採用N－丙烯醯化多糖生產用作疫苗的免疫原性β－丙醯胺基－聯多糖蛋白綴合物的製作方法

2023-09-23 03:21:45

專利名稱：採用N－丙烯醯化多糖生產用作疫苗的免疫原性β－丙醯胺基－聯多糖蛋白綴合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫原性β-丙醯胺基-聯(propionamido-1inked)多糖蛋白綴合物以及由細菌、酵母或癌細胞生產所述綴合物的方法。所述綴合物可用作疫苗。
背景技術：
革蘭氏陽性菌如鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、利斯特氏菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)和梭菌屬(Clostridium)細菌以及由革蘭氏陰性菌如嗜血菌屬(Haemophilus)、志賀氏菌屬(Shigella)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)細菌和某些類型的大腸桿菌(Escherichia coli)引起的細菌感染在整個全球的發病率非常高。這一現象結合細菌對抗生素的抗藥性的不斷升高，說明需要開發細菌疫苗。例如，鏈球菌是一大類不同類型的革蘭氏陽性菌，已根據其細胞壁多糖的抗原性和結構將鏈球菌分成幾個組(26，27)。其中兩組與人類的嚴重感染有關。A組鏈球菌引起各種感染性疾病，包括「鏈球菌咽喉」、風溼熱、鏈球菌性膿庖病和膿毒症。B組鏈球菌是美國及發展中國家重要的產期致病菌(37)。
革蘭氏陰性菌也是重要的致病因素。在近期開發以及應用直接抗b型流感嗜血菌(Hib)的多糖蛋白疫苗之前，Hib細菌感染是造成多數嬰幼兒精神發育遲緩的原因。腦膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)和大腸桿菌(E.coli)K1感染引起新生兒腦膜炎。已將革蘭氏陰性菌-大腸桿菌的菌株與嚴重疾病包括由於食用被大腸桿菌腐壞的肉類而導致的死亡聯繫在一起。
當所述多糖與另一種免疫原性分子如多肽或蛋白質結合時，將其用於誘生對各種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌應答的抗體。多糖或寡糖與多肽的結合可將對多糖或寡糖的免疫應答從典型的T細胞非依賴性轉換成T細胞依賴性的應答。
先有技術公開了多糖與蛋白質的直接結合和間接結合以形成綴合物(總結於參考文獻(11)和美國專利第5,306,492號中)。綴合方法包括將多糖結合到蛋白載體上的重氮結合(diazo coupling)、硫醚鍵、醯胺化作用、還原性胺化作用和硫代氨基甲醯基結合。
Geyer等描述了通過還原性胺化作用和衍生糖利用偶氮基結合的連接作用使某些肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的莢膜多糖片段綴合到硝基苯基-乙胺接頭上(Med.Microbiol.Immunol,165171-288(1979))。
McIntire描述了通過與滷醯滷(haloacyl halid)反應將大腸桿菌(Escherichia coli)的減毒性脂多糖共價結合於蛋白質抗原上(美國專利第4,057,685號)。
Jennings等描述了通過還原性胺化作用產生多糖-蛋白綴合物(美國專利第4,356,170號)。
Anderson描述了免疫原性的綴合物的製備，該綴合物含有從肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)或流感嗜血菌(H.influenzae)的莢膜聚合物中衍生的免疫原性莢膜多糖片段的還原性胺化產物和作為蛋白載體的細菌毒素或類毒素，所述胺化產物含有通過諸如用高碘酸鹽氧化裂解或水解糖苷鍵製備的還原性末端(美國專利第4,673,574、4,761,283和4,808,700號)。
Hillman等描述了多糖-蛋白綴合物的製備，其製備方法是用溴化氰活化b型流感嗜血菌(H.influenzae)的多糖，用間隔分子6-氨基己酸衍生化所述活化多糖以及用水溶性碳化二亞胺綴合腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的主要外膜蛋白以通過6-氨基己酸間隔分子與所述多糖的複雜多樣的連接形成與所述蛋白質的醯胺型連接(美國專利第4,459,286號)。
Gordon描述了水溶性多糖-白喉類毒素的共價綴合物，其中用溴化氰活化純淨b型流感嗜血菌的多糖並立即與已用ADH間隔分子衍化的白喉類毒素混合(美國專利第4,965,338號)。
Tsay等描述了通過4-12個碳原子部分將革蘭氏陰性細菌的去毒多糖與同一種革蘭氏陰性細菌的去毒蛋白質共價結合(美國專利第4,663,160號)。
Gordon描述了致病性細菌如B型流感嗜血菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏菌和大腸桿菌的多糖分子與T細胞依賴性抗原如白喉類毒素和破傷風類毒素之間的綴合物(美國專利第4,619,828號)。
Porro等描述了具有三價免疫原性活性的糖蛋白綴合物疫苗，它含有革蘭氏陽性細菌的莢膜多糖的抗原決定簇以及CRM197、或破傷風類毒素或百日咳毒素(美國專利第4,711,779號)。
Porro描述了寡糖-載體蛋白綴合物，其製備方法是使具有末端還原基團的寡糖與二氨基甲烷在吡啶硼烷存在下的反應使得產生還原性胺化作用，使所述胺化寡糖產物與具有兩個官能基團的分子反應，然後將該活化的寡糖產物與蛋白載體反應(美國專利第5,306,492號)。
Kuo等描述了含有從b型流感嗜血菌的莢膜多糖衍化而來的氧化多聚核糖基-核糖醇-磷酸多糖片段的還原性胺化產物和b型流感嗜血菌的外膜蛋白的多糖-蛋白綴合物(美國專利第5,192,540號)。
歐洲專利公開第EP 0747063 A2號描述了含有多唾液酸衍化物和連接到載體分子的異雙功能(heterobifunctional)連接分子的修飾莢膜多糖。使用所述連接物可使1個多糖最多N-烷基化約5個唾液酸殘基。然後用丙酸酐(proprionic anhydride)或醋酸酐醯化其餘氨基基團。
因此需要更有效、產率更高而且更簡單的獲得純化免疫原性多糖-蛋白綴合物的方法，以大規模生產免疫原性多糖-蛋白綴合物疫苗。
發明概述本發明為一種免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-和β-丙醯胺基-聯寡糖-蛋白綴合物。
本發明目的之一是提供一種製備免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的方法，該方法比目前使用的方法更好。本發明的另一目的是提供得自免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的藥用組合物、疫苗和其它免疫學試劑。
所提供的製備免疫原性多糖-蛋白綴合物的方法包括通過鹼法或酶法水解使多糖或寡糖的脫-N-乙醯化，隨後經過對所述N-去乙醯基多糖進行N-丙烯醯化作用(acryloylation)。所述N-丙烯醯化的多糖與載體蛋白直接偶聯形成免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物。
按照本發明通過水解連接多糖和其它細胞成分的鹼不穩定鍵或通過酶性水解，可從細菌、酵母或哺乳動物細胞上清液或直接從細菌、酵母或哺乳動物細胞提取莢膜多糖和細胞表面多糖。通過水解從所述多糖去除的一定比例的N-乙醯基由N-丙烯醯基代替，它再直接與蛋白偶聯形成本發明的綴合物。
一方面，本發明提供了在多個位點直接與蛋白偶聯的寡糖和多糖。
另一方面，本發明是一種免疫哺乳動物對抗細菌或酵母感染或抗腫瘤的方法，其包括給予所述哺乳動物有效量的本發明的疫苗來預防致病微生物感染或癌症。
再一方面，本發明是一種使用β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物在哺乳動物體內激發產生抗體的方法，該方法保護所述哺乳動物免於感染或疾病。
本發明的另一方面是應答用β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的免疫接種時產生的免疫球蛋白和分離的抗體。這種免疫球蛋白和分離抗體可用作治療藥物和診斷試劑。
附圖簡述

圖1.圖示製備免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的方法。
發明詳述本發明是一種可用作抗細菌感染、酵母感染的免疫原和疫苗以及癌症治療藥物的新型多糖-蛋白綴合物和寡糖-蛋白綴合物。用於形成免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的多糖或寡糖得自多糖或寡糖的來源，該來源包括但不限於革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌、酵母、癌細胞或癌組織等，其中在它們逃逸宿主防禦機制時所述多糖或寡糖對所述細胞起毒性因子作用。通過在蛋白上Michael-型加成親核位點使N-丙烯醯化多糖與蛋白直接偶聯形成本發明的所述多糖-蛋白綴合物。
利用鹼或酶水解連接所述多糖或寡糖與所述細胞成分的鍵可從多種來源包括革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、酵母、癌細胞或它們的重組形式獲得多糖或寡糖。通過將所述生物體或細胞或者含有所述生物體或細胞碎片的溶液與鹼或酶接觸，可以從所述生物體或細胞提取多糖或寡糖。在通過多種方法的鹼或酶水解後，可回收多糖或寡糖。按照本發明使用的革蘭氏陽性細菌和其重組菌株的非限制性實例有鏈球菌屬(Streptococci)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、腸球菌屬(Enterococci)、桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、利斯特氏菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)和梭菌屬(Clostridium)細菌。具體地說，更優選使用鏈球菌屬細菌，最優選使用Ia、Ib、II、III、IV、V和VIII型B組鏈球菌。用於本發明的革蘭氏陰性細菌和其重組菌株的非限制性實例包括流感嗜血菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。具體地說，更優選使用b型流感嗜血菌、B、C、Y和W135型腦膜炎奈瑟氏球菌、大腸桿菌K1及大腸桿菌K92。用於本發明的酵母的實例包括但不限於新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)。用於本發明的癌細胞或癌組織的實例包括但不限於小細胞肺癌、成神經細胞瘤、乳腺癌、結腸癌等。
通過本領域已知的方法按照本發明能使用多種條件在水性或有機溶劑中水解多糖或寡糖。可通過反應條件控制水解所述碳水化合物的N-乙醯鍵的程度。在一個實施方案中，水解去除至少約50％的N-乙醯基，優選去除約50％-100％，更優選去除約90％或以上的天然N-乙醯基。在一個具體實施方案中，用水解試劑處理從所述多糖水解約95％或以上的N-乙醯基。
適合鹼提取的莢膜多糖為缺乏任何不能被取代的鹼不穩定取代基(如決定免疫原性的O-乙醯基)的多糖。適合鹼提取的其它莢膜多糖是缺乏磷酸二酯鍵的多糖和缺乏4-連接的鈾酸殘基的多糖。
在鹼水解的一個優選實施方案中，從B組鏈球菌(GBS)提取所述莢膜多糖(CPS)。在一個最優選的實施方案中，從Ia、Ib、II、III、V和VIII型GBS提取所述CPS。
在另一鹼水解的優選實施例中，從肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)提取所述CPS。在更優選的鹼水解實施例中，從III、IV和XIV型肺炎鏈球菌提取所述CPS。
在另一鹼水解的優選實施方案中，從奈瑟氏球菌屬或埃希氏菌屬提細菌取所述CPS。在一個更優選的鹼提取的實施方案中，從B、C、Y或W135型腦膜炎奈瑟氏球菌、大腸桿菌K1或大腸桿菌K92提取所述CPS。
適合酶法去乙醯基的多糖是那些缺乏任何決定免疫原性的酶不穩定性取代基的多糖，其中所述取代基不能被免疫原性部分替代或取代，這些多糖包括但不限於GBS等。A.N-丙烯醯化多糖的製備1.多糖的去乙醯基作用a).原材料採用本領域已知的標準方法，使用鹼水解或酶法水解從濃縮的細菌、酵母、哺乳動物細胞或這些細胞的重組形式或者從勻漿細胞的上清液或條件培養基中可以獲得多糖或寡糖。通過本領域已知的標準方法可以分離和純化所述多糖或寡糖。市售的分離及純化的多糖或寡糖也用作原料。
分離多糖的方法依賴於具體使用的多糖。通常的方法是使用離子型去汙劑與帶電多糖絡合。沉澱並分離所述絡合物。然後將所述絡合物溶於高離子強度的溶液如氯化鈣中，再用乙醇沉澱所述多糖。
所獲得的用於本發明的分離並純化的多糖和寡糖優選含有少於1％核酸及蛋白質雜質以用於人類。由於存在無機鹽，純化後常常觀測到碳水化合物的純度為80-100％。b).鹼法水解能用鹼處理所述純化的多糖或寡糖來去除所述N-乙醯基。按照本發明可以使用的鹼的非限制性實例為NaOH、KOH、LiOH、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3、KCN、Et3N、NH3、H2N2H2、NaH、NaOMe、NaOEt或KOtBu。諸如NaOH、KOH、LiOH、NaH、NaOMe或KOtBu的鹼在0.5N-5.0N的範圍使用最有效。諸如NaHCO3、Na2CO3、K2CO3和KCN的鹼能可以其能溶解的最高濃度使用。只要存在實現水解的諸如水或乙醇的試劑，可使用中至高(50-100％)濃度的有機鹼，諸如Et3N。諸如NH3或H2N2H2的鹼幾乎能以任何濃度包括100％的濃度使用。溶劑如水、醇類(優選C1-C4醇)、二甲亞碸、二甲基甲醯胺或這些溶劑的混合物和其它有機溶劑也可使用。最優選含水的鹼溶液。
從所述多糖或寡糖去除N-乙醯基的最有效的pH範圍是大約9-14，最佳pH是12左右。隨後用本領域已知的標準方法通過使用膜或透析的超純化從剩下的試劑中純化所述N-去乙醯化多糖。c).酶法水解可使用N-脫乙醯基酶從多糖或寡糖中酶法去除N-乙醯基。在一個實施方案中，在參考文獻47、48和49中描述了可用於從多糖或寡糖中去除N-乙醯基的N-脫乙醯基酶。在酶法水解中，在合適的pH和溫度條件下將所述多糖或寡糖和脫乙醯基酶與合適的酶緩衝系統混合併使其反應足夠時間以去除N-乙醯基。在一個實施方案中，於37℃下將多糖和脫乙醯基酶與合適的酶緩衝系統(例如，50mMMES、10nM MnCl2，pH6.3)混合60分鐘以形成N-脫乙醯基的多糖。使用合適的終止溶液(例如1M一氯乙酸、0.5M NaOH、2M NaCl)或通過使用合適的緩衝溶液稀釋終止該反應。2.多糖的N-丙烯醯化作用所述多糖或寡糖的鹼或酶法水解導致從所述多糖或寡糖的唾液酸和氨基糖殘基去除N-乙醯基。在水解以後，通過使用多種丙烯醯化劑將所述多糖或寡糖N-丙烯醯化至需要程度。
在一個實施方案中，所述方法包括加入丙烯醯化試劑以N-丙烯醯化N-脫乙醯基的多糖或寡糖。丙烯醯化試劑的實例包括但不限於丙烯醯氯、丙烯醯酐、丙烯酸和脫水劑如DCC、CH2CHCOCN等，以約1M的濃度過量使用。在N-脫乙醯基多糖的N-丙烯醯化方法中，在反應期間將所述pH調節並維持在約9-11，優選pH約為10。反應期間的溫度為約2℃-8℃，優選約4℃。所述反應進行約1小時時間。所得N-丙烯醯化多糖或N-丙烯醯化寡糖至少丙烯醯化約95％或以上。B. β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的製備當與另一種免疫原性分子如多肽或蛋白綴合時，本發明的所述多糖或寡糖可用於在個體中對多種革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌、酵母和癌症激發產生抗體應答。所述多糖或寡糖與所述多肽的綴合對所述多糖或寡糖的通常是T細胞非依賴性免疫應答轉化為T細胞依賴性免疫應答。因此，優選所述多肽的大小是一種足以引起所述應答從T細胞非依賴型轉化為T細胞依賴型的多肽大小。為了提供第二免疫原的目的，使用較小的多肽可能是有效的。所述蛋白質載體的大小通常是約50,000-500,000M.W.。
優選的載體蛋白包括但不限於破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素亞單位B、腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白、pneumolysoid、B組鏈球菌的C-β蛋白、B組鏈球菌的C-β蛋白、B組鏈球菌的非-IgA結合的C-β蛋白、銅綠假單胞菌類毒素、百日咳類毒素、含有賴氨酸或半胱氨酸殘基的合成蛋白等。所述載體蛋白可以是天然蛋白、化學修飾的蛋白、去毒蛋白或重組蛋白。就所述蛋白成分而言，按照本發明製備的綴合物分子可以是單體、二聚體、三聚體和更高的交聯分子。
本發明提供了生產綴合物分子的能力，在該綴合物分子中所述蛋白是通過在所述多糖或寡糖上的一個或多個位點與所述多糖或寡糖連接。所述多糖或寡糖的大小可以有很大不同。一種或多種多糖或寡糖可以與一種或多種蛋白交聯。本發明的綴合物優選為點陣結構。連接點是在所述蛋白的賴氨酸或半胱氨酸殘基與所述多糖或寡糖的N-丙烯醯基之間。
在一種形成免疫原性多糖-蛋白綴合物的方法中，首先用鹼或酶水解處理在構成其重複單元的糖殘基中含有游離氨基或N-醯基(如N-乙醯基)的分離的多糖(糖胺聚糖)，以去除其部分或全部N-醯基。然後用N-丙烯醯化試劑將所述游離氨基進行N-醯化以形成上述N-丙烯醯化多糖。然後在最佳pH、溫度和時間條件下使所述N-丙烯醯化的多糖直接與蛋白質偶聯，從而形成免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物。
在一個實施方案中，在pH9.0以上下進行該綴合方法，對於蛋白質賴氨酸殘基的ε-游離氨基基團的最佳反應性優選pH約9.0-10.0。在另一個實施方案中，在所述蛋白半胱氨酸殘基的巰基(SH)基團的最佳反應性的約7.0的中性pH下進行該綴合方法。可根據特定載體蛋白的反應基團數目選擇進行綴合方法的pH。例如，使用包含更多反應性賴氨酸殘基(與半胱氨酸殘基數相比)的蛋白的方法優選在鹼性pH下進行。使用包含更多反應性半胱氨酸殘基(與賴氨酸殘基數相比)的蛋白的綴合方法優選在約中性pH下進行。
所述綴合反應可在緩衝試劑中進行，該緩衝試劑包括但不限於碳酸鹽/碳酸氫鹽、硼酸鹽緩衝劑、磷酸鹽等。所述綴合反應的溫度至少約為25℃，優選約37℃，反應持續優選約24小時。如Romanowska等(46)所述，關鍵反應涉及蛋白上的親核性半胱氨酸巰基基團或賴氨酸ε-NH2基團與N-丙烯醯化糖殘基的1，4-綴合加成(麥可型加成)，所述N-丙烯醯化糖殘基存在於圖1所示的所述多糖的重複單元內。所得β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物的多糖與蛋白比率約0.1-0.6。
適於與蛋白上的半胱氨酸和/或賴氨酸殘基直接綴合的具有N-醯基的所述多糖的糖基殘基包括但不限於葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、巖藻糖胺、唾液酸等。所述多糖可得自天然來源如細菌、酵母或癌細胞，或得自合成來源。合成來源包括化學合成、酶法合成以及化學酶合成。所述合成可以是全程合成或是修飾天然碳水化合物的。天然分離的碳水化合物能通過改變碳水化合物殘基上的官能團或通過加減碳水化合物殘基來修飾。
用於製備本發明所述β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物和β-丙醯胺基-聯寡糖-蛋白綴合物的所述多糖或寡糖可以改變大小以與載體蛋白綴合。作為本文定義，用於本發明的寡糖包含至少10個糖殘基，優選10到約50個糖殘基。作為本文定義，多糖糖殘基50個以上，並且最高可為約600個或更多的殘基。在某些情況下，需要大的構建物來增強免疫原性。本發明方法適用於非常大的多糖，因為許多反應位點能被引入單個多糖中。本發明超越先有技術的另一優勢是不改變所述多糖或寡糖的帶電官能團，該基團常常與決定免疫性的表位相互作用/或構成決定免疫性的表位部分。C.疫苗本發明也涉及疫苗製備。按照本發明，可將上述分離的β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物用作抗原以產生對所述多糖或寡糖反應的抗體，並因此對所述多糖或寡糖從其分離的生物體或細胞反應。本發明疫苗可以是除了β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物進一步包含其它成分的複合疫苗或多成分疫苗，包括但不限於白喉-破傷風-百日咳(DTP)、破傷風-白喉(Td)、DTaP、DTaP-Hib疫苗、DTaP-IPV-Hib疫苗等以及其複合物，從而提供用於免疫抗多種引起疾病的生物體或引起疾病的細胞的多功能疫苗。
本發明疫苗可提供主動或被動免疫。提供主動免疫的疫苗包含與至少一種抗原肽綴合的分離並純化的N-丙烯醯化多糖或寡糖。D.藥用組合物本發明組合物可包含至少一種多糖-蛋白綴合物和藥學上可接受的載體如鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等。在另一實施方案中，所述藥用組合物包含另一種免疫原性部分如肽，或含有由本發明的一種CPS產生的抗體的組合物。所述組合物也可含有佐劑以增強接受者的免疫應答。該佐劑可以是鋁基佐劑如明礬或長鏈烷基佐劑如硬脂醯酪氨酸(參見1990年9月17日申請的美國序號583,372；歐洲專利EP 0 549 617 B1；Moloney等，美國專利號4,258,029)、胞壁醯二肽(MDP)或其衍生物、單磷醯脂質A(MPL)、皂甙(Quil-A)等。還參見Jennings等，美國專利號5,683,699和Paoletti等，J.Infectious Diseases1997；1751237-9。所述藥用組合物可進一步包含一種或多種附加的免疫原，包括但不限於白喉-破傷風-百日咳(DTP)、破傷風-白喉(Td)、DTaP、DTaP-Hib、DTaP-IPV-Hib等以及其複合物。這些藥用組合物作為疫苗特別有效。
對於引起被動免疫，所述藥用組合物可以含有多克隆抗體、或單克隆抗體、它們的衍生物或其片段以及它們的重組形式。抗體、片段或衍生物的量將是按標準臨床技術確定的治療學上或預防學上的有效量。
通過本領域中已知的有效方法可將本發明的藥用製劑引入個體。給予途徑包括但不限於皮內、腹腔內、靜脈內、皮下、肌肉內、口服和鼻內給予。
本發明組合物可含有本領域技術人員已知的適用於疫苗的標準載體、緩衝劑或防腐劑，包括但不限於任何合適的藥學上可接受的載體，如生理鹽水或其它可注射的液體。也可含有疫苗常規添加劑，例如穩定劑如乳糖或山梨醇和增強免疫原性應答的佐劑如磷酸鋁、氫氧化鋁或硫酸鋁以及硬脂醯酪氨酸。按照本發明生產的疫苗也可作為多價疫苗的成分，該多價疫苗可激發產生抗多種傳染原的免疫應答。
以足以激發產生作為免疫原性反應的一部分的抗體的量給予本發明的疫苗。所述疫苗可以胃腸外使用以產生IgG和IgM抗體，或者將其給予黏膜以在組織表面產生IgA抗體。可根據接受所述疫苗的個體的體型大小、重量或年齡調節劑量。可通過檢測抗體滴度或殺菌活性監測個體的所述抗體應答，並且如果需要可加強免疫以增強所述免疫應答。通常，用於嬰幼兒的單劑量為每劑量約10μg的綴合物疫苗或者為大約0.5μg-20μg/公斤。成人一次劑量為約0.5μg-20μg/公斤的所述綴合物疫苗。對於所述CPS-蛋白綴合物疫苗，常規劑量為每劑量的每種CPS各約25μg。即，抗B組鏈球菌疫苗可以含有九個血清型的每一CPS型各25μg。E.抗體直接抗所述多糖的抗體可以通過本領域已熟知的任何技術生產。根據一種方法，可通過將分離的免疫原性β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物給予宿主動物來產生所述抗體。所述宿主動物可以是但不限於大鼠、小鼠、兔、非人類的靈長類動物或人。優選所述宿主為人。在一個實施方案中，通過使用本領域已知的佐劑可以增強免疫應答。
通過本領域已熟知的任何一種技術也可製備直接抗所述多糖的單克隆抗體。按照一種方法，使用雜交瘤細胞系培養物(Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497)。直接抗所述多糖的單克隆抗體可以是通過本領域已熟知的任何技術製備的人單克隆抗體、嵌合單克隆抗體或人源化單克隆抗體。根據一種方法，可以產生具有與人類恆定區結合的非人類(如小鼠)抗原-結合域的嵌合單克隆抗體。(Takeda等(1985)Nature 314452)。按照Queen等，美國專利號5,585,089和美國專利號5,530,101的方法能夠生產人源化抗體。通過本領域已知的方法可以構建單鏈抗體(美國專利號4,946,778；Davis，G.T.等1991Biotechnology 9165-169；Pluckthun，A.1990 Nature 347497-498)。通過本領域已知方法(WO 89/07142)可以修飾所述抗體的恆定區的結構域。
通過本領域已熟知的任何技術可以純化直接抗所述多糖或寡糖的抗體，所述技術包括但不限於免疫吸附或免疫親和層析、或其它層析法(如HPLC)。抗體也可作為免疫球蛋白部分從血清、血漿或細胞培養基純化。
本發明的抗體分子可以是完整的免疫球蛋白分子、大體上完整的免疫球蛋白分子或含有抗原結合位點的免疫球蛋白分子部分諸如Fab片段。所述抗體分子可以是任何類型，包括IgG、IgM和IgA。
通過本領域已熟知的任何技術可以生產直接抗所述CPS的抗體片段。(Campbell(1985)生物化學和分子生物學實驗室技術，第13卷，Burdon等(編輯)，Elsevier Science出版社，Amsterdam)。
所述抗體或其抗原結合片段可作為治療劑使用以提供被動保護來對抗由Gram(+)、Gram(-)菌或酵母引起的疾病。所述抗體或其抗原結合片段也可作為標準免疫測定中的診斷試劑以檢測和/或鑑定細菌、酵母或癌細胞。所述抗體可以試劑盒形式單獨或與標準試劑一起提供用於免疫測定。
在本發明的另一實施方案中，可將本發明的直接抗所述多糖或寡糖的抗體作為治療或預防用途的藥用製劑使用以便將一個宿主個.體的被動免疫轉移給另一個體(即，增強個體的對革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌或酵母的免疫應答或者在無免疫應答的或免疫耗竭的個體包括AIDS患者中提供免疫應答)。抗體的被動轉移在本領域是已知的並且可通過任何已知方法完成。按照一種方法，本發明的直接抗其綴合物的抗體在具有免疫能力的宿主(「供體」)動物中生成、從所述宿主動物中獲取並輸注到接受的個體。例如，可採用人類供體生產對本發明的所述多糖-蛋白綴合物反應的抗體。然後將所述抗體以治療學或預防學上的有效量給予需要治療的人類受者，從而使所述接受者具有對細菌的抵抗力，由所述多糖成分激發產生的抗體結合細菌。(參見Grossman，M.和Cohen，S.N.，「基礎和臨床免疫學」，第7版，(Stites，D.P.和Terr，A.T.編輯，Appleton Lange 1991)58章「免疫」。)在某些情況下，本發明使用的所述多糖可以誘導與其它病原體交叉反應的抗體，因此具有抗這些其它細菌感染的保護能力。F.診斷試劑盒在另一實施方案中，可以診斷試劑盒提供本發明的所述CPS或其衍生物或其片段以指示直接抗細菌、酵母或癌細胞的抗體的存在。存在這類抗體表明以前曾暴露於所述病原體，並預測對感染有抵抗力的個體。所述診斷試劑盒可包含至少一種本發明的所述CPS或其衍生物或其片段(單獨或與蛋白綴合)和合適的試劑，當所述修飾的CPS或衍生物或片段與含有直接抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、酵母或癌細胞或癌組織的抗體的樣本混合時，所述試劑用於檢測抗體反應。抗體反應可通過本領域中描述的任何方法鑑定，包括但不限於ELISA檢測。這樣的了解是重要的並能避免不必要的免疫接種。
或者，所述診斷試劑盒可進一步包含固體載體或磁珠或塑料基質和至少一種本發明的所述CPS或其衍生物或其片段。
在某些情況下，優選標記所述CPS或衍生物或片段。標記物是本領域中已知的。例如，標記物包括但不限於放射性、化學發光、生物發光、發光或其它方便分析的鑑定「標記」。可將體液或組織樣本(如血液、血清、唾液)收集和純化並加樣於所述診斷試劑盒。所述CPS、衍生物或片段可以是純化的或非純化的，可由分子混合物組成。
固體基質是本領域已知的，並可使用包括但不限於試管、珠、微粒、浸-棒(dip-sticks)、平板等形狀的聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或任何固體可塑性物質。其它基質包括但不限於膜、96孔微量滴定板、試管和Eppendorf管。通常這種基質含有配體結合劑能夠附著於其上的任何表面或者其自身提供配體附著位點的表面。
本文涉及的所有公開出版物、專利和文章通過引用特別結合到本文中。給出以下實施例以說明本發明，但絕不能解釋為用其限制本發明的範圍。本領域技術人員將認識到可對其作許多修改和替代而沒有偏離本發明的精神和權限範圍。
實施例1β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白載體綴合物的製備下述非限制性實施例描述了一系列與臨床相關的抗肺炎鏈球菌(14型)、III型和II型B組鏈球菌(GBS)以及大腸桿菌K1的多糖-蛋白綴合物疫苗的製備。用於本實施例的所有上述多糖是在一個或多個糖基殘基中含有N-乙醯基基團糖胺聚糖，所述糖基殘基是其結構重複單位組分。
A. 14型肺炎球菌多糖的解聚作用為增加所述多糖的溶解性，首先通過聲處理將其部分解聚。將200mg的14型肺炎球菌多糖(批號2020510，美國典型培養物保藏中心)溶於20ml的PBS中並用Branson Sonifier Model 450在0℃進行聲處理。透析所得多糖並凍幹，然後通過用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)平衡的superdex 200柱子篩分。合併峰部分，然後用截留分子量(MWCO)為3,500的Spectra/PorMembrane對去離子(d.i.)水透析。凍幹後獲得157.5mg的固體產物。用具有miniDAWN的SEC-MALLS(WyattTechnology Corp.，Santa Barbara，CA)測定所述聲處理的多糖的平均分子量約為50,000。
B. 14型肺炎球菌多糖的去-N-乙醯化將100mg篩分的14型肺炎球菌多糖溶於10ml的NaOH(2N)中，然後向該反應混合物中加入10mg的NaBH4。將該混合物在100℃下加熱1小時，然後冷卻至室溫。將該N-去乙醯化的組分用截留分子量(MWCO)為3,500的Spectra/PorMembrane對去離子(d.i.)水透析並凍幹，獲得84mg的白色固體。用H1-NMR在500MHz處測定分析所述N-去乙醯化的多糖，發現其含有少於5％殘餘N-乙醯基。
C. N-去乙醯化的14型肺炎球菌多糖的N-丙烯醯化將84mg的N-去乙醯化的14型肺炎球菌多糖溶於4.2ml的去離子水中。在冰浴中用2N的NaOH將該溶液的pH調節至10。然後加入420μl的1∶1(v/v)的丙烯醯氯∶二噁烷並用2N的NaOH調節pH至11。在pH11時使其再反應1小時以確保完全水解因為O-醯化作用形成的酯。透析溶液並凍幹，獲得42mg的乾粉。在用H1-NMR在500MHz處測定分析後發現該多糖有超過95％的N-丙烯醯化。
D. N-丙烯醯化的14型肺炎球菌多糖與破傷風類毒素單體的綴合將22mg的N-丙烯醯化的14型肺炎球菌多糖溶於1.1ml的碳酸鈉/重碳酸鈉緩衝液(pH9.5)中。向該反應混合物中加入22mg的破傷風類毒素單體。將該反應混合物在37℃孵育過夜。用配有superose12柱子裝備的Biologic system(Bio-Rad)測定分析綴合進程。用280nm處的紫外吸光度監測，以柱空隙體積洗脫的峰進行性升高說明多糖與破傷風類毒素的綴合。綴合完成後，用0.1N的HCl中和該溶液至pH7，然後對PBS透析。將該綴合物通過1.6×60cm的Superdex 200PG柱(Pharmacia)過柱純化並用含有0.01％硫汞撒的PBS洗脫。合併相當於空隙體積峰的部分。用Dubois等(51)的硫酸苯酯法和Bradford(9)的Coomassie法評估所述綴合物中的碳水化合物和蛋白含量。
將同樣方法用於II型、III型GBS以及大腸桿菌K1和腦膜炎球菌C型多糖。這些多糖各自的反應條件列於下表。
表1E. II型和III型GBS多糖的去-N-乙醯化
*用SEC-MALLS測定表2II型和III型GBS多糖的N-丙烯醯化
表3II型和III型GBS多糖與破傷風類毒素單體的綴合
F. K1多糖的去-N-乙醯化將300mg的K1多糖溶於15ml 2.0N NaOH溶液(其中加有150mg的氫硼化鈉)中。將該溶液在110℃下加熱6小時，冷卻至室溫並用20倍體積的去離子水稀釋。用去離子水通過Amicon YM3膜的滲濾後，凍幹該溶液得到255mg的N-去乙醯化的K1多糖產物。用H1-NMR在500MHz處測定證實完全N-去乙醯化。
G. K1多糖的N-丙烯醯化向在冰浴中冷卻的含有250mg的去-N-乙醯化的K1多糖的10ml去離子水溶液中滴加丙烯醯氯(Aldrich，Milwaukee，WI)溶液，所述丙烯醯氯溶液通過將1ml丙烯醯氯與1ml二噁烷混合製得。通過加入2N的氫氧化鈉溶液將該溶液的pH維持在7.0到10.5之間。完成滴加後，所述pH升至13並在室溫下維持在12.9到13.1之間1小時。滴加1N HCl調節該溶液的pH至9.5。將該溶液用去離子水通過攪拌池(stircell)中的Amicon YM3膜的滲濾。將所述殘留物凍幹至乾燥，並將該物質(N-丙烯醯基K1多糖)保存於-20℃冰箱的乾燥器中。H1-NMR在500MHz處指示在反應期間發生了完全的N-丙烯醯化。
H. β-丙醯胺基-聯K1-rPorB綴合物(K1-rPorBI)將0.3ml含有8.4mg的N-丙烯醯K1多糖和4.0mg的重組腦膜炎奈瑟氏球菌PorB的0.2M硼酸鹽、0.05％ZwittergenTM3，14(Boehringmannhein)溶液(pH9.5)在37℃孵育3天。通過Superdex 200製備級柱的尺寸排阻層析純化該綴合物，並用含0.01％硫汞撒的PBS洗脫。合併位於或接近於柱子的空隙體積處洗脫的在uv-280nm活性信號的部分並保存於冰箱中。分別通過間苯二酚和考馬斯蛋白分析法測定分析該綴合物中的唾液酸和蛋白含量。
I. 硫醇化rPorB的製備向1ml rPorB膜孔蛋白濃度為10mg/ml的溶液(含有0.25M的氯化鈉和0.05％zwittergent 3-14的0.25M HEPES緩衝液pH，8.5)中加入0.2ml的0.05M的N-琥珀醯亞胺基3-[2-吡啶基二硫代]丙酸鹽溶液。充分混勻該溶液並將其在室溫下放置1小時。向該溶液中加入0.06ml溶於相同緩衝液中的1M二硫蘇糖醇溶液。再次充分混勻該溶液並將其在室溫下放置2小時。用1.3ml含有0.25M氯化鈉和0.05％zwittergent 3-14的pH為7.0的0.25M HEPES緩衝液稀釋該溶液並將其上樣到用相同緩衝液預先平衡的Pharmacia PD-10脫鹽柱上。用相同緩衝液洗脫該柱，收集洗出液並用Amicon Centricon 30濃縮器以5,000RPM濃縮1小時。收集所述殘餘物並測定蛋白濃度。
H. N-丙烯醯化的K1-S-rPorB綴合物(K1-S-PorB)的製備向上述的濃度為25mg/ml的0.17ml的硫醇化rPorB溶液中加入9mg的N-丙烯醯化的K1多糖。充分混勻該溶液並將其在37℃烘箱中孵育18小時。將該溶液通過Supedex 200柱(Pharmacia)純化，以PBS作洗脫液。合併於或接近於柱子的空隙體積處洗脫的uv-280nm活性部分。分析顯示該綴合物含有25μg/ml的多糖和188μg/ml的蛋白。I. N-丙烯醯化的GCMP-S-rPorB綴合物(GCMP-S-rPorB)的製備同樣，用與上述N-丙烯醯化的K1-S-rPorB綴合物的製備方法相似的方法製備N-丙烯醯化GCMP-S-rPorB，發現該綴合物含有43μg/ml的多糖和200μg/ml的蛋白。
表4上述綴合物的分析數據
(1)總碳水化合物的Dubois分析(2)間苯二酚唾液分析(3)通過N-丙烯醯化多糖與相應載體蛋白的直接偶聯製得(4)通過高碘酸氧化的N-丙烯醯化K1 PS與rPorB的還原胺化作用製備的對照綴合物實施例2β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白載體綴合物的免疫原性和效能所述綴合物在小鼠中的臨床前評估免疫分析用ELISA測定每種多糖綴合物的血清抗體。通過還原性胺化作用製備用於ELISA分析中的人血清白蛋白(HSA)(Sigma，St Louis，MO)綴合物。向HAS中加入氧化的多糖，然後用NaCNBH3進行還原性胺化作用。通過凝膠過濾層析分離該綴合物，並將其凍幹保存於-70℃。用ELISA按下述測定多糖-特異性抗體滴度。用溶於PBS(0.01M磷酸鈉，0.15M氯化鈉，pH7.5)中的PS-HSA綴合物以每孔0.25μg(100μl/每孔)包被96孔聚苯乙烯平底微量滴定板(NUNC Polysorb)(Nunc，Naperville，IL)，在37℃孵育1小時，隨後用PBS-Tween(溶於PBS的0.05％(v/v)Tween 20)洗滌(5次)。在室溫下進行隨後所有的孵育。將PBS-Tween用於所有需要的洗滌。然後對於IgGELISA用PBS-BSA(溶於PBS的0.5％(w/v)牛血清白蛋白)、或對於IgMELISA中用0.1％(w/v)Carnation脫脂奶粉以每孔0.15ml封閉所述包被板1小時，隨後洗滌。在板中以每孔100μl稀釋血清2倍，一式二份，並孵育1小時，隨後洗滌。以每孔100μl加入抗體綴合物(過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體)(Kirkegaard Perry Lab，Gaithersburg，MD)並孵育30分鐘，隨後洗滌。以每孔0.05ml加入1∶1的染料和底物溶液(Kirkegaard Perry TMB)和過氧化物並孵育10分鐘。然後用1M H3PO4以每孔0.05ml終止過氧化物酶反應，並將該板置於Molecular Devices Emax微板讀數儀(Molecular Devices，Menlo Park，CA)上讀取波長為450nm的讀數，以650nm作參考波長。測定幾個無血清對照孔的本底吸光度並平均每板的數值。對於每個血清稀釋度，減去本底吸光度平均值，然後平均復孔的血清吸光值。將改良的Scatchard作圖用於隨後的數據分析，其中將吸光度(y軸)對吸光度乘以稀釋度的倒數(x軸)(參考)作圖。在平衡和過量抗體條件下，獲得每種血清稀釋系列的直線；根據這條線可推斷x軸以測定抗體滴度。為對所有血清標準化提供參考，將板與板間和天與天間的變異減少到最小，將預先測定抗體滴度的陽性對照血清用於每塊板。這些分析的結果示於表5、6和7。
調理素吞噬細胞試驗(OP)應用人早幼粒細胞白血病HL-60細胞系(ATCC號CCL 240)的體外調理素吞噬殺傷試驗測試小鼠抗血清對鏈球菌B(GBS)和肺炎球菌綴合物的調理活性。簡要地說，將200cfu的III型GBS M781菌株細胞或14型肺炎球菌株與等體積的血清抗體混合併在35℃、5％CO2培養箱中振搖孵育15分鐘。將幼兔補體和在90mM的DMF(N，N-二甲基甲醯胺)存在下培養5天的HL-60細胞(5×105)加入該混合物中並在37℃下振搖孵育1小時。取出一等份用於培養物的定量。通過推斷相當於50％存活細菌的抗體稀釋度測定滴度。這些試驗中14型肺炎球菌綴合物的結果示於表5而III型GBS綴合物的結果示於表6。
血清殺菌試驗(SBA)根據殺傷50％靶細菌的殺菌滴度或稀釋度的倒數測定抗體-依賴補體介導的殺菌活性。首先將所有血清中的補體在56℃孵育30分鐘。然後用GBSS在無菌的96孔U型底的微量滴定板(Sigma)中對每種血清進行2倍系列稀釋，每孔終體積為50μl。用工作濃度的GBM細菌(15血清型菌株，44/76)或C組腦膜炎球菌C11參考菌株按1∶1稀釋幼兔血清補體(Pel-Freez，Brown Deer，WI)並將其在含有所述稀釋血清的每孔中加入50μl，每孔反應混合物的終體積為100μl。將這種含有50％血清(加熱滅活並稀釋)、25％兔血清補體和25％細菌(工作濃度)的反應混合物在37℃、5％CO2的潮溼培養箱中的微量滴定板振搖器(LKB-Wallac；pharmacia Biotech)上快速振搖孵育60分鐘。
然後將所有孔中的培養物以30μl/板鋪於巧克力瓊脂平板上。時間為零的(time zero)細菌樣本也同樣鋪於平板上。象前述一樣將所有平板孵育過夜。然後用Imaging Products International(Chantilly，VA)的自動集落計數器計數菌落形成單位(cfu)，每板均取三個讀數的平均值。直接從繪製的圖上讀取50％殺傷的稀釋度的倒數或滴度，所述圖中x軸代表相當於稀釋度的倒數的10的對數而y軸代表存活百分率。這些試驗的結果示於表7。
表514型肺炎球菌-破傷風類毒素綴合物的免疫原性
對照疫苗是通過還原性胺化作用製備的14型多糖-破傷風類毒素綴合物。Pn14-TT綴合物是N-丙烯醯化14型肺炎球菌多糖和破傷風類毒素之間的直接綴合的產物。
本研究中將6-8周齡的CD1小鼠(Charles River Laboratory)分組(一組10隻)，在第0、28和38天皮下注射給予2.0μg多糖綴合物。在第0、28、38天從動物取血並於第59天放血。應用通過還原性胺化作用製備Pn14多糖-HSA綴合物進行ELISA。報告於表5的ELISA滴度代表總IgG。所報告的OP滴度是抗14型肺炎球菌株的滴度。
表6III型GBS綴合物的免疫原性
對照綴合物疫苗是III型GBS-破傷風類毒素綴合物，該綴合物通過高碘酸鹽氧化的III型GBS多糖和破傷風類毒素的還原性胺化作用製得。III型GBS-TT綴合物是N-丙烯醯化III型多糖和破傷風類毒素之間的直接綴合的產物。
本研究中將6-8周齡的CD1小鼠(Charles River Laboratory)分組(一組10隻)，在第0、21和42天皮下注射給予2μg多糖綴合物。在第0、21、42天從小鼠取血並於第52天放血。應用與人血清白蛋白綴合的III型GBS多糖測定ELISA滴度，示於表6的滴度代表抗III型多糖的總IgG。
表7大腸桿菌K1綴合物的免疫原性
對照疫苗(K1-rPorBII)是高碘酸鹽氧化的N-丙烯醯化K1多糖和破傷風類毒素之間的還原性胺化作用的產物。K1-rPorBI疫苗是N-丙烯醯化K1多糖和破傷風類毒素的直接綴合的產物。K1-S-rPorB是硫醇化膜孔蛋白rPorB和N-丙烯醯化K1多糖的直接綴合產物。
本研究中將Charles River Laboratory的CD1小鼠(6-8周齡)分組(一組10隻)，在第0、28和42天進行腹腔免疫。在第0、28、42天從小鼠取血並於第52天放血。應用與人血清白蛋白綴合的N-丙烯醯化K1多糖測定ELISA滴度。示於表7的滴度代表抗修飾的N-丙烯醯化K1多糖的總IgG。抗15血清型B組腦膜炎奈瑟氏球菌H 44/76菌株的血清抗殺活性(SBA)(第52天放血)也示於表7。
表8GCMP綴合物的免疫原性
GCMP-S-rPorB是N-丙烯醯化的C組腦膜炎球菌多糖(GCMP)和硫醇化rPorB之間的直接綴合產物。在這些動物試驗中將HSD的遠系繁殖的Swiss Webster雌性小鼠(6-8周齡)分組(一組10隻)，在第0和28天皮下注射每劑量2μg多糖綴合物。在第38天將動物放血至死。應用與人血清白蛋白綴合的GCMP測定對C組多糖的ELISA滴度。應用腦膜炎球菌C11參考菌株獲得血清殺菌滴度。
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權利要求
1.包含在丙酸部分的β-位與蛋白直接綴合的N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物。
2.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物，其中所述蛋白含有至少一個賴氨酸或半胱氨酸殘基。
3.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖是從細菌、酵母、癌細胞衍生獲得或化學合成製得。
4.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖衍生自大腸桿菌、腦膜炎球菌、肺炎球菌屬、鏈球菌屬、嗜血菌屬、奈瑟氏球菌屬、沙門氏菌屬、克雷伯氏菌屬或假單胞菌屬。
5.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖衍生自Ia血清型、Ib血清型、II血清型、III血清型、V血清型、VIII血清型B組鏈球菌及其組合物。
6.根據權利要求4的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖衍生自B組、C組、Y組、W135組腦膜炎球菌及其組合物。
7.根據權利要求4的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖衍生自大腸桿菌K1、大腸桿菌K92、4型肺炎球菌、14型肺炎球菌、A組鏈球菌、C組鏈球菌或其組合物。
8.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述蛋白選自破傷風類毒素、白喉類毒素、腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白、pneumolysoid、B組鏈球菌的C-β蛋白和B組鏈球菌的非-IgA-結合的C-β蛋白。
9.根據權利要求8的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述蛋白是重組產生的蛋白。
10.根據權利要求9的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述蛋白是重組的腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白。
11.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖包括糖胺聚糖。
12.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖含有至少具有一個游離氨基或N-醯基的結構重複單位的糖殘基。
13.根據權利要求12的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述糖殘基選自葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、巖藻糖胺和唾液酸。
14.根據權利要求1的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖直接與所述蛋白的賴氨酸殘基的ε-游離氨基或半胱氨酸殘基的巰基綴合。
15.一種多糖-蛋白綴合物，它包括N-丙酸化14型肺炎鏈球菌多糖-破傷風類毒素綴合物、N-丙酸化III型B組鏈球菌多糖-破傷風類毒素綴合物、N-丙酸化II型B組鏈球菌多糖-破傷風類毒素綴合物、N-丙酸化大腸桿菌K1多糖-蛋白綴合物或N-丙酸化腦膜炎球菌C多糖-破傷風類毒素綴合物的。
16.用一種方法製備的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，所述方法包括A)用去-N-乙醯化劑將分離的多糖或寡糖去-N-乙醯化，形成去-N-乙醯化多糖或去-N-乙醯化寡糖，B)用丙烯醯化試劑將去-N-乙醯化多糖或去-N-乙醯化寡糖N-丙烯醯化，形成N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖，以及C)將N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖直接與蛋白綴合，形成所述多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物。
17.根據權利要求16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述多糖或寡糖衍生自細菌、酵母、癌細胞或化學合成製得。
18.根據權利要求16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述綴合在pH約為7.0的條件下進行。
19.根據權利要求16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述綴合在pH大於9的條件下進行。
20.根據權利要求16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述綴合用選自磷酸鹽、碳酸鹽/重碳酸鹽緩衝液或硼酸鹽緩衝液的試劑進行。
21.根據權利要求16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述去-N-乙醯化劑是鹼或酶而丙烯醯化試劑選自N-丙烯醯氯、丙烯醯酐、丙烯酸和脫水劑。
22.一種藥用組合物，它包含根據權利要求1或16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物和藥學上可接受的載體。
23.根據權利要求22的藥用組合物，它還包含佐劑。
24.根據權利要求23的藥用組合物，其中所述佐劑選自明礬或硬脂醯酪氨酸。
25.根據權利要求22的藥用組合物，它還包含第二種組分，所述第二種組分選自DTP、DTaP、Td、DTaP-Hib、DTaP-IPV-Hib及其組合物。
26.一種免疫原，它包含根據權利要求1或16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，所述免疫原誘導多糖-特異性或寡糖-特異性免疫應答。
27.根據權利要求26的免疫原，其中所述免疫應答產生多糖-特異性或寡糖-特異性免疫球蛋白。
28.根據權利要求27的免疫原，其中所述免疫球蛋白是IgG、IgM、IgA或其組合物。
29.製備β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物或β-丙醯胺基-聯寡糖-蛋白綴合物的方法，包括A)用去-N-乙醯化試劑將多糖或寡糖去-N-乙醯化，形成去-N-乙醯化多糖或去-N-乙醯化寡糖，B)用丙烯醯化試劑將去-N-乙醯化多糖或去-N-乙醯化寡糖N-丙烯醯化，形成β-丙酸化多糖或β-丙酸化寡糖，以及C)將β-丙酸化多糖或β-丙酸化寡糖直接與蛋白綴合，形成β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物或β-丙醯胺基-聯寡糖-蛋白綴合物。
30.權利要求29的方法，其中所述去-N-乙醯化試劑是鹼或酶。
31.權利要求29的方法，其中所述去-N-乙醯化試劑選自NaOH、KOH和KiOH。
32.權利要求29的方法，其中所述丙烯醯化試劑選自丙烯醯氯、丙烯醯酐、丙烯酸和脫水劑。
33.權利要求29的方法，其中所述多糖或寡糖衍生自細菌、酵母、癌細胞或化學合成製得。
34.權利要求29的方法，其中所述多糖或寡糖衍生自大腸桿菌、腦膜炎球菌、肺炎球菌屬、鏈球菌屬、嗜血菌屬、奈瑟氏球菌屬、沙門氏菌屬、克雷伯氏菌屬或假單胞菌屬。
35.權利要求29的方法，其中所述蛋白選自破傷風類毒素、白喉類毒素、奈瑟氏球菌外膜蛋白、pneumolysoid、B組鏈球菌的C-β蛋白和B組鏈球菌的非-IgA-結合的C-β蛋白。
36.權利要求35的方法，其中所述蛋白是重組產生的蛋白。
37.一種疫苗，它包含根據權利要求1或16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物，其中所述疫苗提供對導致疾病的有機體或細胞的保護性免疫。
38.根據權利要求37的疫苗，其中所述導致疾病的有機體或細胞選自細菌、酵母和癌細胞。
39.根據權利要求38的疫苗，其中所述細菌是大腸桿菌、腦膜炎球菌、肺炎球菌屬、鏈球菌屬、嗜血菌屬、奈瑟氏球菌屬、沙門氏菌屬、克雷伯氏菌屬或假單胞菌屬細菌。
40.根據權利要求37的疫苗，它還包含與所述多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物組合的第二種免疫原，所述第二種免疫原選自DTP、DTaP、Td、DTaP，Hib、DTaP-IPV-Hib及其組合物。
41.免疫哺乳動物抵抗引起疾病的有機體或引起疾病的細胞的方法，該方法包括給予所述哺乳動物免疫量的權利要求37的疫苗。
42.免疫哺乳動物抵抗肺炎鏈球菌的方法，該方法包括給予所述哺乳動物免疫量的權利要求37的疫苗。
43.免疫哺乳動物抵抗B組鏈球菌的方法，包括給予所述哺乳動物免疫量的權利要求37的疫苗。
44.免疫哺乳動物抵抗B組腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，包括給予所述哺乳動物免疫量的權利要求37的疫苗。
45.免疫哺乳動物抵抗C組腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，包括給予所述哺乳動物免疫量的權利要求37的疫苗。
46.免疫哺乳動物抵抗B型流感嗜血菌的方法，包括給予所述哺乳動物免疫量權利要求37的疫苗。
47.在哺乳動物激發產生針對多糖或寡糖的抗體應答的方法，包括給予有效劑量權利要求1或16的多糖-蛋白綴合物或寡糖-蛋白綴合物。
48.根據權利要求47的方法製備的免疫球蛋白或其抗原-結合片段。
49.根據權利要求48的免疫球蛋白，它選自IgG抗體、IgM抗體、IgA抗體及其組合物。
50.根據權利要求49的免疫球蛋白，其中所述抗體是分離的IgG。
51.在對根據權利要求1和16的β-丙醯胺基-聯多糖-蛋白綴合物或β-丙醯胺基-聯寡糖-蛋白綴合物的應答中誘導產生的分離的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段對N-丙酸化多糖或N-丙酸化寡糖具有特異性免疫活性，並對由其衍生β-丙酸化多糖或β-丙酸化寡糖的天然N-乙醯化多糖具有免疫活性。
52.根據權利要求51的抗體或其抗原結合片段，其中所述天然N-乙醯化多糖是細菌、酵母或癌細胞的成分。
53.根據權利要求52的抗體或其抗原結合片段，其中所述多糖衍生自大腸桿菌、腦膜炎球菌、肺炎球菌屬、鏈球菌屬、嗜血菌屬、奈瑟氏球菌屬、沙門氏菌屬、克雷伯氏菌屬或假單胞菌屬細菌。
54.根據權利要求51的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是重組產生的抗體。
55.針對引起疾病的有機體或引起疾病的細胞的被動免疫方法，包括給予有效劑量根據權利要求48或51的所述免疫球蛋白或抗體，所述劑量足以抑制或殺傷導致疾病的有機體或導致疾病的細胞。
56.根據權利要求55的被動免疫方法，其中所述免疫球蛋白是分離的IgG抗體或其抗原結合片段。
57.根據權利要求55的被動免疫方法，其中所述免疫球蛋白是分離的IgM抗體或其抗原結合片段。
58.根據權利要求55的被動免疫方法，其中所述免疫球蛋白是分離的IgA抗體或其抗原結合片段。
全文摘要
提供了新的免疫原性的β－丙醯胺基－聯多糖－和N－丙醯胺基－聯寡糖－蛋白綴合物以及生產該綴合物的方法。所述綴合過程簡單、快速、可重複並且適用於各種從細菌種屬、酵母、癌細胞衍化的或化學合成的多糖或寡糖。也描述了應用β－丙醯胺基－聯多糖－和β－丙醯胺基－聯寡糖－蛋白綴合物抵抗感染或癌症的疫苗和免疫方法。
文檔編號C12N15/09GK1323221SQ99812170
公開日2001年11月21日 申請日期1999年8月18日 優先權日1998年8月19日
發明者F·米紹, C·H·黃, C·烏伊茨 申請人:巴克斯特生物技術公司