一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法
2023-09-23 13:13:05
專利名稱：一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物領域，更具體涉及一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因 組的方法。
背景技術：
植物DNA的提取與動物不同，植物細胞與組織具有較硬的細胞壁，往往含有大量 的RNA、蛋白質、多糖、單寧和色素等雜質，這些問題給DNA的提取與純化帶來許多困難。在 實際操作中，大多數蛋白質可通過酚、氯仿等處理後變性、沉澱除去，絕大部分RNA可通過 RNase A除去。但多糖類雜質一般較難去除，這些雜質濃度高時，常常使DNA提取物呈膠狀， 低濃度下也會干擾後續操作及分光光度法對核酸的定量分析。因此，獲得高質量、高純度的 DNA是分子生物學研究的基礎。在大多數植物的DNA提取方法中，CTAB法和SDS法是目前 最為常用的兩種方法。然而不同植物由於具體內含物含量不同，在實際操作過程中，往往要 在原有方法基礎上加以改進方能得到高質量的DNA。甘蔗是禾本科甘蔗屬植物，原產於熱帶、亞熱帶地區。甘蔗是一種高光效的植物， 不僅是食糖業的重要原料，而且是能源、纖維、糖基化工和飼料的原料。目前，甘蔗種質資 源包括甘蔗原種、地方品種、雜交品種以及甘蔗的野生近緣植物、育種中間材料等。近幾十 年來由於優良種質的研究貧乏，可利用雜交親本少，後代都可以追朔到幾個有限的親本，所 以得到的後代親緣關係近，遺傳背景狹窄，使甘蔗育種日益面臨「瓶頸效應」，限制了甘蔗產 業的進一步發展。隨著分子生物學的快速發展，對甘蔗的研究已深入到分子水平，以PCR為 基礎的多種分子標記技術如隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡單重複序列(simple sequence r印eats，SSR)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphisms, AFLP)等已經廣泛應用於甘蔗的遺傳多樣性、種植資源 評價、指紋圖譜建立、性狀連鎖標記與輔助選擇等研究，而開展這些研究的基礎是獲得高質 量、高純度的DNA。由於甘蔗富含多糖、纖維、酚類、醌類、色素等物質，所以甘蔗DNA的粗提 物中經常出現蛋白質、多糖、色素等雜質，抽提過程褐化明顯，提取的DNA存在濃度不高、純 度低等缺陷。目前，國內外已經建立了多種提取甘蔗DNA的方法，其中，最常採用的是液氮 研磨法，在研缽中加入液氮快速研磨，由於甘蔗葉片韌度高，所以一般要加入液氮多次，直 到葉片粉末顏色出現由綠變白的磨碎特徵為止。這個過程耗力、耗時、不經濟又繁瑣，每天 提取的樣品數量非常有限；另外，由於一些分子分析方法如PCR對汙染非常敏感，提取大批 量材料時重複使用研缽往往會引起嚴重問題。隨著分子生物學的高速發展和適應不同研究 目的需要，提取DNA方法向著快速、簡便、高效方向發展，現在已經出現了很多在傳統的SDS 法、CTAB法基礎上的改良方法。但是這些方法偏重於提高製備DNA樣品的質量，效率仍然 很低，每天研磨的樣品數量有限，當樣品量多時經常需要數人一起操作，效率有待提高。美 國一些研究單位目前採用球磨機提取DNA方法，效率可達每人每天上百份樣品。為了克服 常規方法製備DNA模板存在的諸多不足，農業部甘蔗遺傳改良重點開放實驗室從美國引進 了球磨機配套提取DNA方法，以期高通量製備植物組織DNA，但在使用過程中出現了一些問題，主要是引進的球磨機配套提取DNA方案剪切葉片操作不方便，剪碎的葉片常常易散落 管外；處理時間長，損傷葉片易褐化；主要適用於溫室或苗圃小苗期的幼嫩葉片，對於韌度 高、代謝旺盛的成熟甘蔗葉片效果不好；球磨機配套提取DNA方案中規定的葉片重量是200 mg，但一半以上甘蔗葉片無法磨碎，降低了提取的效率；球磨機配套提取DNA方案中採用美 國Crosman公司生產的鋼珠，購買不方便，且放置較長時間後易生鏽，常使DNA著色；打磨時 間2 min得到的DNA片段長度短，疑與研磨時間過長有關。綜上所述，引進的球磨機提取DNA配套方案可能是一種通用的植物DNA提取方案， 該方法直接應用於甘蔗葉片基因組DNA提取時，存在不太適應的現象，表現在上述提到的 葉片前處理、葉片用量、研磨時間、鋼珠類型等方面均存在問題，導致提取的基因組DNA純 度和濃度都很低，因此，需要針對甘蔗的特殊性進行分離技術的優化。
發明內容
本發明提出一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，針對甘蔗的特殊 性進行分離技術的優化，從而克服了目前製備甘蔗DNA模板存在的磨樣麻煩、提取量低、純 度不高等缺點。該發明的具體操作步驟為(1)根據樣品數量，往1-45個2 mL的離心管中每管 放入1粒4 mm直徑不鏽鋼珠子；(2)取50_100mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置 於液氮中預凍30 min-45 min ；(3)取出後迅速放入_20°C預凍的球磨機配套45孔研磨支 架上，在球磨機裡打磨30 s-40 s，取出離心管置於冰上；(4)往各離心管中加人1.0 mL經 65°C預熱的2 %CTAB提取緩衝液；(5)將離心管在65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒 混合一次離心管；(6)每管加入SOOyL酚氯仿異戊醇混合液(體積比25 24 1)， 顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min，取800 μ L上清液轉移到 新的離心管中(可重複抽提一次)；(7)加入佔上清液2/3體積的-20°C預冷的異丙醇，顛倒 混合，12，000 r/min離心10 min，棄上清液，或將離心管置於_20°C冰櫃中1 h，用乾淨tip 頭或牙籤挑出絮狀DNA ； (8)加入體積濃度為75 %乙醇600-1000 μ L，顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2_3 min,棄上清液(重複一次);(9)DNA完全晾乾後加入100 μ L雙蒸水或TE溶 解，-20°C保存備用。上述所用球磨機為美國BioSpec Products, Inc.生產的 Mini-Beadbeater 96 或其它原理相同的通過改變磁場引致金屬珠子高速往復運行的研磨儀器；所用直徑4mm不 鏽鋼珠子為鋼製珠子，可以在球磨機內高速往復運動；葉片用量為50-100mg，不宜太多或 太少，否則研磨不徹底或提取DNA量少；球磨機裡打磨時間在30 s-40 s左右，不宜太長， 否則DNA易降解，步驟4)中所添加的提取緩衝液由2 % CTAB,20 mmol/L EDTA，0. lmol/L Tris-HCl, 1. 4mol/L NaCl 組成，pH=8. 0。本發明針對甘蔗葉片的特點，通過優化實驗操作步驟，建立了方便、快速的球磨機 高通量提取甘蔗DNA技術，為大批量甘蔗樣品的PCR檢測、Southern雜交等提供高質量的 DNA模板，具有以下優點
1)適用範圍廣大田生長的甘蔗葉片或溫室幼嫩甘蔗葉片均可用本方法提取DNA；
2)操作簡便易行葉片用量是一個範圍，根據預先稱量估算出60mg-100mg葉片的大 致面積，之後帶一次性手套，直接撕下大約面積的葉片即可；3)交叉汙染率低由於不需要剪碎處理，既簡化了實驗，又有效地降低或避免了交叉汙 染的發生；
4)取樣量少一次取樣量不超過100毫克，對受試材料傷害很小，不會對其生長造成影 響，完全可以滿足受試材料活體分析的需要。5)效率高球磨機配套45孔研磨支架一般情況下配4個，還可以根據需要增加； 從帶一次性手套、撕下大約面積的葉片，到放入2 mL的離心管，整個過程不足半分鐘；所以 制一板45個樣品不足半小時；進行液氮預凍的時間，可繼續進行下一板45個樣品的製備； 打磨只需要30秒，即可加入提取緩衝液進入DNA提取過程。每人每天可製備多達500份甘 蔗葉片樣品用於提取DNA ；而傳統手工液氮研磨提取DNA方法樣品前處理需要剪碎葉片、手 工研磨、分裝、清洗烘乾研缽等步驟，手工研磨還需要多次加入液氮，費時費力，每人每天最 多製備幾十個甘蔗葉片樣品。改進的方法顯然大大提高了效率。
圖1，2為性能測試圖。圖1為不鏽鋼珠研磨效果左圖為研磨效果，右圖為氯仿異戊醇抽提效果。圖2為DNA提取效果圖60mg甘蔗葉片DNA電泳分析，Ma :TIANGEN, D15000 ； 1,2,3,4,5,6 :DNA 樣品。
具體實施例方式本發明利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的具體實施步驟為(1)根據樣品數 量，往1-45個2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不鏽鋼珠子；(2)取50-100mg的 新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置於液氮中預凍30 min-45 min ； (3)取出後迅速放 入-20°C預凍的球磨機配套45孔研磨支架上，在球磨機裡打磨30 s-40 s，取出離心管置於 冰上；(4)往各離心管中加人1. 0 mL經65°C預熱的2 %CTAB提取緩衝液；(5)65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液 (體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min, 取800 μ L上清液轉移到新的離心管中(可重複抽提一次)；(7)加入2/3體積-20°C預冷的 異丙醇，顛倒混合，12，000 r/min離心10 min，棄上清液；(8)加入75 %乙醇600-1000 μ L， 顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2-3 min,棄上清液(重複一次)；(9) DNA完全晾乾後加入 100 μ L雙蒸水或TE溶解，-20°c保存備用。以下是本發明根據權利要求的幾個實施例，進一步說明本發明，但是本發明不僅 限於此。實施例1
利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的具體實施步驟為(1)根據樣品數量，往20個 2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不鏽鋼珠子；(2)取50mg的新鮮甘蔗葉片放入各 離心管中，蓋緊置於液氮中預凍30 min ；(3)取出後迅速放入-20°C預凍的球磨機配套45 孔研磨支架上，在球磨機裡打磨30 s，取出離心管置於冰上；(4)往各離心管中加人1.0 mL 經65°C預熱的2 %CTAB提取緩衝液；(5) 65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次 離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液(體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min，12，000 r/min離心10 min，取800 μ L上清液轉移到新的離心管 中(可重複抽提一次);(7)加入2/3體積_20°C預冷的異丙醇，顛倒混合，12，000 r/min離心 10 min，棄上清液；(8)加入75 %乙醇600 μ L，顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2-3 min, 棄上清液(重複一次)；(9) DNA完全晾乾後加入100 μ L雙蒸水或TE溶解，_20°C保存備用。實施例2
(1)根據樣品數量，往35個2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不鏽鋼珠子；(2) 取75mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置於液氮中預凍38 min ； (3)取出後迅速放 入_20°C預凍的球磨機配套45孔研磨支架上，在球磨機裡打磨35s左右，取出離心管置於 冰上；(4)往各離心管中加人1. 0 mL經65°C預熱的2 %CTAB提取緩衝液；(5)65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液 (體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min,取 800 μ L上清液轉移到新的離心管中(可重複抽提一次)；(7)加入2/3體積_20°C預冷的異 丙醇，顛倒混合，12，000 r/min離心10 min,棄上清液；(8)加入75 %乙醇800 μ L，顛倒清 洗DNA，12，000 r/min離心2-3 min，棄上清液(重複一次);(9)DNA完全晾乾後加入IOOyL 雙蒸水或TE溶解，_20°C保存備用。實施例3
(1)根據樣品數量，往45個2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不鏽鋼珠子；(2) 取IOOmg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置於液氮中預凍45 min ;(3)取出後迅速放 入_20°C預凍的球磨機配套45孔研磨支架上，在球磨機裡打磨40 s左右，取出離心管置於 冰上；(4)往各離心管中加人1. 0 mL經65°C預熱的2 %CTAB提取緩衝液；(5)65°C水浴40 min,期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿異戊醇混合液 (體積比25 24 1)，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min, 12, 000 r/min離心10 min, 取800 μ L上清液轉移到新的離心管中(可重複抽提一次)；(7)將離心管置於-20°C冰櫃中 1 h，用乾淨tip頭或牙籤挑出絮狀DNA於一新的離心管中；(8)加入75 %乙醇1000 μ L， 顛倒清洗DNA，12，000 r/min離心2_3 min,棄上清液(重複一次)；(9) DNA完全晾乾後加入 100 μ L雙蒸水或TE溶解，-20°c保存備用。
權利要求
一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特徵在於具體實施步驟如下(1)根據樣品數量，往1 45個2 mL的離心管中每管放入1粒4 mm直徑不鏽鋼珠子；(2)取50 100mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置於液氮中預凍30 min 45 min；(3)取出後迅速放入 20℃預凍的球磨機配套45孔研磨支架上，在球磨機裡打磨30 s 40 s，取出離心管置於冰上；(4)往各離心管中加人1.0 mL經65℃預熱的提取緩衝液；(5)將離心管在65℃水浴40 min，期間每隔5 min顛倒混合一次離心管；(6)每管加入800μL酚﹕氯仿﹕異戊醇混合液，三種溶劑的體積比25﹕24﹕1，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10 min，12,000 r/min離心10 min，取800μL上清液轉移到新的離心管中，可重複抽提一次；(7)加入佔上清液2/3體積的 20℃預冷的異丙醇，顛倒混合，12,000 r/min離心10 min，棄上清液，或將離心管置於 20℃冰櫃中1 h，用乾淨tip頭或牙籤挑出絮狀DNA；(8)加入體積濃度為75%乙醇600 1000μL，顛倒清洗DNA，12,000 r/min離心2 3 min，棄上清液，重複操作一次；(9)DNA完全晾乾後加入100μL雙蒸水或TE溶解， 20℃保存備用。
2.根據權利要求1所述的一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特徵 在於所用球磨機為美國BioSpec Products, Inc.生產的Mini-Beadbeater 96或其它原理 相同的通過改變磁場引致金屬珠子高速往復運行的研磨儀器。
3.根據權利要求1所述的一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特徵 在於所用直徑4 mm不鏽鋼珠子為鋼製珠子，可以在球磨機內高速往復運動。
4.根據權利要求1所述的一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特徵 在於葉片用量為50-100mg，不宜太多或太少，否則研磨不徹底或提取DNA量少。
5.根據權利要求1所述的一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特徵 在於球磨機裡打磨時間在30 s-40 s，不宜太長，否則DNA易降解。
6.根據權利要求1所述的一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特 徵在於所述步驟4)中的提取緩衝液由2 % CTAB,20 mmol/L EDTA，0. lmol/L Tris-HCl, 1. 4mol/L NaCl 組成，pH=8. 0。
全文摘要
一種利用球磨機高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，是針對甘蔗的特殊性利用球磨機對其葉片基因組DNA進行分離的技術。利用球磨機改變磁場使金屬珠子一次對多個甘蔗葉片樣品進行研磨的特點，優化了鋼珠直徑、液氮預處理時間、葉片用量、研磨時間等參數，建立了一種適合大批量提取甘蔗葉片基因組的方法。方法的主要步驟包括取樣、預凍、研磨、化學抽提等步驟。該方法克服了目前製備甘蔗基因組DNA存在的磨樣費時費力、操作繁瑣、葉片用量大、交叉汙染率高、效率低等缺點，具有適用範圍廣，簡便快速、汙染率低、取樣量少等優點，特別適宜於大批量快速製備甘蔗葉片基因組。
文檔編號C12N15/10GK101899435SQ20101026584
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者方靜平, 王恆波, 許莉萍, 陳如凱, 陳平華, 陳由強 申請人:福建農林大學