一種補料發酵生產輔酶Q₁₀的方法

2023-09-23 14:45:05 1

專利名稱：一種補料發酵生產輔酶Q10的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種補料發酵生產輔酶Q1Q的方法。
背景技術：
輔酶Q^別名癸烯醌、泛酮、萬有醌，英文名Coenzyme Q1Q，簡稱Cc^。，為脂溶性酮類 化合物，化學名稱2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌。分子式C59H9。04 ;CAS號
303-98-0 ;化學結構式^^-^11^^^^^^.性質黃色或淺黃色結晶性粉
末。易溶於氯仿、苯和四氯化碳，溶於丙酮、乙醚，微溶於乙醇，不溶於水和甲醇。遇光易分 解。 輔酶Qw在動植物、微生物細胞內與線粒體內膜相結合，是呼吸鏈中重要遞氫體， 是一種有效的生化藥物，具有重要的生理作用，近年來已被廣泛應用於各類心臟病、糖尿 病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治療。此外，在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性 牙周炎以及促進胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。最近，研究發現CoQ,具有抗衰老 作用，從而將其應用擴展到化妝品和保健品領域，使其在國內外的需求進一步擴大。
CoQ1Q的製備方法主要有五種 1、半合成法目前開發的半合成法工藝是以對甲基苯酚為原料通過溴代，醚化、氧 化獲得甲基二甲氧基苯醒，然後與從菸草或馬鈴薯葉子中提取茄呢醇縮合得到輔酶Qi。。該 方法的關鍵是如何將側鏈連接到母環上。 2、全合成法1988年Eem和Kanan開發的全合成法生產輔酶Qw工藝是目前唯一 成功的全合成法技術，但是由於合成線性不飽和側鏈存在一定難度，以及合成條件苛刻，與 工業化還有一定的距離。 3、發酵法1977年實現了微生物發酵法生產輔酶Q^。這種生產工藝被認為是最有 前途的合成工藝，近幾年來微生物發酵法成為國內外開發的熱點。紅極毛桿菌、脫氮極毛杆 菌，甲烷微環菌等是生產輔酶Q1Q的主要菌種。 4、植物細胞培養法植物細胞培養技術是將植物體的某一部分經過無菌處理後， 置於人工培養基上使其細胞增殖，進而按需要進行培養的技術。植物的各個部位，如根、莖、 葉、花、果、花葯和花粉等都可以作為外植體來啟動細胞培養，所形成的脫分化細胞團稱為 愈傷組織，將愈傷組織轉移到液體培養基中進行培養稱為懸浮培養。 5、生物提取法(1)醇一鹼皂化製造法該工藝輔酶Q1Q的收率為61. 2mg/kg新鮮 豬心，這是國內普遍採用工藝。在乙醇的存在下，長時間的皂化可能導致輔酶Qw中的甲氧 基和乙醇中乙氧基換位，生成單或雙乙氧基衍生物，為了避免這些雜質的生成。可以用K0H 代替NaOH和甲醇皂化，但也必須加入焦性沒石子酸，否則輔酶Q1Q在皂化過程中全部被破 壞，加入量佔起始原料的5% _7%，皂化過程中可以通入氮氣。(2)醇一醚混合提取法該工 藝醇一鹼皂化製造法工藝相似，只是省去了皂化反應。 總的來說化學合成法合成步驟繁多，條件苛刻，副產物含量多，提純成本高；並
3且合成產物為順反異構體的混合物，生物活性低，要合成生物活性高的CoQ1Q尚未達到工業 化生產的程度。生物提取法中動植物CoQ1Q含量低，而且各種化學成份複雜，並受原料和來 源限制，因此產品成本高，價格昂貴，規模化生產受到了一定限制。植物細胞培養法周期長， 產率低，而且生產成本高，不利於工業化生產。相比之下利用微生物發酵法生產CoQw有幾 個基本優點(l)發酵產物為天然品，生物活性好，易被人體吸收；(2)沒有原材料的制約， 可通過規模放大提高生產能力。如能選擇合適菌株進行誘變選育，選育性能優良的菌種，同 時優化發酵工藝，使菌種的Co(^。。生產水平提高，生產成本就會大幅度下降。因此，微生物 生產CoQ1Q在工業化生產上更為看好。

發明內容
本發明的目的是提供一種補料發酵的方法來生產CoQw。 本發明技術人員經長期研究發現紅色酵母菌HY-05能用於發酵生產C0Q1Q，並能高 密度發酵。研究表明，蔗糖是酵母菌HY-05發酵生產C0Q1Q的較佳碳源，但濃度過高會抑制 CoQw合成。玉米漿中含有多種胺基酸、生物素、蛋白質等成分，可提供細胞生長所需的氮， 並可作為CoQ1Q合成的促進劑，但研究表明，玉米漿起始濃度過高不利於CoQ1Q發酵。本發明 以補料分批培養的方式較好的解決了此問題。
具體發酵方法如下所示
1、種子培養 從活化斜面上挑取一環菌體接入種子培養基，28°C ， 240r/min培養24h。種子培養 基(％):蔗糖2.0，蛋白腖1.0，酵母粉1.0;自然pH。
2、搖瓶培養 菌種在平板上28t:培養48h後，接入種子培養基(20mL/250mL錐形瓶)，28t:振蕩 培養2處後，以2%接種量接入發酵培養基(40mL/500mL錐形瓶)，26t:振蕩培養72h。發酵 培養基(% ):蔗糖4.0，蛋白腖2.8，腿2 040. 13 ;PH= 5.0。
3、補料分批培養 5L發酵罐裝液量3L，接種量2 % ，發酵溫度26 °C ， pH5. 5 6. 5為宜，攪拌速度 300r/min。在發酵前期可通過轉速和通氣量控制溶解氧在50 %左右，從發酵第24h開始，在 減速流加20%蔗糖溶液的同時以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米漿，保持溶解氧的濃度在 35X左右，48h時終止發酵。 本發明用補料發酵的方法，生產出的Co(^。明顯優於分批發酵，並且補料方式、補 加底物的量都影響著CoQ1Q的合成量。當底物消耗速率較高，細胞生長較快時，CoQ1Q的合 成速率較低，在細胞生長的穩定期CoQ1Q合成繼續進行。細胞的生長與CoQ1Q的合成屬於半 耦聯型，底物的流加必須兼顧細胞生長和產物的合成。採用補料分批發酵方式不僅可減少 底物的反饋抑制，而且可增大發酵過程中的溶氧，進一步提高CoQw的合成量。玉米漿中含 有嘌呤類、硫氨素、苯丙氨酸、纈氨酸等多種成分，可作為Co(^。合成的促進劑提高產物的合 成。從發酵第24h開始，在減速流加蔗糖的同時以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米漿，CoQ1Q 的積累可達到最大為156. 2mg/L，與不補料相比產量提高了 58. 1%。
與現有CoQ1Q生產方法相比，本發明具有如下有益效果
1、所用發酵菌株紅色酵母菌HY-05為安全性菌株；
2、所用發酵培養基及相關原料價廉易得，可降低發酵成本；
3、發酵溫度適中，發酵條件要求低；
4、發酵所得單位產量高。
權利要求
一種生產輔酶Q10的方法，採用補料發酵法生產，其特徵在於發酵所採用的菌種為紅色酵母菌HY-05。
2. 根據權利要求1所說補料發酵的方法，其特徵在於，所述發酵方法具體包括如下步驟① 種子培養從活化斜面上挑取一環菌體接入種子培養基，28t:，240r/min培養24h。 種子培養基(％):蔗糖2.0，蛋白腖1.0，酵母粉1.0;自然pH。② 搖瓶培養菌種在平板上2『C培養48h後，接入種子培養基(20mL/250mL錐形瓶)， 28t:振蕩培養24h後，以2%接種量接入發酵培養基(40mL/500mL錐形瓶)，26。C振蕩培養 72h。發酵培養基(% ):蔗糖4. 0，蛋白腖2. 8， KH2P040. 13 ;pH = 5. 0。③ 補料分批培養接種量為2%，發酵溫度26°C， pH5. 5 6. 5為宜，攪拌速度300r/ min。在發酵前期可通過轉速和通氣量控制溶解氧在50%左右，從發酵第24h開始，在減速 流加20%蔗糖溶液的同時以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米漿，保持溶解氧的濃度在35% 左右，48h時終止發酵。
全文摘要
本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種補料發酵法生產輔酶Q10。本發明採用紅色酵母菌HY-05用於發酵生長輔酶Q10，並用玉米漿補料分批發酵，在減少底物的反饋抑制同時，增大發酵過程中的溶氧，進一步提高輔酶Q10的合成量，發酵成本低。
文檔編號C12P7/24GK101760484SQ200810162759
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者吳菁 申請人:吳菁