評估類風溼性關節炎患者疾病進展的風險的製作方法

2023-09-23 20:27:30

專利名稱：：評估類風溼性關節炎患者疾病進展的風險的製作方法評估類風溼性關節炎患者疾病進展的風險本發明涉及幫助進一步評估患有類風溼性關節炎患者的體外方法。該方法特別用於評價RA患者是否處於疾病進展的風險中。該方法例如通過分析生化標記物實施，包括測定樣品中至少c-反應蛋白(CRP)和白介素-6的濃度並將測定的濃度與RA潛在的快速進展形式的可能性相關聯。處於快速進展疾病的高風險中的患者可以是需要治療或者如果已經治療還需要不同的和更有效治療的患者。本發明還涉及包含C-反應蛋白和白介素的標記物組在評估患有類風溼性關節炎的患者中的用途，以及教導了分別用於實施本發明方法的蛋白陣列裝置和試劑盒。類風溼性關節炎("RA")是慢性、炎性、全身性疾病，其最突出的表現產生於受侵襲的關節，特別是手和腳的關節。類風溼性關節炎的發病可以緩慢發生，從數周到數月，或者症狀可以急性方式快速顯現。RA具有世界性的分布並且涉及所有的種族群體。雖然疾病可以發生於任何年齡，但患病率隨著年齡增加並且發病率高峰在40歲到60歲之間。北美人口患病率估計從0.3%到1.5%不等。如今，僅在美國超過2,500,000個體被診斷患有類風溼性關節炎，某些統計顯示650萬到800萬的人可能患有該疾病。通常受侵襲的女性比男性多2-3倍。類風溼性關節炎的早期症狀主要是關節特異性的，例如伴有關節肺脹或壓痛的疼痛的關節，但也可以包括諸如僵硬、發熱、皮下結節和疲勞的非特異性表現。非常的特徵是關節的對稱性受累。最常受侵襲的是手、腳、膝和腕的關節，最終累及髖、肘和肩。隨著疾病的進展，任何類型的運動都變得非常疼痛和困難，最終導致受累關節的功能的喪失。類風溼性關節炎更嚴重的情況會導致劇烈疼痛和關節破壞。為了緩解疼痛和與關節炎有關的關節破壞導致的運動喪失每年實施300,000例骨和關節置換術。最廣泛使用的分類RA的體系是美國風溼病學會於1987年修訂的用於RA分類的標準(Arnett,F.C.,等，ArthritisRheum.31(1988)315-324)。根據這些標準(稱為ARA標準)，如果患者滿足下列七個標準中的至少四個，其中標準1-4必須存在至少6周，則患者被診斷為患有RA:l)晨僵至少一小時，2)3個或更多關節部位的關節炎，3)手關節的關節炎，4)對稱性關節炎，5)類風溼性結節，6)血清類風溼因子("RF"),和7)放射學改變。這些標準具有大約90%的靈敏度和特異性。RA的組織學改變不是疾病特異性的，但主要取決於所涉及的器官。初期的炎性關節損傷累及滑膜。如通過電鏡法證實的，最早期的改變是滑液的微脈管系統損傷，伴有內腔閉塞、內皮細胞腫脹以及內皮細胞間隙。這個階段通常伴有表皮襯細胞層的輕度增殖。兩種細胞類型構成滑膜襯裡骨髓衍生型A滑膜細胞，其具有巨噬細胞特性，和間質型B滑膜細胞。兩種細胞類型均導致滑膜增生，暗示這兩種細胞類型之間的旁分泌相互作用。這個階段的炎症與充血、水胂和纖維蛋白滲出有關。細胞浸潤發生於早期疾病並且開始主要由T林巴細胞組成。由於炎症，滑膜因血管和滑液成纖維細胞增殖和滑液襯層的增加和增大而變得肥大。肉芽組織延伸至軟骨稱為血管翳。該組織在滑膜和骨的邊緣積極地侵襲並破壞關節周圍的骨和軟骨，稱為侵蝕性RA。RA的關節表現可以分為兩類與炎性滑膜炎有關的可逆的徵兆和症狀以及滑膜炎引起的不可逆的結構性損傷。這種概念不僅對疾病分期和決定預後是有用的，對選擇藥物和手術治療也是有用的。典型的患者中的結構性損傷通常開始於疾病第一年和第二年間的某些時間(麗derHeijde,D.M.，等，Br.J.Rheumatol.34,S叩pl.2(1995)74-78)。雖然滑膜炎往往遵循波動的方式，但結構性損傷隨著在先滑膜炎的量的線性函數進展。RA中早期症狀的病因學仍然難以確定。如今自身免疫部分已被廣泛接受但其它因素仍然存在爭議。已經極力推行了細菌或病毒感染的可能性。所有通過分離、電鏡法或分子生物學將傳染原與RA相聯繫的努力都失敗了。可能沒有RA單一的原發性誘因，不同的機制會導致初期的組織損傷並促成滑膜炎症。滑膜炎的臨床徵兆可以是敏感並且常常是主觀的。發熱的、腫脹的、明顯發炎的關節通常只能在炎性滑膜炎最活躍的階段觀察到。軟骨損傷和關節周圍骨的侵蝕是結構性損傷的特徵。與結構性損傷相關的臨床特徵的標誌為功能上和解剖上的進行性退化。關節的結構性損傷是不可逆的和累加的。縱向臨床和流行病學研究的數據為治療提供了指導。這些研究強調l)需要早期診斷，2)預後因素的鑑別，以及3)早期有力地治療。更早的診斷和治療，優選在症狀出現後的前幾個月，可以幫助預防不可逆的關節損傷。類風溼性關節炎的有效治療通常包括藥物的組合、運動、休息和適當的關節保護治療。非甾體抗炎藥、皮質激素、金鹽、曱氨喋呤和全身性免疫抑制劑被廣泛地用於減少炎症和關節破壞。但是，類固醇和免疫抑制劑的應用在毒性和對可能的致命症狀的易損性方面具有顯著的風險和副作用。最近基於"生物製劑"的治療引入到RA治療中。這種療法，例如，是對抗顯著減少炎症的TNF-a的可溶性受體或抗體。雖然非常具有前景，但由於高昂的成本生物製劑仍處於有限的使用中。建立診斷或評估疾病進展的風險的理想方案是單一事件或病變會引起各自的疾病的情況，例如在感染性疾病中。在其他所有情況中正確的診斷是非常困難的，尤其是當疾病的病因學沒有被完全理解的時候，如針對RA的情形。因此在RA中，通常不同的臨床症狀和生物學標記物會一起考慮用於RA的診斷或評估疾病進展的風險。用於幫助RA診斷的第一種生化標記物並且唯一廣泛接受的標記物(參見上述ARA-標準)是血清中檢測到的類風溼因子(RF)。最近已經引入新的稱為抗-CCP的標記物。已經證實在許多獨立的研究中環瓜氨酸肽的自身抗體(抗-CCP)代表了用於RA的診斷的高敏感性和特異性標記物。在過去的幾年中幾組研究人員對抗-CCP進行了深入的研究(參考，例如，WO98/08946;WO98/22503;WO99/28344;WO99/35167;WO01/46222;和WO03/050542)。最近Schdlekens和同事(Schellekens，G.A.，ArthritisRheum.43(2000)155-163)報導與使用線性肽的相同測定相比，基於特異性環瓜氨酸肽(CCP)的ELISA-試驗對於RA診斷準確度顯示優越的性能特性。對抗CCP的自身抗體，即最可能與患者血清中的瓜氨酸多肽循環反應的和在體外測定中結合CCP的抗體稱為"抗-CCP"。VanVenroji等的專利申請(WO98/22503)描述了某些瓜氨酸肽並證實環化導致自身抗體對這些肽提高的反應性。與相應的線性肽的36%相比，通過使用改善的CCPs作為抗原用於檢測抗-CCP抗體，靈敏度可以提高到63%。98/22503中建議了肽的組合以進一步改善測定。許多研究小組近來顯示並證實與RF相比，抗-CCP是建立RA診斷更敏感和特異性的標記物。抗-CCP自身抗體對RA是高度特異性的(約97%特異性)，具有可與RF(65-80%)相比的靈敏度(Lee,D.M.和Schur,P.H.,Ann.Rheum.Dis.62(2003)870-874;Pruijn,G丄M.,等，Curr.Rheumatol.Rev.l(2005)1-7;Vallbracht,I.，等，Ann.Rheum.Dis.63(2004)1079-1084)。此外具有額外診斷價值的是抗-CCP可以在顯著比例的血清反應陰性的RA患者中檢測到(vanPaassen,P.,等，BestPract.Res.Clin.Rheumatol.17(2003)475-494;Vallbracht,I.,等,Ann.Rheum.Dis.63(2004)1079-1084;Schellekens,G.A.，等，ArthritisandRheumatism43(2000)155-163)。這意味著抗-CCP自身抗體存在於顯著比例的對RF(血清)陰性的患者中。如上文討論的，建立RA診斷和決定最佳的治療選擇不是容易的任務。個體RA患者中病程顯著不同。迄今為止對RA中差結果沒有唯一的和廣泛接受的指標。與預後不良有關的指標包括，例如累積關節炎症、高ESR或CRP水平、RF陽性、早期放射學侵蝕、更差的功能分數和不利的社會經濟狀況。使情況更加複雜的是，評估RA的預後還缺乏清楚的和廣泛接受的疾病進展的定義。為了評估RA中的治療反應開發了一些評分-根據臨床症狀、影像改變或者身體功能。但是，大多數評分僅用於臨床試驗設置，而很少或完全不用於風溼病學實踐中。實例是美國風溼病學會(ACR)和歐洲防治風溼病聯盟(EULAR)設計的不同反應標準(Felson，D.T.,等，ArthritisandRheumatism38(1995)727-735;vanGestel,A.M.,等，ArthritisandRheumatism39(1996)34-40)。ACR改善標準和EULAR反應標準都廣泛地用於臨床試驗設置，但沒有用於臨床實踐中。對用於根據Sharp或Larsen及其迄今可得到的一些變體的放射學改變的評估的評分系統情況也是如此。雖然X-射線被用於每隔一定間隔監測放射學疾病進展，它們只是與以前的X-射線比較但不評分。此外，在歐洲DAS(疾病活性評分)及其簡化版(DAS28、SDAI、CDAI)廣泛地用於處於治療中的疾病監測。DAS包括觸痛和肺脹的關節計數、ESR或CRP和疾病活性的整體評估(使用VAS-直觀類比標度)。在很小的程度上軀體功能的評估在疾病狀態的監測中也起作用。這些是基於不同患者的問巻調查-RA中最廣泛使用的是HAQ(健康評估問巻)(Bruce，B.和Fries,J.F.,HealthQualLifeOutcomes1(2003)20)和SF-36(簡表36)(Talamo,J.，等，BriU.Rheumato1.36(1997)463-469)。但是，上文提及的工具遠不是最佳的。它們費時並且受到主觀評定的影響，例如，在HAQ或觸痛/腫脹的關節計數的情況中。最近，已經進行了嘗試通過在這種評估中包括更多的生化標記物以進一步評估RA不同的方面，或者甚至將這種評估基於生化標記物。Coste,J.等(TheJournalofRheumatology24(1997)28-34)研究了二十個臨床和實驗室參數預測RA中關節破壞的能力。發現鐵、CRP、ESR和al-酸糖蛋白與疾病進展的統計學顯著相關性。但是，相關性不是非常強並且只存在於隨訪的前6個月。Aman，S,等Rheumatology39(2000)1009-1013研究了RA中疾病進展是否可以通過標記物IC丁P、RF和CRP預測。他們發現對於個體標記物優勢比為2.6-3.9,最好的標記物比率具有9.1的優勢比。該優勢比在77%的靈敏度下轉化為71%的特異性。但是，71%的特異性是相當低的，因為在臨床常規中需要至少80%,或優選甚至至少90%的特異性。Vissse，H，等ArthritisandRheumatism46(2002)357-365，提出了"持續性(侵蝕)關節炎的預測模型"。他們的模型由包含7個變量的發展預測模型組成初診時症狀持續時間、晨僵^1小時、23處關節的關節炎、蹠趾關節兩側壓迫性疼痛、類風溼因子陽性、抗環瓜氨酸肽抗體陽性以及侵蝕(手/腳)的存在。可見兩種生化標記物，RF和抗-CCP，形成他們的算法一部分。最近,Meyer,O,等(ArthritisResearchandTherapy8/2(2006)R40),提出在隨訪五年後使用抗-CCP自身抗體的系列測定來預測放射學結果。他們證實在基線處抗-CCP測定不是疾病進展的充分預測因子。但是，在基線處進展預測中的幫助正是從業醫生所需要的。然而RF和抗-CCP都是建立RA診斷的重要工具，它們似乎不是7預測未來病程中的有力幫助。已經提出了許多標記物或許多組標記物，但是迄今所獲得的優勢比還不充分或者基於太多種類的生化和臨床參數而不能滿足臨床常規需要。因此，存在對特別是基於生化參數，幫助評估RA患者是否處於疾病進展的風險中的方法的巨大的需要。現已驚奇地發現CRP和白介素-6兩種標記物互相補充並因此導致在患者經歷更嚴重RA病程的風險評估中的改善。通過提供體外評估RA患者是否處於疾病進展的風險中的方法和試劑，預期本發明至少部分克服評估RA患者是否處於疾病進展的風險中的領域中存在的問題。發明概述本發明涉及幫助評估患有類風溼性關節炎(RA)的患者疾病進展的風險的方法，該方法包括獲得液體樣品、測定所述樣品中C-反應蛋白(CRP)和白介素-6以及4壬選的一種或多種其^f也標記物的濃度、以及將測定的CRP和白介素-6以及任選的一種或多種其他標記物的濃度與疾病進展的風險相關聯的步驟。還/>開了包括至少CRP和白介素6的標記物組在評估患有RA的患者疾病進展的風險中的用途。進一步地本發明涉及實施幫助評估患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險的方法的試劑盒，如本發明公開的這種試劑盒包括分別特異性測定CRP和白介素-6所需的試劑，以及任選的實施測定的輔助試劑。還公開了用於評估患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險的，包括至少合適的用於CRP和白介素-6測定的特異性結合配偶體(partner)以及任選的合適的一種或多種其他標記物的特異性結合配偶體的蛋白陣列裝置。發明詳述在第一個優選的實施方案中本發明涉及幫助評估患有類風溼性關節炎(RA)的患者疾病進展的風險的方法，該方法包括步驟a)獲得液體樣品，b)測定所述樣品中C-反應蛋白(CRP)和白介素-6以及任選的一種或多種其他標記物的濃度，和c)將步驟(b)中測定的濃度與疾病進展的風險相關聯。如本文使用的，每一個下列術語具有在本部分中與其相關的含義。本文使用的冠詞"一種(個)"是指一種(個)或多於一種(個)(即至少一種(個))該冠詞的語法對象。例如，"一種標記物"是指一種標記物或多於一種標記物。本文使用的術語"標記物"是指生化以及臨床標記物。術語標記物和參數可以互換使用。本文使用的"生化標記物"或"生物標記物"是指作為目標用於分析患者測試樣品的生物分子。這種分子目標的實例是核酸、蛋白或多肽本身以及存在於樣品中的抗體。在本發明的意義上"臨床標記物"是指RA患者的標準化臨床評估。優選的臨床標記物是例如疾病活性評分和/或放射學評分的評分。在本發明中用作標記物的蛋白或多肽是意在包括所述蛋白的任何變體以及所述蛋白或所述變體的碎片，特別地，患者體液中存在的免疫可檢測的碎片。本領域技術人員會認識到細胞釋放的或者存在於受損的細胞外基質中的蛋白，例如，在炎症期間，可以降解或者裂解成這種碎片。以非活性形式合成某些標記物，其隨後通過蛋白水解作用被活化。本領域技術人員可以理解，蛋白或其碎片也可以作為複合物的一部分存在。在本發明的意義上這種複合物也可以用作標記物。標記物多肽的變體可以通過相同的基因編碼，但它們的PI或MW不同，或者兩個都不同(例如，選擇性mRNA或mRNA前體加工的結果，例如，可變剪接或有限蛋白酶解)，此外，或者可選擇的，可以來源於差異翻譯後修飾(例如，糖基化、醯化和/或磷酸化)。如上文所示，本發明的術語標記物也涉及存在於樣品中的抗體。在本案中，即，在RA中，這些抗體是自身抗體。自身抗體是患者樣品中的抗體，其結合於存在於患者自身細胞內、或細胞上，或由患者自身細胞產生的抗體。本文中使用的術語"樣品，，是指為了體外評估而獲得生物樣品。在本發明的方法中，樣品或患者的樣品優選可以包括任何體液。優選的測試樣品包括血液、血清、血漿、尿、唾液和滑液。優選的樣品是全血、血清、血漿或滑液，血漿或血清是最優選的。樣品僅用於本發明的體外診斷方法，剩餘的樣品材料不會轉移回患者體內。一旦分析完成即丟棄樣品。術語"幫助"評估疾病進展的風險是指本發明的方法(與其他變量一起，例如，臨床參數或從屬權利中公開的參數)會幫助醫生評估患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險。本發明涉及評估患有類風溼性關節炎(RA)的患者疾病進展的風險的體外方法，該方法包括a)獲得液體樣品，b)測定所述樣品中C-反應蛋白(CRP)和白介素-6和任選的一種或多種其他標記物的濃度，以及c)將步驟(b)中測定的濃度與疾病進展的風險相關聯的步驟。該方法將會成為醫生考慮的一個組成部分從而幫助即幫助他評估疾病進展的風險。術語"評估風險"或"評估可能性"，例如，疾病進展的，是指當實施本發明的方法時，結果總是顯示進行性RA的相對風險性或相對可能性。結果越高，RA患者經歷進行性病程的相對風險性也越高。在本發明的意義上"疾病進展"是通過Sharp-Genant-評分評估的。進展率每年>5的患者(在1或2年後Sharp-Genant-評分從基線的改變)被分類為具有疾病進展的RA患者。所有其他患者被分類為無疾病進展。"患有類風溼性關節炎的患者"是滿足美國風溼病學會為類風溼性關節炎的分類而制定的修訂標準的患者(Arnett,F.C.,等，ArthritisRheum.31(1988)315-324)。這些標準通過引用結合到本文中。本發明的發明人已經定義了兩種亞群的RA患者，顯示疾病進展的患者以及顯示無疾病進展的RA對照人群或亞群，研究了基於這些患者群生化標記物預測疾病進展的可能性。令人驚奇地，能夠發現並確定在臨床需要的高特異性下CRP力口白介素-6的標記物組合對改善RA患者的病程預測的靈敏度是重要的。在本發明的方法中至少分別測定生物標記物CRP和IL-6的濃度，並將該標記物組合與診斷患有RA的患者的疾病進展的風險相關聯。本領域技術人員將會理解將標記物水平與某種可能性或風險相關的步驟可以以不同的方式實施和完成。優選地標記物CRP和IL-6測定的值進行數學組合，將組合的值與潛在的診斷問題相關聯。標記物值可以通過任何合適的現有技術的數學方法進行組合。優選用於標記物組合的數學算法是邏輯函數。運用這種數學算法或這種邏輯函數的的結果優選是單一值。該值可以容易地與RA疾病進10展的風險相關聯。在一種優選的方式中，這種邏輯函數是通過a)將RA患者分為經歷疾病進展的患者組和沒有經歷疾病進展的患者組，b)通過單變量分析鑑定這些組之間差異顯著的標記物，c)邏輯回歸分析以評估用於評估RA疾病進展的標記物的獨立區別值，以及d)建立邏輯函數以組合獨立區別值而獲得的。在一個優選的實施方案中，用於組合CRP和IL-6值的邏輯函數是通過a)將RA患者分別分為經歷疾病進展的患者組和沒有經歷疾病進展的患者組，b)建立CRP和白介素-6的值，c)進行邏輯回歸分析以及d)建立邏輯函數以組合CRP和IL-6標記物的值而獲得的。在一個進一步優選的實施方案中，用於將CRP和IL-6的測定與一種或多種其它標記物的值組合的邏輯函數是通過a)將RA患者分為經歷疾病進展的患者組和沒有經歷疾病進展的患者組，b)通過單變量分析鑑定這些組之間差異顯著的一種或多種其它的標記物，c)進行邏輯回歸分析以評估所述的標記物在評估RA疾病進展中對CRP和白介素-6的組合是否具有附加區別值以及d)建立邏輯函數以組合CRP、白介素-6以及一種或多種其它標記物的測定值而獲得的。用於將標記物組合與疾病相關聯的邏輯函數優選釆用通過使用統計學方法開發和獲得的算法，統計學方法例如判別分析(DA)(即線性的-、二次的-、規則化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非參數方法(即k-最近鄰分類法)、PLS(偏最小二乘法)、基於樹的方法(即邏輯回歸、CART、隨機森林方法、Boosting/Bagging方法)、廣義線性模型(即邏輯回歸)、基於主組分的方法(即SIMCA)、廣義相加模型、基於模糊邏輯的方法、基於神經網絡和遺傳算法的方法。本領域技術人員會毫無問題地選擇合適的統計學方法來評估本發明的標記物組合併因此獲得合適的數學算法。優選獲得用於將本發明的標記物組合與RA疾病進展的風險相關聯的數學算法的統計學方法選自DA(即線性的、二次的、規則化的判別分析)、Kernel方法(即SVM)、非參數方法(即k-最近鄰分類法)、PLS(偏最小二乘法)、基於樹的方法(即邏輯回歸、CART、隨才幾森林方法、Boosting方法)或廣義相加模型(即邏輯回歸)。關於這些統計學方法的細節可以參見下列參考文獻Ruczinski,L,等,J.ofComputationalandGraphicalStatistics12(2003)475-511;Friedman,J.H.，丄oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175;Hastie,T.,等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerVerlag(2001);Breiman,L.，等，Classificationandregressiontrees,California,Wadsworth(1984);Breiman,L.,RandomForests,MachineLearning45(2001)5-32;Pepe，M.S.,TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries,28(2003);和Duda,R.O.,等,PatternClassification,WileyInterscience,第2版(2001)。本發明的一個優選的實施方案是使用生物學標記物的潛在組合的最優化的多變量臨界值(cut-off)並分別區分狀態A和狀態B,例如，RA疾病進展和非RA疾病進展。在這種類型的分析中標記物不再是獨立的而是形成標記物組。能夠確定組合CRP和IL-6的測定結果的確顯著改善評估患有RA的患者疾病進展的風險的診斷準確度。在多變量分析中，CRP、IL-6和其它一些標記物具有約0.7-約0.8的曲線下面積(AUC)。CRP和IL-6均為炎症標記物並且它們彼此高度相關。因此，很意外地觀察到CRP和IL-6可以組合併且作為個體標記物在相同的特異性水平下在靈敏度方面顯示巨大的改善。AUC是診斷過程的性能或準確度的指標。診斷方法的準確度最好通過其受試者操作特性(ROC)描述(參見特別是Zweig，M.H.,和Campbell,G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲線圖是在整個觀察的數據範圍內由連續變化決定閾值(decisionthresh-hold)得到的所有靈敏性/特異性對的曲線。ROC曲線下的面積稱為AUC。實驗室試驗的臨床性能取決於其診斷準確度，或將受試者正確分類為臨床上相關亞群的能力。診斷準確度測定正確區分被研究的受試者兩種不同症狀的試-瞼的能力。這種症狀是例如健康和疾病或疾病進展對沒有疾病進展。在每個病例中，ROC曲線通過在決定閾值的全部範圍將靈敏性對l-特異性作圖，描述了兩種分布之間的重疊。在y軸上是靈敏度，或真陽性率[定義為(真陽性試驗結果數)/(真陽性數+假陰性測試結果數)]。這也是指疾病或症狀存在下的確定性。它由受影響的亞群單獨計算。在x軸上是假陽性率或l-特異性[定義為(假陽性結果數)/(真陰性數+假陽性測試結果數)]。它是特異性的指數，並完全地由未受影響的亞群計算。因為通過使用來自兩個不同亞群的試驗結果，完全獨立地計算真和々i陽性率，所以ROC曲線不依賴於樣品中疾病的患病率。ROC曲線上的每個點代表對應於特定決定閾值的靈敏性/l-特異性對。具有完美辨別力的試驗(在結果的兩個分布中沒有重疊)具有通過左上角的ROC曲線，在左上角，真陽性率是l.O，或100%(完美的靈敏度)，並且假陽性率是0(完美的特異性)。無辨別力的試驗的理論曲線(兩組結果相同的分布)是從左下角至右上角的45°對角線。大多數曲線落在這兩個極端之間(如果ROC曲線完全落在45°對角線下，可以容易地通過將"確定性，，的標準從"高於"反轉為"低於"進行校正，反之亦然)。定性地，曲線越接近左上角，試驗的總準確率也就越高。定量實驗室試驗的診斷準確度的一個方便的目的是通過單獨的數字表示其性能。最普通的總體測定是ROC曲線下面積(AUC)。按照慣例，該面積總是^).5(如果不是，可以反轉決定規則使其這樣)。值在1.0(兩組試驗值的完美分離)和0.5(兩組試驗值之間沒有明顯的分布差異)之間。該面積不僅取決於曲線特定的部分，例如最接近對角線的點或90%特異性的靈敏度，也取決於整個曲線。這是ROC曲線如何接近於完美ROC曲線(面積=1.0)的定量、描述性表述。總的測定靈敏度將取決於實施本文公開的方法所需的特異性。在某種優選的情況中，75%的特異性可能是足夠的，統計學方法和所得算法可以基於這種特異性需要。在進一步優選的實施方案中，用於評估患有RA的患者疾病進展的風險的方法基於80%、85%或者特別優選90%或95%的特異性。由實施例部分可以明顯看出，在90%的特異性下使用CRP和IL-6的標記物組合具有大約50%的良好的靈敏度。這相當於大約20%的總誤差，並且比單獨基於個體生化標記物使用現有技術的方法獲得的總誤差要更好。使用給定的測定方法測量並確定了實施例部分中CRP和IL-6給定的水平。應當理解不同的測定會導致不同的臨界值。本領域技術人員會毫無問題的按照本發明描述的方法確定這種供應商依賴性(supplierdependent)臨界值。白介素-6(IL-6)是具有大量生物學活性的21kDa的分泌性蛋白，是i、性期反應物，刺激多種蛋白的合成，包^粘附分子。其主要功能是介導肝臟蛋白的急性期生成，並且其合成是通過細胞因子IL-1和TNF-a誘導的。IL-6通常是由巨噬細胞和T淋巴細胞生成的。IL-6正常的血清濃度是<5pg/ml。檢測例如CRP和IL-6的生物標記物的優選方法是特異性結合測定，特別是免疫測定法。免疫測定法是本領域技術人員熟知的。進行這種測定的方法以及實際應用和操作總結於相關的教科書中。相關教科書的實例是Tijssen，P.,In:Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays，eds.R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg，Elsevier,Amsterdam(1990),pp.221-278,和多巻MethodsinEnzymology,eds.Colowick,S.P.,和Caplan，N.O.,AcademicPress,dealingwithimmunologicaldetectionmethods,淨爭別是70、73、74、84、92和121巻。例如IL-6可以通過竟爭性或夾心型(sandwich)免疫測定法進行測定。優選IL-6是在夾心型免疫測定法中測定的，夾心型免疫測定法基本上基於特異性結合於IL-6的抗體，IL-6直接或間接連接或能夠結合於固定相，特異性結合於可被檢測標記的IL-6的抗體，並且在允許抗IL-6抗體與樣品中IL-6結合的條件下培養這些反應物，分離未結合的可檢測標記的抗體，測定通過IL-6結合的標記的抗體的量，以及將結合的標記抗體的量與樣品中IL-6的濃度相關聯。C-反應蛋白(CRP)是具有21kDa亞基的涉及宿主防禦的均五聚體(homopentameric)Ca"-結合急性期蛋白。CRP合成是由IL-6誘導的，並由IL-I間接誘導，因為IL-I可以引發通過肝竇中的K叩ffer細胞的IL-6的合成。在卯°/。的健康人群中CRP正常的血漿濃度是〈3^g/ml(30nM),在99%的健康個體中<10嗎/ml(100nM)。血漿CRP濃度可以，例如通過均質測定形式或ELISA測定。CRP被認為是全身性炎症的標記物。進一步混雜和合併患有RA的患者疾病進展的風險評估的因素是患者在就診的時候可以是在疾病發展的不同階段和處於不同的治療方案中。本發明的發明人已經能夠證實所發現的標記物組合對還沒有使用抗風溼藥物治療的患者和已經處於使用緩解疾病的抗類風溼性藥物(DMARD)治療的患者具有預測性。特別是後來的發現具有更大的相關性，其顯示本發明公開的方法可以幫助鑑定那些對使用DMARD治療不響應或者不充分響應的患者。在一個優選的實施方案中本發明的方法是使用從處於使用選自緩解疾病的抗類風溼性藥物(DMARD)的抗風溼藥治療的RA患者獲得的樣品實施的。還優選，本文公開的方法是使用從還沒有處於使用抗風溼藥治療的RA患者獲得的樣品實施的。相信隨著CRP和IL-6標記物組合的鑑定，用於評估患有RA的患者疾病進展的風險的重要地標記物組合還沒有被鑑定。如本發明人進一步所示，評估患有RA的患者疾病進展的風險的方法可以進一步通過將兩種關鍵標記物CRP和IL-6的測定與進一步的參數組合來改善。在一個進一步優選的實施方案中，本發明涉及包括a)獲得液體樣品，b)測定所述樣品中C-反應蛋白(CRP)和白介素-6以及一種或多種其它標記物的濃度，c)將步驟(b)中測得的濃度與疾病進展的風險相關聯的步驟，其中任選的一種或多種其他標記物選自骨或軟骨標記物、滑液標記物、其他炎症標記物、遺傳標記物和放射學評分。在一個優選的實施方案中用於本發明方法的一種或多種其他標記物是骨或軟骨標記物，優選所述的骨或軟骨標記物選自PINP、卩-CrossLaps、CartiLaps、骨4丐素和ICTP,還優選一種或多種骨或軟骨標記物是ICTP和/或CartiLaps。最顯著的關節組織是骨、軟骨和滑膜。由於類風溼性關節炎是破壞性疾病，這些組織受到影響的最多。在RA領域它們是潛在的生物學標記物可能的來源。原則上這些標記物不4義可以來自於各自組織的石皮壞也可以來自於失控和/或無效的修復過程。有經驗的技術人員會理解，骨、軟骨和滑膜代謝的標記物可以來源於這些組織的合成或破壞。多種骨、軟骨和滑膜代謝的標記物可以由兩種不同組的蛋白進行描繪。它們來自於多種類型的膠原或非膠原蛋白。非膠原蛋白通常參與細胞外基質的形成。在所有三種組織中可以發現不同量的其中一些標記物。骨和/或軟骨標記物包括骨和/或軟骨膠原降解的標記物以及骨和/或軟骨膠原形成的標記物。優選的膠原衍生的骨或軟骨標記物是1.吡咬諾林(=PYD)、脫氧吡啶諾林(=DYD)和Glc-Gal-PYD:吡啶諾林(=PYD)通過交聯膠原三螺旋的鏈穩定膠原。PYD的化學結構非常穩定，作為膠原降解的最終產物可以在血清和尿中發現(Knott,L.,和Bailey，A丄，Bone22(1998)181-187)。其與關節炎有關(Kaufmann，丄，等，Rheumatology42(2003)314-320)。PYD監測參與關節破壞的軟骨，因為其由軟骨釋放，並且僅一定程度上由骨釋放，而其近親脫氧吡啶諾林(=DYD)主要來源於骨。所有三種標記物與關節炎相關(Kaufmann,supra)。糖基化形式的Glc-Gal-PYD主要發現於滑液組織(Gineyts,E.,等，Rheumatology40(2001)315-323)。2.交聯端肽CTX-I、CTX-II、NTX-I、LQ-表位，它們是分別來自於I型或II型膠原的C-或N-末端的交聯端肽，其中卩-CTX-I也稱為卩-CrossLaps⑧(Bonde，M.,等，Clin.Chem.40(1994)2022-2025)。3.I型膠原羧基末端終肽(-ICTP)是指I型膠原片段和標記物，其初期來源於I型膠原通過氰溴化物裂解(US5,538,853)。4.來源於膠原的線性肽稱為。&1^&口8@的測定法測量來源於II型膠原C-末端區域的線性肽(US6,372,442)。5.修飾的胺基酸膠原包含例如羥基脯氨酸和半乳糖羥基賴氨酸的修飾的胺基酸，其可以用作膠原降解的標記物(Al-Dehaimi，A.W.,等，Clin.Chem.45(1999)676-681)。6.膠原新表位(neoepit叩es):Col2-3/4和CIIN是通過膠原酶由II型膠原的初期裂解生成的新表位(Billinghurst,R.C.,等，J.Clin.I鵬st.99(1997)1534-1545)。7.考慮過的反映骨形成的膠原標記物I型膠原的N-末端以及C-末端前肽(=PINP和PICP),分別在合成期間/之後由前體多肽(前膠原)和骨形成的考慮過的標記物剪切得到。PIICP是來自II型膠原的相對應的前肽，而PIIINP來源於III型膠原。還優選骨或軟骨標記物是非膠原標記物，例如CS846,其為在聚集蛋白聚糖合成期間生成的硫酸軟骨素表位；在軟骨中具有橋接功能的軟骨低聚物基質蛋白(=COMP)(Saxne,T.,和Heinegard,D.，Br丄Rhe醒to1.31(1992)583-591);軟骨間層蛋白(=CILP),其為軟骨的基質蛋白(Lorenzo,P.,等，J.Biol.Chem.273(1998)23463-23468);軟骨基質蛋白1-3也稱為matnlins;在軟骨中作為信號分子的chondromodulins(Suzuki,F.,Connect.TissueRes.35(1996)303-307);軟骨原性視黃酸敏感蛋白(=CD-RAP)或MIA,其在軟骨細胞調控中具有尚未確定的功能(Mueller-Ladner，U.,等，Rheumatology38(1999)148-154);骨4丐素，其由成骨細胞合成，屬於主要的骨非膠原基質蛋白，用於監測骨轉換(Gundberg,C.M.，等，J.Clin丄igandAssay21(1998)128-138);以及骨唾液蛋白，其為主要的骨非膠原基質蛋白，例如骨唾液蛋白II,現稱為骨唾液蛋白，其例如作為標記物用於評估骨轉換(Saxne,T.,等，ArthritisRheum.38(1995)82-90)。在一個優選的實施方案中本發明方法中所用的一種或多種其他標記物是滑液標記物，選自基質金屬蛋白酶l(=pro-MMP-l)、基質金屬蛋白酶3(=pro-MMP-3)、透明質酸，優選地一種或多種其他滑液標記物是透明質酸和pro-MMP3。基質-金屬蛋白酶(=MMP)家族降解幾乎所有的細胞外基質的組分。因此MMP不僅和多種類型的癌症相關，也與RA中的炎症過程相關。MMP1和MMP3是由成纖維細月包、成骨細月包和內皮細月包通過例如IL-1或TNF-a的促炎細胞因子刺激生成的。通常在循環中發現作為無活性的前體形式的MMP，即，分別作為pro-MMPl和pro-MMP3。已經在RA患者的滑液中檢測到pro-MMP1和pro-MMP3，它們的水平對抗TNF-a療法敏感。用於評估患有RA的患者疾病進展的風險的標記物組中使用的最優選金屬蛋白酶是pro-MMP3。除了上文提及的金屬蛋白酶，也可能使用它們統稱為基質金屬蛋白酶的組織抑制劑(=TIMP)的相應的抑制劑，例如，MMP-1和MMP-3在體內通過TIMP-1失活，TIMP-1是29.5kD的唾液糖蛋白，其與MMP形成1:1的定比化學複合物。已經研究了RA中TIMP1和TIMP-2與軟骨的破壞的關係(Ishiguro,N.,等，ArthritisRheum.44(2001)2503-2511)。葡糖胺聚糖透明質酸是一種關節功能必需的大分子。它是由成纖維細胞和其它特殊結締組織細胞合成的。透明質酸參與細胞外基質的形成和細胞與細胞間的接觸。在滑液中發現高濃度，在其中負責水分的保持從而有助於關節的潤滑。在類風溼性關節炎中透明質酸的合成由促炎症介質IL-1和TNF-a刺激，導致增加血清/血漿水平(Sawai,T.,和Uzuki,M.,ConnectiveTissue33(2001)253-259)。在一個優選的實施方案中，本發明方法中所用的一種或多種其他標記物是遺傳標記物，選自HLA-DR4和HLA-DRB1等位基因，優選地一種或多種其他遺傳標記物是HLA-DRBTOl或/和HLA-DRBr04等位基因(Goronzy,J丄，等，ArthritisandRheumatism50(2004)43-54)。在一個優選的實施方案中本發明方法中所用的一種或多種其他標記物是放射學評分，優選地所述的放射學評分選自Sharp-評分、Sharp-Genant-評分、vanderHeijde-Sharp-評分、Ratingen-評分、Larsen-評分、RAU-評分和Herborn-評分，還優選一種或多种放射學評分是Sharp-Genant-評分或/和Larsen-評分。"Sharp-評分，，首先在1971年被提出(Sharp,J.T.,等，ArthritisandRheumatism14(1971)706-720)並在1985年被進一步闡明(Sharp,J.T.,等，ArthritisandRheumatism28(1985)1326-1335)。"Sharp-Genant-評分"是Genant於1983年提出的"Sharp-評分"的修正版(Genant,H.K.,Am丄Med.75(1983)35-47)。"vanderHeijde-Sharp-評分"是vanderHeijde於1989年提出的"Sharp-評分，，的修正版(vanderHeijde,D.M.F.M.，Lancet1(1989)1036-1038)。"Larsen-評分"首先在1977年被提出(Larsen,A.，等，ActaRadiol.Diagn.18(1977)481-491)。"RAU-評分"有時也稱為"Ratingen-評分"是Larsen-評分的修正版(Rau，R.和Wassenberg,S.，Z.Rheumatol.62(2003)555-565)。在一個優選的實施方案中本發明方法中所用的一種或多種其他標記物是炎症的進一步標記物，優選所述的炎症的進一步標記物是炎症標記物，選自S100-蛋白、紅細胞沉降率(ESR)、SAA和E-選4奪素，優選它是SAA或/和E-選擇素。術語"炎症的其它標記物"或"炎症的進一步標記物"是指這些標記物不是CRP和IL-6。血清澱粉樣蛋白A(二SAA)是U.7kDa的低分子量的急性期蛋白。其主要是通過肝對IL-1、IL-6或TNF-a刺激響應而合成，並參與T-細胞依賴性免疫應答的調控。在急性症狀下SAA的濃度增加至1000倍，達到每毫升1毫克。其用於監測疾病例如嚢性纖維化、腎移植排斥、外傷或感染中的炎症。在類風溼性關節炎中在某些情況下它用作CRP的替代物，但是，SAA還沒有被廣泛地接受。S-100蛋白形成不斷增加的Ca^結合蛋白家族，如今包括超過20個成員。S-100蛋白的生理學相關結構是同型二聚體，但某些也可以互相形成異型二聚體，例如S100A8和S100A9。其細胞內功能從蛋白質磷酸化、酶活性或細胞骨架動態的調控到參與細胞增殖和分化。由於某些S100-蛋白也由細胞釋放，其細胞外功能也已經得到描述，例如，神經元存活、星形細胞增殖、凋亡的誘導和炎症過程的調控。在S100A8對十曼性炎症應答的炎症中已經發現了S100A8、S100A9、異型二聚體S100A8/A9和S100A12,而在急性炎症中S100A9、S100A8/A9和S100A12增加。S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12已經與具有炎症組分的不同的疾病相聯繫，包括某些癌症、腎移植排斥、結腸炎以及更重要的是與RA相聯繫(Burmeister,G.,和Gallacchi,G.,Inflammopharmacology3(1995)221-230;Foell,D.,等,Rheumathology42(2003)1383-1389)。用於評估RA中疾病進展的標記物組中使用的最優選的S100標記物是S100A8、S100A9、S100A8/A9異型二聚體和S100A12。sE-選擇素(可溶性內皮白細胞粘附分子-1,ELAM-1)是115kDa,I型跨膜糖蛋白，其僅在被炎症細胞因子(IL-1卩、TNF-a)或內毒素激活後在內皮細胞上表達。細胞表面E-選擇素是白細胞滾動附著於內皮-在炎症部位白細胞外滲中的必要步驟-的介質，因此在局部炎症應答中起到重要作用。在健康個體的血液中發現可溶性E-選擇素，可能來源於表面表達的分子的蛋白水解裂解。在許多疾病中已經報導了血清中水平升高的sE陽選擇素(Gearing,A丄H.,等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331)。優選地為了評估RA中疾病進展的風險用於與CRP和IL-6組合的一種或多種其它標記物是生化標記物或生物標記物。優選地生物標記物是多肽或自身抗體。由實施例部分可以明顯看出包含CRP和IL-6的標記物組會幫助評估患有RA患者疾病進展的風險。在一個進一步優選的實施方案中本發明涉及包含至少CRP和白介素-6的標記物組在評估患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險中的用途。與CRP和IL-6—起使用的一種或多種額外的標記物優選是標記物組的一部分，即適合進一步完善任何患有RA患者疾病進展風險的評估一系列標記物。在這種用於評估RA進展的標記物組中標記物的總數優19選少於20種標記物，更優選少於15種標記物，還優選少於10種標記物，8種或更少的標記物甚至是更優選的。優選的是總共包含3、4、5或6種標記物的用於評估RA中疾病進展的標記物組。進一步優選的實施方案涉及標記物組在評估患有RA患者疾病進展的風險中的用途，該組包含CRP、白介素-6和至少一種選自CartiLaps、透明質酸、E-選4奪素和ICTP的額外標記物。在一個優選的實施方案中幫助評估患有RA患者疾病進展的風險的標記物組包括CRP、白介素-6和透明質酸。在一個優選的實施方案中幫助評估患有RA患者疾病進展的風險的標記物組包括CRP、白介素-6和E-選才奪素。在一個優選的實施方案中幫助評估患有RA患者疾病進展的風險的標記物組包括CRP、白介素-6和ICTP。在一個優選的實施方案中幫助評估患有RA患者疾病進展的風險的標記物組包括CRP、白介素-6和CartiLaps。在一個進一步優選的實施方案中實施至少CRP和白介素-6測定所需的試劑以試劑盒形式提供。因此本發明也涉及包含分別特異性測定CRP和白介素-6所需的試劑，以及任選的實施測定的輔助試劑的試劑合瘋。在本發明一個優選的實施方案中，特異性結合兩種生物標記物蛋白CRP和IL-6以及任選的一種或多種其它生物標記物的試劑固定於固體載體上，例如聚苯乙烯表面。本發明一個優選的實施方案提供同時結合併定量用於評估RA中疾病進展的標記物組的蛋白微陣列或蛋白陣列裝置。蛋白陣列裝置由結合於載體材料上確定點的分子(捕獲劑)組成。優選地生物素化的特異性結合試劑作為塗布有抗生蛋白鏈菌素的固定相上非常小的點結合。然後陣列接觸樣品。例如抗體的捕獲劑能夠結合來自生物樣品的感興趣的蛋白。然後可以通過定量每個點產生的信號來監測特異性分析蛋白與個體位點的結合。在一個進一步優選的實施方案中本發明涉及用於評估患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險的包含至少合適的用於CRP和白介素-6測定的特異性結合配偶體和任選的合適的一種或多種其它標記物的特異性結合配偶體的蛋白陣列裝置。提供下列實施例和圖以幫助理解本發明，所附權利要求所述的真實範圍。應當理解可以在所述的方法中進行改變而不偏離本發明的精神。附圖簡述圖1所有RA患者進展率1的累積概率圖(x軸=累積概率％,y-軸二SharpGenant評分中的變化)圖2-5顯示單個標記物或標記物組合的箱線圖(boxplots)。組I的RA患者分為具有疾病進展的或沒有疾病進展的。特異性(每個圖中右邊的箱)設置為大約卯％(y軸上=0.9)。每個標記物或標記物組合的靈敏度顯示於中間的箱，對應的總誤差通過左邊的箱線圖輔助顯示。(箱=25化-75化四分值；須(whiskers)=1.5倍四分位差；箱中-=中位數；+顯示平均值的位置；*=落在須外的個體值)圖2CRP的箱線圖靈敏度=35%;總誤差=23%圖3IL-6的箱線圖靈敏度=35%;總誤差=25%圖4CRP+IL-6標記物組合的箱線圖靈敏度=50%;總誤差=20%圖5CRP、IL-6和pro-MMP3標記物組合的箱線圖靈敏度=53%;總誤差=20%實施例1研究人群來源於237個高度特徵的最大病程15年的RA患者的樣品收集於具有一或兩年隨訪的五個歐洲中心。根據美國風溼病學會用於類風溼性關節炎分類的1987年修訂標準，所有個體^皮診斷為RA-患者(Arnett,F.C.,等，ArthritisRh函.31(1988)315-324)。所有患者使用廣泛的病例報告表(=CRF)記錄。CRF包括健康評估問巻、SF36問巻、腫脹和觸痛關節計數、實驗室參數、相關手術的臨床史、藥物、共病(co-morbidities)和共病的藥物。在基線處由手和腳獲得X-射線，在一年和兩年後進行標準化程序。只有從RA-患者獲得的基線樣品用於不同分析物的測定，相應的結果用於單變量和多變量分析。研究人群的人口數據顯示於表1。表1tableseeoriginaldocumentpage22實施例2Sharp-Genant-評分的測定在基線處以及一年和兩年後從每個患者的四肢獲得x射線。將傳統的膠片x光照片送至Synarc(SynarcGmbH,漢堡，德國)，在那裡使用Lumiscan200高解析度數字轉換器將硬拷貝膠片數位化。在質量檢查後，由有經驗的放射科醫師讀取每個圖像並根據Genant-modifiedSharpscoring進行評分。x光照片的形態學評分根據下文描述的Genant-修改的Sharp評分方案對手和腳中骨侵蝕和關節腔狹窄進行評分。該評分方案是基於Genant-修改的Sharp評分技術。侵蝕評分基於侵蝕的大小和累及骨(關節的兩側)的面積使用8點的評分等級從0-3.5對每個手腕和手上的14個位點(4個近端指間和5個掌指關節、拇指的腕掌關節、舟骨、橈骨遠端和尺骨遠端)和每隻腳的六個關節(5個蹠趾關節和趾I(即，拇趾)的趾間關節)進行評分0(正常無侵蝕)0.5(皮質連續性的微小損失或骨侵蝕不確定的結果)1.0(輕度一個或兩個關節骨確定但低的侵蝕，通常在棵區，包括<25°/。的關節面)1.5(輕度至中度中小型侵蝕，包括<25%的一個或兩個關節骨的關節面)2.0(中度大中型侵蝕，包括大約26%-50%的兩個關節骨的關節面)2.5(中度至嚴重大約51%-75%關節面的侵蝕)3.0(嚴重大約76%-90%關節面的侵蝕)3.5(非常嚴重100%的關節面的侵蝕(關節面的完全破壞))關節腔狹窄(JSN)評分。使用9點的評分等級從0到4對每個手腕和手上的13個位點(指II-V的近端指間、拇指的指間關節和5個掌指關節、作為一個單元的指III-V的腕掌關節、關節嚢周(舟骨-頭狀骨(capitate)和月骨(lunate)-頭狀骨結合)的空間和橈腕關節)和每隻腳上六個位點(5個蹠趾關節和趾I(即，拇趾)的趾間關節)進行評分0(正常)0.5(微小的關節腔狹窄或模糊的結果)1.0(輕度關節腔狹窄(局部的或較小的))1.5(輕度至中度關節腔狹窄)2.0(中度關節腔狹窄)2.5(中度至重度關節腔狹窄)3.0(重度關節腔狹窄)3.5(重度關節腔狹窄接近關節強直)4.0(確定的關節強直)手/手腕分別總計個體關節評分以建立手和手腕的總的侵蝕評分和總的JSN評分。手和手腕最大的總的侵蝕評分是(14x3.5最大每關節)x2=98。最大的總的JSN評分是(13x4最大每關節)x2=104。為了提供侵蝕和關節腔狹窄相等的權重，每個總數標準化到0-100的評分等級。如果E-評分是總的侵蝕評分和J-評分是雙手總的JSN評分，標準化的評分如下計算標準化E-評分-(E-評分/98)xlOO,和標準化^評分=(J-評分/104)xlOO。腳對於手/手腕，分別總計個體關節評分以建立腳的總的侵蝕評分和總的JSN評分。腳的最大的總的侵蝕評分是(6x3.5最大每關節)x2=42。最大的總的JSN評分是(6x4最大每關節)"=48。為了提供侵蝕和關節腔狹窄相等的權重，每個總數標準化到0-100的評分等級。如果E-評分是總的侵蝕評分和J-評分是雙腳總的JSN評分，標準化的評分如下計算標準化E-評分(E-評分/42)x45，和標準化-評分=(J-評分/48)x45。組合手/手腕和腳的總評分是每個個體總分的總和。因此，最大可獲得的評分是290。4曼蝕評分=標準化E-評分手/手腕+標準化E-評分腳，加JSN評分=標準化J-評分手/手腕+標準化J-評分腳，加總評分H菱蝕評分+JSN評分。總評分中的變化如下計算侵蝕變化=(隨訪侵蝕評分)-(最初侵蝕評分)加JSN變化=(隨訪JSN評分)-(最初JSN評分)，加總變化=(隨訪總評分)-(最初總評分)。實施例3具有疾病進展的RA和沒有疾病進展的RA中患者的分類存在疾病進展的分類的文獻中討論的某些可能性。除了廣泛用於藥物研究中評估治療應答的ACR和EULAR標準，HAQ評分和放射學評分也可以用於疾病進展的分類。最優選的方法是在一年後使用任何放射學評分的變化。我們決定使用總的Sharp-Genant-評分和測定在基線值後一年或兩年該評分的個體變化(-進展率)。進展率(1)=從基線到1年Sharp-Genant-評分(SGS)的變化。進展率(2)=從基線到2年Sharp-Genant-評分(SGS)的變化。接下來重要的步驟是定義能夠分類具有進展的RA和沒有進展的RA中的患者的進展率的臨界值。因此繪製所有患者的進展率1或2的累積概率圖(參見圖1)(vanderHeijde等,ArthritisRhe腿.52(005)49-60)。在圖的第一個斜面上設置一條直線，在"5"的進展率(1)測定交叉點。使用進展率(2)的概率圖獲得相同的結果。使用"5"的進展率(即，每年SGS中增加超過5)作為用於將RA患者分類為具有或不具有進展的患者的臨界值通過下列兩個論證支持1.使用"5"的進展率(1)作為臨界值，該樣品群體大約20%的RA患者會分類為具有進展的RA患者。2.任何用於測定臨床結果的評分方法的值取決於其可信度。存在描述過的用於測定"變化的靈敏度"的不同方法(Boini,S.和Guillemin,F.,Ann.Rheum.Dis.60(2001)817-827)。用於個體患者分類的最好的可信度評分是最小檢測差異(SDD)。評價了用於建立SGS的放射照片的專家已經測定了SGS的5.1的SDD。這是指，大約5的SGS變化是一個患者在兩個時間點的最小差異，其可以顯著的區分。因此使用下列分類進展率(1)或(2)〉5:具有進展性疾病的RA患者進展率(1)或(2)S5:沒有進展性疾病的RA患者使用這個定義，我們完成了下列分類具有疾病進展的RA患者59個患者沒有疾病進展的RA患者178個患者實施例4測定的標記物表2代表了所用的測定法並給出了測試形式以及測定法的供應商。大多數測定法是手動微孔板(=MTP)形式ELISA。在自動Hitachi分析儀上同種測試形式中測定RF和CRP。測定血清樣品中除了CartiLaps外的所有標記物濃度，CartiLaps在尿中測定。通過肌酐結果標準化CartiLaps值。表2tableseeoriginaldocumentpage26)實施例5單變量分析使用表2所列的16種標記物測定所有237個RA患者的基線樣品。每個標記物值進行對數化並進行ROC分析。表3描繪了AUC值和每個標記物的靈敏度(在90%的特異性下)。表3:tableseeoriginaldocumentpage278種標記物獲得70%以及更高的AUC。在90%的特異性下最好的靈敏度顯示37%的CRP。非常令人驚訝的是，作為預後因子被公開的抗-CCP,顯示只有0.59的AUC。在許多科學論文中具有大約3.0或更高的優勢比的生物標記物相當樂觀地稱為進展預測因子。例如，Syve腦，S.W.等(Ann.Rheum.Dis.65,Suppl.II(2006)1IO)報導了抗-CCP(OR=4.18)、RF-IgM(OR=3.12)、ESR(OR=3.73)和女性性別(OR=3.29)是RA患者中IO年放射學進展的獨立預測因子。如果我們計算在我們的RA群體中抗-CCP的優勢比(Oddsratio)(臨界值〉5U/mL),我們獲得了相似的優勢比，即，4.6的OR。然而"4，，或"5，，的優勢比在需要高的特異性(對應低數量的假陽性結果)的臨床常規中沒有診斷價值。實施例6多變量分析由於有限數量的具有進展的RA患者，患者群體隨機化分為訓練組和試驗組是不可能的。因此進行外部交叉驗證(ECV)。對於ECV，訓練組再分50次(比例2(訓練亞組):l(試驗亞組))對於外部Monte-Carlo交叉驗證(Dudoit,S.和vanderLaan,M.J.，StatisticalMethodology2(2005)131-154)。在訓練亞組中制定分類算法並在獨立試驗亞組中驗證該算法。使用正則化判別分析(RDA)產生分類算法，正則化判別分析(RDA)是普通判別分析的一般化，即，二次和一次判別分析(McLachlan，G丄，DiscriminantAnalysisandStatisticalPatternRecognition,WileySeriesinprobabilityandmathematicalstatistics,1992)在RDA中使用通常最大似然(插件)評估協方差矩陣的替代法。這些替代法以兩個參數(x、y)為特徵，通過共同最小化未來錯分類風險的基於樣品的評估，它們的值專門用於個體情況(Friedman,J.H.,J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175)。作為可選的方法，支持向量才幾算法(SupportVectorMachinesalgorithms)(Hastie，T.，等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001)可以使用可比較的分類結果。逐步構建標記物組，從最好的用於分類問題的單個標記物開始並當總分類誤差不再顯著變化時結束。為了獲得集中分布，使用自然對數函數轉化每個單個標記物。實施例7用於評估RA患者疾病進展的風險的標記物組的鑑定多變量分析的目標是尋找顯示比最好的單個標記物更高靈敏度的標記物組。特異性極限設為90%。選擇的第一個標記物是具有35%的靈敏度的CRP,第二個標記物是將靈敏度提高至50%的IL-6。具有不同標記物的其他組合作為第三個和第四個標記物，它們能夠最小化總誤差和/或改善靈敏度(表4)。對所有這些標記物組合，最重要的兩個標記物是CRP和IL-6,從而代表這些標記物組中關4建的標記物。本發明的目的是幫助風溼病學家評估RA患者是否處於疾病進展的風險中。已鑑定的標記物組的診斷價值在表4中通過分類的總誤差得到最好的反映。CRP,目前用於炎症評估的單個生物學標記物得到0.228的總誤差。IL作為單個標記物也顯示相似的0.247的總誤差。優選的CRP和IL6的組合顯著改善分類，減少總誤差至0.203。加入第三或第四標記物最終幫助進一步最小化錯分類(總誤差0.196)。獲得的50%的靈敏度表明基於本文公開的方法大約一半的具有進展性疾病的RA患者可以通過生化標記物測定在單一時間點被正確地鑑定，即在基線，但到目前為止還不可能。期望這種分類幫助風溼病學家的決策過程，例如4吏用DMARD開始治療或^_用不同DMARD的組合變為更好的治療方案。表4分類為具有疾病進展的RA對沒有疾病進展的RA的患者的分類結果tableseeoriginaldocumentpage29表4中標記物CRP和IL-6以及標記物組合(CRPIL-6和CRP+IL-6+pro-MMP3)的箱線圓分別如圖2-5所示。權利要求1.幫助評估患有類風溼性關節炎(RA)患者疾病進展的風險的方法，該方法包括以下步驟a)獲得液體樣品，b)測定所述樣品中C-反應蛋白(CRP)和白介素-6以及任選的一種或多種其它標記物的濃度，和c)將步驟(b)中測定的濃度與疾病進展風險相關聯。2.根據權利要求l的方法，其中當實施評估時，RA患者處於選自緩解疾病的抗類風溼性藥物(DMARD)的抗風溼藥物的治療中。3.根據權利要求1的方法，其中任選的一種或多種其他標記物選自骨或軟骨標記物、滑液標記物、其他炎症標記物、遺傳標記物和放射學評分。4.根據權利要求3的方法，其中一種或多種骨或軟骨標記物選自PINP、卩-C聽Laps、CartiLaps、骨鈣素和ICTP。5.根據權利要求3的方法，其中一種或多種滑液標記物選自透明質酸和pro-MMP3。6.根據權利要求3的方法，其中一種或多種遺傳標記物選自HLA-DR4和HLA-DRB1等位基因。7.根據權利要求3的方法，其中一種或多种放射學評分選自Sharp-評分、Sharp-Genant-評分、vanderHeijde-Sharp-評分、Ratingen評分、Larsen-評分和RAU-評分。8.根據權利要求3的方法，其中一種或多種其他炎症標記物選自SAA和E-選擇素。9.包含至少CRP和白介素-6的標記物組在評價患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險中的用途。10.用於實施根據權利要求1的方法的試劑盒，所述試劑盒包含分別特異性測定CRP和白介素-6所需的試劑，以及任選的用於實施測定的輔助試劑。11.用於評估患有類風溼性關節炎的患者疾病進展的風險的蛋白陣列裝置，所述蛋白陣列裝置包含至少用於CRP和白介素-6測定的合適的特異性結合配偶體和任選的一種或多種其他標記物的合適的特異性結合配偶體。全文摘要本發明涉及幫助進一步評估患有類風溼性關節炎患者的體外方法。該方法特別用於評估RA患者是否處於疾病進展的風險中。該方法例如通過分析生化標記物實施，包括測定樣品中至少C-反應蛋白(CRP)和白介素-6的濃度並將測定的濃度與RA潛在的快速進展形式的可能性相關聯。處於快速進展疾病的高風險中的患者可以是需要治療或者如果已經治療還需要不同的和更有效治療的患者。本發明還涉及包含C-反應蛋白和白介素的標記物組在評估患有類風溼性關節炎的患者中的用途，以及教導了分別用於實施本發明方法的蛋白陣列裝置和試劑盒。文檔編號G01N33/68GK101523218SQ200780036552公開日2009年9月2日申請日期2007年9月25日優先權日2006年9月29日發明者J·卡爾,N·威爾德,V·格魯納特,W·羅林傑申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司