化出Na/K-ATPase。GST-融合蛋白表達於大腸埃希氏菌BL21 (Invitrogen)中並使用穀胱甘肽珠子進行純化。用洗脫緩衝液(IOmM還原性穀胱甘肽，0. l%Triton X_100，50mM Trish，pH 8. 0)將可溶的GST-融合蛋白質從穀胱甘肽珠子上洗脫。將洗脫液在包含0. l%Triton X-100,50mM Tris-HCl，pH 8. O的緩衝液中透析移除殘留的穀胱甘肽。統計學分析數據表示為平均值土S. E0使用學生t檢驗進行統計學分析，在p〈0. 05時的顯著性可接受。實施例3.對可能調製細胞內膽固醇的測試組合物的測定本發明人從對照和U18666A-處理的細胞中提取總mRNA並進行定量PCR分析。如圖4A所示，α I的mRNA水平相比於對照沒有差異，這表明質膜膽固醇耗儘可能不影響α 的從頭合成。在一項獨立的實驗中，本發明人還在U18666A加入細胞之前對細胞進行蛋白質合成抑制劑環糊精的處理。如圖4Β所示，環糊精阻斷蛋白質從頭合成並未阻止U18666A誘導的α I向細胞內區室的重新分配。該結果表明U18666A可能誘導細胞表面α I的內化作用。 因為U18666A處理也導致膽固醇在細胞內區室的積累(圖3Α)，所以本發明人下一步檢查了αI和膽固醇是否局限在相同的細胞區室。對游離膽固醇的染色操作流程需要與α 的那種不同的固定試劑，而且不可能在相同視野中觀察膽固醇和內源α 二者。為了解決這個問題，本發明人用YFP-α I轉染LLC-PKl細胞，隨後進行U18666A處理和膽固醇染色。這些結果表明在U18666A處理後大多數內化的α I與游離膽固醇共定位(圖4C，箭頭指向共定位區域)。在一項獨立的實驗中，本發明人還在加入U18666A之前用假RFP標籤的Rab7 (晚期內體/溶酶體的標記物)對LLC-PKl細胞進行瞬時轉染。如圖4D中所示，在未處理的對照細胞中大多數α I位於質膜內，沒有檢測到α I和Rab7之間的共定位。然而，U18666A處理導致了大量的細胞內α I積累，其中大多數明顯的與Rab7信號共定位(箭頭指向共定位區域)。這確認了在U18666A處理時α I積累於晚期內體/溶酶體之內。實施例4.對可能調製質膜膽固醇的測試組合物的測定首先，將細胞用膽固醇耗盡藥物B-環糊精(Μβ_⑶)進行處理。因為其對膽固醇有高的親和力，Μβ -CD能夠特異性將膽固醇從質膜中抽取出來，這極大地降低了細胞表面膽固醇庫並重新分配窖蛋白-I。此外，本發明人實驗室的先前的工作表明用IOmM Μβ-CD在37°C下處理LLC-PKl細胞30-60分鐘顯著地降低了質膜膽固醇庫。因此，本發明人在這些研究中使用了相同的條件。在用Μβ -⑶處理耗盡細胞膽固醇後，本發明人洗去藥物並通過將細胞在無血清培養基中孵育補充回細胞膽固醇。然後，本發明人在不同時間點收集細胞裂解物並檢查蛋白質和膽固醇水平。如圖IA中所示，Μβ -⑶造成的細胞膽固醇耗盡導致α I水平 40%的降低。有趣的是，Μβ-CD處理還導致細胞膽固醇水平的類似的降低(圖1Β)。細胞恢復後6小時，α I和膽固醇還保持在類似的低水平，這表示細胞需要更長時間恢復。然而，細胞恢復24小時後，α I和膽固醇水平回到對照水平(圖IA和1Β)。應當注意的是α I和膽固醇水平的變化在膽固醇耗盡和補充過程中都顯示了類似的形式，這表明細胞αI水平與膽固醇水平正相關。此外，膽固醇耗盡對α I表達的影響不是對所有細胞膜蛋白質的普遍影響，因為另一種質膜蛋白質胰島素受體在膽固醇耗盡和補充過程中沒有變化(圖IA和1Β)。為進一步確認此結果，本發明人在Μβ_⑶的膽固醇耗盡後進行了 α I免疫染色。與Western印跡數據相一致,本發明人在來自Μβ -CD處理的細胞的質膜中檢測到了較低的α I信號。此外，本發明人在Μβ-CD處理的細胞中觀察到很多細胞內α I信號，這表示膽固醇耗盡導致α I重新分配到細胞內區室(圖1C)。上述數據表明急性膽固醇耗盡下調質膜的α I水平。為測試慢性膽固醇耗儘是否具有類似的效應，本發明人接著將細胞於作為對照培養基的正常培養基(加血清的DMEM)及無血清培養基(只有DMEM)或無脂蛋白培養基(加了物質蛋白血清的DMEM)中培養48小時。正如所預期的，在兩種膽固醇耗盡的培養基中培養細胞導致細胞膽固醇水平的減少(圖2Α)。因此，α I水平在兩種膽固醇耗盡的培養基中培養的細胞中降低(圖2Β)。進一步地，α I和膽固醇水平在無脂蛋白培養基中顯示了類似的減少百分比再一次提示了 αI水平與細胞膽固醇水平正相關。為了進一步確認細胞表面膽固醇庫調控了質膜α 1，本發明人用細胞內膽固醇運輸抑制劑U18666A處理細胞。所述U化合物為一種破壞內膜和細胞表面之間細胞內膽固醇運輸的兩親分子，這導致膽固醇在晚期內體/溶酶體內的積累，模擬了 NPCl突變體細胞的表型。用U18666A處理LLC-PKl導致游離膽固醇從質膜向細胞內區室的重新分配。α I信 號在質膜中減少但在細胞內區室中增加，這與膽固醇分布形式相關(圖3Α)。進一步地，U18666A對α I表達的下調是劑量和時間依賴性的(圖3Β)。與膽固醇耗盡類似，U化合物對α I表達的效應似乎不是對所有質膜蛋白質的普遍影響，因為胰島素受體含量在U18666A處理後保持不受幹擾(圖3Β)。最後，為確證U18666A下調了細胞表面α 1，本發明人進行了 3Η_烏本苷結合測定。結果驗證了質膜膽固醇的減少導致細胞表面α I的下調(圖3C)。最後，與表面α I調控窖蛋白-I的運輸和表達這一觀點一致，U18666A也下調了窖蛋白-I的蛋白質水平(圖3Β)。雖然本發明的描述中參考了多種的及優選的實施方式，然而本領域技術人員應當理解的是可以做出多種變化，而且等價物可以置換其中的成分而不偏離本發明的本質範圍。此外，可作出許多修飾以使具體的情況或材料能適合於本發明的教義，而不偏離其本質範圍。因此，不預期的是將本發明限制在本文公開的用於實行本發明的具體實施方式
，而是本發明會包括所有符合權利要求範圍的實施方式。本文用來闡明本發明或提供關於本發明時間的其他細節的出版物和其他材料通過引用併入本文，簡便起見，將其在下文的參考目錄中提供。本文提到的任何文檔的引用不預期為認可前述的任何項為相關的在先技術。關於這些文檔日期的所有陳述或對其內容的表示都是基於申請人可得的信息，不包含任何對這些文檔的日期或內容正確性的認可。
權利要求
1.鑑定能夠調製細胞內膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括 a.在膽固醇運輸測試模型中將測試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑑定步驟a.是否產生細胞內膽固醇濃度的調製。
2.鑑定能夠調製質膜膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括 a.在膽固醇運輸測試模型中將測試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑑定步驟a.是否產生細胞內膽固醇濃度的調製。
3.上述任何一項權利要求的方法，其中的調製為細胞內膽固醇濃度的降低。
4.上述任何一項權利要求的方法，其中測試模型為細胞培養物。
5.上述任何一項權利要求的方法，其中測試模型為哺乳動物。
6.上述任何一項權利要求的方法，，其中測試模型選自肝細胞；腎細胞；腦細胞；神經 細胞；胰腺細胞；肺細胞；皮膚細胞；心臟細胞；齧齒動物細胞；人細胞；小鼠；大鼠；豚鼠；犬；猴；以及人。
7.權利要求5的方法，其中測試模型選自以下的模型NPC1病；病理性脂質積累；脈管疾病；心臟病；中風；超重；肥胖；糖尿病；代謝症候群；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關節硬化；心力衰竭；心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；亨廷頓病；泰薩二氏病；以及神經退行性疾病。
8.鑑定能夠調製膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括 a.將測試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑑定步驟a.是否產生對Na/KATPase的α I亞基的CRAC結構域的結合。
9.權利要求8的方法，其中步驟a.是以選自體外和體內的形式完成的。
10.影響細胞中膽固醇運輸的方法，包括影響Na/KATPase的膽固醇結合活性。
11.權利要求10的方法，其中Na/KATPase的膽固醇結合活性以以下方式受到影響降低；增加；消除；階段性破壞；以及階段性增強。
12.在需要這種改善的器官中改善由於病理性細胞內膽固醇累積導致的神經退行的方法，包括降低Na/K ATPase的膽固醇結合活性。
13.治療Cl型NeumannPick病的方法，包括降低Na/K ATPase結合膽固醇的能力。
14.權利要求13的方法，其中降低是以選自以下的方式完成的拮抗Na/KATPase的α I亞基的CRAC結構域；以及抑制Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域。
15.鑑定能夠治療膽固醇相關疾病狀態的組合物的方法，包括 a.將測試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑑定步驟a.是否產生對膽固醇結合Na/KATPase的α I亞基的CRAC結構域的能力的拮抗。
16.權利要求15的方法，其中疾病狀態選自NPC1;病理性脂質積累；脈管疾病；心臟病；中風；超重；肥胖；糖尿病；代謝症候群；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關節硬化；心力衰竭；心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；亨廷頓病；泰薩二氏病；以及神經退行性疾病。
17.在膽固醇運輸測試模型中下調Na/KATPase的方法，包括在測試模型中耗盡質膜膽固醇濃度。
18.在膽固醇運輸測試模型中將Na/KATPase的α I亞基重新分配到細胞內區室的方法，包括在測試模型中耗盡質膜膽固醇濃度。
19.在膽固醇運輸測試模型中影響窖蛋白-I的運輸和表達的方法，包括下調質膜的Na/K ATPase 的 a I 亞基。
20.治療NPCl病的方法，包括改變Na/KATPase的a I亞基的表達，以改善NPCl病的症狀。
全文摘要
本發明部分基於鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結構構象及功能的闡明,尤其是對新的結合位點及相互作用的闡明。本發明提供了Na/K ATPase及與Na/K ATPase相互作用的化合物之間的數種驚人的結構及功能關係的應用。這些結構和關係的公開提供了對在化學上影響Na/K ATPase相互作用以及已知的其上遊和下遊的調節子的理解及解決方案。
文檔編號A61K31/704GK102858346SQ201180010295
公開日2013年1月2日 申請日期2011年1月13日 優先權日2010年1月13日
發明者謝子建, 陳逸良, 王浩傑 申請人:託萊多大學