一種治療類風溼性關節炎的微囊及其製備方法
2023-09-23 20:48:35
一種治療類風溼性關節炎的微囊及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種治療類風溼性關節炎的微囊及其製備方法，屬於基因治療領域。本發明治療類風溼性關節炎的微囊，為包裹轉IL-1Ra基因的骨髓間充質幹細胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊，其直徑在200μm左右。本發明微囊的選擇通透性膜可以使小分子營養物質和代謝產物及生物活性物質可以自由出入，使微囊內的細胞能長期存活，並將持續表達IL-1Ra蛋白分泌到微囊外，且可以隔離具有殺傷性的抗體，避免機體對囊內細胞的免疫反應起到免疫隔離作用，提高基因治療類風溼性關節炎的效果。
【專利說明】一種治療類風溼性關節炎的微囊及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因治療領域，涉及一種治療類風溼性關節炎的微囊及其製備方法。
【背景技術】
[0002]類風溼性關節炎(Rheumatoidarthritis, RA)是以對稱性多關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病，其病理主要表現為滑膜炎，即滑膜的增生、血管翳的形成以及免疫細胞浸潤。可導致關節內軟骨和骨的破壞，關節功能障礙，甚至殘廢。其病因及病理機制比較複雜，至今尚未完全明確。研究表明，IL-1在RA的發病機制中起著重要作用，是導致炎性反應的持續發生和軟骨破壞的重要促炎性細胞因子。
[0003]IL-1Ra最早在上世紀80年代被發現，體內自然存在的IL-1Ra是具有22_26kDa的糖蛋白，其可以牢固的結合I型IL-1受體，使IL-1完全喪失對其受體的激活功能而自己本身並不激活細胞。正常狀態下IL-1與IL-1受體結合而引起的生理效應很大程度上受到IL-1Ra與IL-1受體結合狀態的調控。在發生關節炎動物的滑膜組織內雖然可以產生IL-1Ra，但是由於其數量有限，不能完全抵消IL-1的作用，因此單純依靠體內天然產生的IL-1Ra不足以抑制疾病的發展。在膠原誘導關節炎大鼠模型的研究也發現隨著疾病的發展滑膜中IL-1/IL-lRa比例也會持續升高，而且其與關節炎指數的升高呈正相關。IL-1Ra基因敲除小鼠會發生嚴重關節炎也進一步表明了 IL-1/IL-lRa平衡在維持體內關節正常生理過程及免疫系統內環境穩定中的重要意義。基於體內IL-1/IL-lRa的動態平衡，通過導入外源性IL-1Ra恢復在類風溼關節炎發病中遭到破壞的相互制約關係已經成為該病治療中的重要指導思想之一。
[0004]目前應用IL-1Ra治療類風溼關節炎在動物模型和病人體內都取得了很好的療效。有文獻研究表明，在免疫複合物誘導小鼠關節炎模型和兔抗原誘導關節炎模型中應用IL-1Ra可以明顯抑制炎症的發展，減輕骨和軟骨的破壞。同時也發現過度表達IL-1Ra的轉基因鼠很少發生膠原誘導性關節炎。對類風溼關節炎患者靜脈注射IL-1Ra不但可以抑制白細胞向滑膜部位浸潤及關節軟骨蛋白多糖合成減少而且還可以降低破骨細胞活化及金屬基質蛋白酶的釋放，從而對骨和軟骨起到保護作用。
[0005]已經有對應IL-1Ra的商品藥物應用臨床，anakerin是最重要的製劑之一。動物實驗結果顯示，anakerin可以抑制膠原誘導關節炎小鼠對II型膠原的抗體反應，保護骨和關節免受進一步破壞。長期多中心臨床應用療效評估結果表明，應用皮下注射anakerin可以明顯延緩類風溼關節炎患者受累關節的破壞速度和程度，減輕疼痛，相應的VAS評分指數明顯降低。但是由於皮下注射藥物伴有較多的副作用，主要是皮注射部位反應，以至於有一部分患者放棄這一療法，通過其他途徑應用IL-1Ra治療類風溼關節炎的研究也在進行當中。
[0006]隨著基因重組技術的迅速發展，人們開始嘗試基因治療，即利用重組細胞的代謝產物調節機體生理功能，治療相關疾病。目前導入基因治療疾病的技術也日漸成熟，已經可以通過各種轉染方式將編碼IL-1Ra基因的質粒或腺病毒導入到類風溼關節炎動物模型體內使IL-1Ra蛋白持續表達並取得了較好的療效，其中以病毒載體效率最高。但是由於病毒為載體的基因治療應用可以激發機體的針對病毒載體的免疫反應。因此如何減少病毒載體的免疫反應成為基因治療的一個研究熱點。
[0007]抗IL-1藥物在臨床上治療RA有明顯的效果，然而這種治療不良反應大，較昂貴需反覆注射，因此受到了限制。基因治療將具有治療作用的基因重組到真核表達載體，轉移至人體細胞，表達出具有治療作用的多肽或蛋白質，從而達到治療目的。IL-1Ra可減輕和阻斷RA的進展。移植攜帶IL-1Ra基因的細胞可抑制疾病進展。轉基因細胞移植可誘發免疫反應且不利細胞生存。
[0008]80年代以後，微囊化技術開始和組織細胞移植相結合，廣泛應用於一些神經內分泌疾病治療的研究，最典型的是1980年加拿大多倫多大學的Sun和Lim發明了海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微膠囊，把豬的胰島細胞微囊化，形成人工細胞植入糖尿病大鼠體內，結果表明該人工細胞成功地降低了血糖水平[17]。之後細胞微囊化技術在骨科得到廣泛應用。Isobe等人將重組人骨形成蛋白(rhBMP)包裹於乳酸-乙醇酸微囊內並植到大鼠皮下，組織檢測發現隨著骨形成蛋白的釋放，在微囊周圍出現具有鹼性磷酸酶活性的骨誘導細胞，並且在異位骨誘導形成過程中轉化為成骨細胞。早在上世紀80年代，KatoT等用乙基纖維素包裹絲裂黴素C做成微囊，經DSA放在骨腫瘤滋養血管處，起到對腫瘤的持續化療作用。HuangYY等將慶大黴素做成微囊，對術後骨髓炎起到預防作用。其它生物醫學領域也得到比較廣泛的應用，如肝細胞微囊化為急性肝衰竭提供暫時性代謝支持，腎上腺髓質嗜鉻細胞微囊化治療帕金森氏病，甲狀旁腺細胞微囊化治療甲狀腺機能低下等。在骨科領域中也有通過微膠囊包裹生長因子或藥物治療骨或軟骨的報導。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種治療類風溼性關節炎的微囊及其製備方法。
[0010]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0011]一種治療類風溼性關節炎的微囊，為包裹轉IL-1Ra基因的骨髓間充質幹細胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊。
[0012]所述的微囊的直徑在200 μ m左右。
[0013]所述的骨髓間充質幹細胞優選來源於大鼠。
[0014]所述的轉IL-1Ra基因的骨髓間充質幹細胞優選為將逆轉錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra轉染到骨髓間充質幹細胞得到。逆轉錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra的構建見參考文獻「人IL-1受體拮抗蛋白重組逆轉錄病毒載體的構建、鑑定及在骨關節炎軟骨細胞中的表達」(芮雲峰，王友，張曉玲等，《中國修復重建外科雜誌》2008年第5期)。
[0015]上述治療類風溼性關節炎的微囊的製備方法，包括如下步驟:
[0016](I)利用PT67細胞株包裝重組PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒。
[0017](2)從大鼠骨髓分離培養間充質幹細胞。
[0018](3)重組PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞。
[0019](4)利用高壓靜電法製作包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞的微囊。
[0020]優選的，步驟⑷為:
[0021]I)將轉染PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒的骨髓間充質幹細胞與海藻酸鈉混合製成細胞懸液，細胞終濃度為3 X106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液；溶劑為0.9% NaCl。
[0022]2)於電壓為3kV，液面距25mm，推進速度30mm/h的高壓靜電場成囊裝置中，將該混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中並反應lOmin，用0.9% NaCl洗滌兩次。
[0023](3)再與0.05%聚賴氨酸溶液反應使微粒外包裹一層聚賴氨酸並反應5min，
0.9% NaCl洗滌兩次。
[0024](4)加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9% NaCl洗滌兩次。
[0025](5)最後用55mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9%NaCl洗滌兩次。
[0026]本發明相對於現有技術具有如下優點和效果:
[0027]本發明製備的包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞的微囊形態大小基本一致，直徑基本在200 μ m左右，其選擇通透性膜可以使小分子營養物質和代謝產物及生物活性物質可以自由出入，使微囊內的細胞能長期存活，並將持續表達IL-1Ra蛋白分泌到微囊外，且可以隔離具有殺傷性的抗體，避免機體對囊內細胞的免疫反應起到免疫隔離作用，提高基因治療類風溼性關節炎的效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1是大鼠骨髓間充質幹細胞40倍顯微鏡下視野圖。
[0029]圖2是PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞後在螢光顯微鏡下視野圖(100X)。
[0030]圖3是本發明包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的形態圖。
[0031]圖4是本發明微囊培養I周和4周在螢光顯微鏡下的生長情況圖，A:1周，B:4周。
[0032]圖5是本發明微囊培養過程中IL-1Ra的分泌情況圖，橫坐標為培養時間(天)，縱坐標為IL-1Ra分泌量(ng)。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0034]實施例1重組PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒的包裝
[0035](I)細胞PT67通過G418篩選
[0036]G418藥物敏感性實驗:待轉染PT67細胞常規傳代培養。在24孔板中每孔接種I X 14個細胞，等細胞貼壁後加入G418，使其終濃度分別為0、50、100、200、300、400、500、800mg/L。每個濃度做三個平行孔。每三天換一次液，每2天檢查一次培養皿中細胞活性。約5天左右開始出現大量細胞死亡，14天細胞全部死亡的最低濃度為最佳篩選濃度400mg/L0
[0037](2)病毒包裝
[0038]根據LipofectAMINE2000轉染試劑說明書:六孔板每孔IX 16個細胞，轉染時細胞匯合度90-95%。轉染前兩小時換液。將4yg的質粒DNA加至250 μ L無血清培養液中，混均。將10 μ L的LipofectAMINE2000加至另外250 μ L無血清培養液中，輕輕混均，室溫靜置5分鐘。將DNA懸液和LipofectAMINE2000懸液混合輕輕混均，室溫靜置20分鐘。分別將合適量的空逆轉錄病毒載體PLXRN、逆轉錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra轉染試劑加入6孔板中，混均，置於培養箱中培養。4-6小時後更換含有血清的培養液；48小時突光顯微鏡下可見包裝成功的細胞，後加入G418至終濃度為200mg/L，培養4周後陽性克隆形成。
[0039]逆轉錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra的構建見參考文獻「人IL-1受體拮抗蛋白重組逆轉錄病毒載體的構建、鑑定及在骨關節炎軟骨細胞中的表達」(芮雲峰，王友，張曉玲等，《中國修復重建外科雜誌》2008年第5期)。
[0040](3)選擇穩定的產病毒細胞株、收集病毒
[0041]I)在所獲的克隆中隨機挑選3-4個大而健康的克隆，移至單獨的培養皿進行擴增培養(用含10%血清的DMEM+G418200mg/L培養基)，常規培養，傳代直至細胞培養達到實驗需要的培養體積。
[0042]2)保留一皿行連續培養。
[0043]3)平鋪培養於需要數目的培養皿中，細胞密度在60-80%即可。具體做法為:以I X 16/瓶接種於250mL的玻璃培養瓶中，各用8mL含血清含G418的DMEM培養液於37°C、5% CO2條件下培養24小時。
[0044]4)更換新培養液(含FBS、青-鏈黴素的DMEM培養液)，繼續培養24h後，收集培養基上清液，病毒上清每隔24h收穫一次，直到細胞沒有活力為止。
[0045]5)用0.22 μ m微孔濾器除去細胞和雜質，該培養液中就含有複製缺陷型逆轉錄病毒顆粒和被分泌於培養液中的目的基因的蛋白質產物。
[0046](3)病毒的濃縮和保存
[0047]I)收集好病毒上清，500 XglOmin短暫離心樣品去除細胞碎片。
[0048]2)4°C下高速離心機50000 Xg離心90min，使病毒片狀沉澱，去除上清液。
[0049]3)0.5-1 %的原始體積TNE重懸病毒，4°C過夜孵育。
[0050]4)等分清潔的上清液，裝入單個一次性的試管，避免反覆凍融。
[0051]5) _80°C保存試管，不需要冷凍保護劑。
[0052]實施例2骨髓間充質幹細胞的分離培養、轉染及微囊化包裹
[0053](I)骨髓間充質幹細胞(BMSCs)的體外分尚與培養
[0054]取體重300g左右雄性SD大鼠(由中國科學院上海實驗動物中心提供)，氯胺酮腹腔麻醉^Omg/kg)。在嚴格的無菌條件下分離出雙側股骨，用咬骨鉗截除其遠近端。用1mL a MEM完全培養基衝洗出骨髓組織，接種於10mm培養皿，每皿10mL，置於37°C、5% CO2培養箱孵育。
[0055]初接種的細胞種類較多，倒置顯微鏡下可見滿視野圓形且折光性較強的細胞，其中多數為紅細胞不貼壁，3d後半量換液後，由於紅細胞減少，可見少量的貼壁細胞，呈棒狀或紡錘狀。7d後全量換液,瓶內見多個細胞克隆形成,細胞多伸展為長梭形。1d後，克隆增大與其他克隆逐漸融合。隨著換液次數的增加懸浮不貼壁的細胞逐漸被清除，少數夾雜生長。以後3d換一次培養液。到第14天，貼壁細胞幾乎80%匯合，骨髓間充質幹細胞外形如梭(圖1)。
[0056](2)傳代培養
[0057]I)胰酶消化:a.小心吸出舊培養液，用PBS清洗(衝洗)2次，加入適量胰酶消化液，注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37°C。b.倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，消化到細胞之間不再連接成片。c.加入1mLPBS洗掉胰酶消化液，加入新鮮的培養液。
[0058]2)吹打分散細胞:a.用滴管將已經消化的細胞吹打成細胞懸液。b.將細胞懸液吸入1mL離心管中。c.平衡後將離心管放入臺式離心機中，以1200rpm離心4min。d.棄去上清液，加入2mL培養液，用滴管輕輕吹打細胞製成細胞懸液。
[0059]3)分裝稀釋細胞:a.將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。b.倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時計數，最後做好標記。
[0060]4)繼續培養:用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋鬆瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時後開始貼附在瓶壁上。
[0061]傳代細胞培養注意嚴格的無菌操作及適度消化，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變鬆散或有成片浮起的跡象，立即終止消化。
[0062](3) PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞
[0063]75cm的培養瓶細胞貼壁生長面積為70%時進行感染實驗為宜:
[0064]I)感染前6小時對細胞進行換液處理，每瓶細胞使用6mL無血清培養基，換液後正常條件培養6小時；
[0065]2)每瓶添加實施例1得到的病毒液500 μ L，輕晃培養瓶，使之分布均勻，正常條件培養12小時；
[0066]3)每瓶補加8mL的含10% FBS的完全培養基，輕晃培養瓶，使之分布均勻，正常條件培養12小時；
[0067]4)對細胞進行換液處理，使用15mL含10 % FBS的完全培養基，正常條件培養24小時；
[0068]5)螢光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，骨髓間充質幹細胞48小時後可見有螢光蛋白表達，轉染效率在80%左右(圖2)。
[0069](4)轉染PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒的骨髓間充質幹細胞微囊化包裹
[0070]參照文獻中方法製備(丁惠鋒，湯亭亭，劉榮等.包裹骨形態發生蛋白-2基因轉染幹細胞的微囊化方法和蛋白釋放效應[J].中華實驗外科雜誌.2007，24(1):69-71.)包裹骨髓間充質幹細胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微囊。主要步驟如下:
[0071](I)將轉染PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒的骨髓間充質幹細胞懸液與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合製成細胞懸液，細胞終濃度為3X106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液。
[0072](2)於電壓為3kV，液面距25mm，推進速度30mm/h的高壓靜電場成囊裝置(上海理工大學研製)中，將該混合液滴入lOOmmol/L CaCl2溶液中並反應1min並用0.9% NaCl洗滌兩次。
[0073](3)再與0.05%聚賴氨酸溶液反應使微粒外包裹一層聚賴氨酸並反應5min後
0.9% NaCl洗滌兩次。
[0074](4)加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9% NaCl洗滌兩次。
[0075](5)最後用55mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9%NaCl洗滌兩次；
[0076](6)所得微囊置無菌培養皿中，加入DMEM培養液10mL，於37°C、5% CO2培養箱中培養待用。
[0077]注意事項:⑴細胞懸液用0.9% NaCl洗滌兩次；⑵細胞終濃度為3 X 106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液；(3)微囊製備中每步的反應時間為5-10min左右；(4)每步反應後用0.9% NaCl洗滌兩次。
[0078]利用高壓靜電裝置製造的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊形態大小基本一致，直徑基本在200 μ m左右(圖3)。微囊長時間培養後，其包裹的細胞成活率仍很高，圖4是微囊培養I周和4周在螢光顯微鏡下的生長情況。
[0079]實施例3包裹IL-1Ra轉染的骨髓間充質幹細胞的微囊體外蛋白釋放
[0080]取實施例2得到的包裹IL-1Ra轉染的骨髓間充質幹細胞的微囊(微囊內細胞總量約2.5X106/組)，於15mLaMEM(含15%小牛血清)中培養。每隔2天換培養液，換液時取上清，留作ELISA法測IL-1Ra的含量。
[0081]實驗操作嚴格按照IL-1RaImmunoassay試劑盒(R&D公司)的操作程序進行:首先將標準品進行溶解並倍比稀釋；在已用抗IL-1Ra單抗包被的微孔板內加RDl?19檢測稀釋液100 μ L，再分別加入標準品、樣品各50 μ L，每個標準品、樣品設兩個重複孔；用不含標準品及樣品的測定稀釋液RDl?19作為零對照。室溫下靜置2h，洗滌3次。然後，力口200 μ L的酶標抗體(偶聯辣根過氧化物酶的抗IL-1Ra單克隆抗體)，室溫下靜置2h，洗滌
3次。再加200 μ L的底物溶液(過氧化氫和四甲基聯苯胺)，室溫下避光靜置30min後加Λ 50 μ L終止液停止反應，30min內用酶標儀測光密度OD值(測定波長450nm)，求出標準曲線，計算出樣品含量。試劑盒的最低檢測質量濃度約為31pg/mL。
[0082]IL-1Ra分泌情況如圖5所示，表明骨髓間充質幹細胞轉染IL-1Ra基因並微囊化後可以持續表達IL-1Ra蛋白，這說明本發明製備的微囊即能使細胞在囊內長期存活，同時也保障蛋白的釋放。
[0083]實施例4包裹IL-1Ra轉染的骨髓間充質幹細胞的微囊的免疫隔離作用
[0084]在96孔板內加入100 μ L實施例2得到的包裹IL-1Ra轉染的骨髓間充質幹細胞的微囊，再加入100 μ L0.05% (w/v)紅色螢光IgG，輕輕搖晃後放入培養箱中，靜止I小時，再在雷射共聚焦顯微鏡下觀察微囊的通透性。觀察發現微囊呈現黑色，微囊外面為紅色的螢光，即紅色螢光IgG不能進入微囊內。說明本發明微囊能有效的避免抗體對囊內細胞的攻擊。
[0085]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種治療類風溼性關節炎的微囊，其特徵在於:為包裹轉IL-1Ra基因的骨髓間充質幹細胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊。
2.根據權利要求1所述的治療類風溼性關節炎的微囊，其特徵在於:直徑為200μ m。
3.根據權利要求1所述的治療類風溼性關節炎的微囊，其特徵在於:所述的骨髓間充質幹細胞來源於大鼠。
4.根據權利要求1所述的治療類風溼性關節炎的微囊，其特徵在於:所述的轉IL-1Ra基因的骨髓間充質幹細胞為將逆轉錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra轉染到骨髓間充質幹細胞得到。
5.權利要求1所述的治療類風溼性關節炎的微囊的製備方法，其特徵在於包括如下步驟: (1)利用PT67細胞株包裝重組PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒； (2)從大鼠骨髓分離培養間充質幹細胞； (3)重組PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞； (4)利用高壓靜電法製作包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒轉染骨髓間充質幹細胞的微囊。
6.根據權利要求5所述的治療類風溼性關節炎的微囊的製備方法，其特徵在於步驟(4)為: 1)將轉染PLXRN-1L-1Ra逆轉錄病毒的骨髓間充質幹細胞與海藻酸鈉混合製成細胞懸液，細胞終濃度為3X 106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液；溶劑為0.9% NaCl ； 2)於電壓為3kV，液面距25mm，推進速度30mm/h的高壓靜電場成囊裝置中，將該混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中並反應lOmin，用0.9% NaCl洗滌兩次； (3)再與0.05%聚賴氨酸溶液反應使微粒外包裹一層聚賴氨酸並反應5min，0.9%NaCl洗滌兩次； (4)加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9% NaCl洗滌兩次； (5)最後用55mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9% NaCl洗滌兩次。
【文檔編號】A61P29/00GK104127884SQ201410334116
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】張超, 嶽倩宇, 劉偉, 楊召, 趙毅, 姚紹平, 胡建華, 李宏鍵 申請人:雲南省第一人民醫院