Ccdc72基因及其表達產物在製備診斷及治療卵巢癌製劑中的應用的製作方法

2023-09-23 15:39:40 2

專利名稱：Ccdc72基因及其表達產物在製備診斷及治療卵巢癌製劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬分子生物學特別是基因診斷領域，具體涉及一種新的腫瘤相關抗原 CCDC72基因及其表達產物和在製備診斷和治療卵巢癌製劑中的應用。
背景技術：
研究顯示，在女性生殖器官的惡性腫瘤中，卵巢癌其發病率居第三位，病死率居於首位。卵巢癌是一種形態學和生物學上均具有異質性的疾病，其分型繁多，同時其發生發展及轉移是一個涉及多基因、多信號通路調控的網絡體系。據報導，目前全世界每年約有二十萬以上的婦女飽受卵巢癌折磨。儘管已有很多研究表明，不同亞型的卵巢癌分子機制分析差異明顯，但目前臨床上仍將不同亞型的卵巢癌作為一個單一的整體診斷和治療，這無疑會降低診斷的敏感性和治療的有效性。臨床實踐顯示，卵巢癌患者普遍存在復發率高、 5年生存率低的狀況，而該疾患起病隱匿且缺乏有效準確的診斷標誌物是重要影響因素。目前臨床上診斷卵巢癌的三種主要的傳統的檢查方法，即結合臨床表現進行盆腔檢查、經陰道超聲檢查、血清檢測CA125水平各具優勢，但均存在局限性和缺陷。免疫組化染色診斷成為重要的輔助診斷方法。因此，迫切需要尋找一種能夠早期診斷卵巢癌的標誌物及有效的靶向治療方法。現有技術公開了CCDC72 (coiled-coil domain containing-72)基因，最初是從體外凝集性生長狀態下的毛乳頭細胞(DPC)中篩選並克隆出的一種造血幹細胞分化相關基因，其產物為7. 06kKD小分子可溶性蛋白。該基因在人體多種組織器官中表達，特別是一些新陳代謝旺盛的組織，如皮膚、腫瘤、淋巴組織等。這種分布特徵提示，該基因可能與細胞增殖、分化有關。目前，有關(XDC72的研究極少，其生物學功能不甚明確。迄今為止，僅有研究顯示，RNA幹擾技術使(XDC72基因在毛乳頭細胞(DPC)中的表達減弱或消失後，DPC生長速度明顯減慢，細胞失去凝集性生長特性，CCDC72重組蛋白可促進DPC的增殖及DNA合成。尚未見有關(XDC72基因在上皮性卵巢癌中的表達和功能的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的卵巢癌診斷標誌物和藥物治療靶點，具體涉及 CCDC72基因及其表達產物作為腫瘤標誌物和藥物療靶點以及基於CCDC72及其表達產物的應用。該應用比現有技術檢測省時、靈敏度與準確度更高、成本更低、和/或更高效。另外，本發明還提供了用於這些應用的試劑盒以及引物對等。具體而言，在第一方面，本發明提供了(XDC72基因及其表達產物可作為腫瘤標誌物和藥物治療靶點。本發明中I，採用免疫組織化學方法檢測(XDC72在卵巢組織中的表達，結果顯示(XDC72的表達與卵巢組織的惡性程度有關，惡性程度越高，(XDC72表達越高；(XDC72的表達與不同卵巢癌的組織學分型有關，CCDC72在黏液性腺癌中的陽性表達率為42. 4% (14/33)，明顯低於漿液性腺癌的陽性表達率96. 4% (106/110)和子宮內膜樣腺癌的陽性表達率88. 9% (56/63)，差異具有統計學意義(P < 0. 001)。2，檢測不同組織學來源的卵巢癌細胞系中(XDC72 mRNA水平，結果顯示，(XDC72 在不同的細胞系中表達具有差異性，其中漿液性腺癌細胞系普遍高表達CCDC72，尤其是 SK0V3ip細胞系。3，採用RNA幹擾技術檢測CCDC72對卵巢癌細胞凋亡的影響，結果顯示，與陰性對照組(NC)相比，siRNA-1、siRNA-2分別轉染SK0V3ip及0VCA433細胞48h，幹擾效率均可達到50%及以上，SK0V3ip細胞系的幹擾效果優於0VCA433細胞；採用Annexin V-FITC/PI染色細胞流式方法檢測(XDC72基因對細胞凋亡的作用，結果證實，siRNA-1組與siRNA_2組細胞凋亡率均明顯升高，差異具有統計學意義。4，檢測(XDC72對卵巢癌細胞周期的影響，結果顯示，與NC組相比， (XDC72siRNA-l、siRNA_2組的細胞數在G0/G1、S期增多，G2/M期降低，結果表明，幹擾 (XDC72基因後會誘導SK0V3ip細胞阻滯在G0/G1、S期，促進細胞凋亡。5，檢測CCDC72對卵巢癌細胞增殖能力的影響，結果表明，幹擾CCDC72基因在卵巢癌細胞中的表達可以抑制卵巢癌細胞的生長。6，檢測(XDC72對卵巢癌細胞信號轉導通路的影響，結果顯示，幹擾組與對照組相比，Src的表達無明顯改變，但磷酸化的Src表達明顯減弱；24h後對照組、幹擾組出現 p-Src的變化,而48h後則無明顯改變,FAK/p-FAK、Akt/p-Akt、Erkl/2/p_Erkl/2的變化與 Src/p-Src 相似。本發明的試驗結果表明，CCDC72在卵巢癌中高表達且在不同組織學類型的卵巢癌中表達不同，CCDC72可作為具有較高靈敏度與準確度的腫瘤診斷標誌物，有效地提高不同亞型卵巢癌的診斷水平。在第二方面，本發明提供了用於免疫檢測用的CCDC72檢測試劑盒、基因診斷用的螢光定量PCR試劑盒，和其他類型的診斷試劑或方法用於腫瘤、基因檢測或細胞學研究，如分子生物學試劑RT-PCR、生物晶片等；基於CCDC72的單克隆或多克隆抗體的試劑與方法 ELISA、流式細胞計數、Western-Blot等。所述試劑盒中，其包括基於(XDC72基因序列的特異性探針與引物對。試劑盒中各成分都是分離放置的。所述的的試劑盒還可以包含純化的兔抗人(XDC72單克隆抗體加生物素標記的羊抗兔二抗，加鏈親和素標記的辣根過氧化物酶與底物3，3，-二氨基聯苯胺(DAB)等成分。本發明第三方面基於上述基因功能實驗結果，CCDC72具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用，表明CCDC72可以作為卵巢癌治療的新的靶標，基於此，進一步構建RNA幹擾系統，或作為腫瘤藥物篩選的靶分子製備藥物，或構建針對該基因的基因表達調控系統等用於治療卵巢癌。本發明經實驗證實，(XDC72基因可以有效地促進卵巢癌細胞增殖、抑制癌細胞凋亡，可作為一種有效的診斷標誌物及治療的靶標基因。具體的，CCDC72基因可作為卵巢癌及其不同組織學亞型診斷的標誌基因，包括各種免疫組化診斷方法，原位雜交，RT-PCR，病理診斷及早期診斷方面的應用；CCDC72基因可作為卵巢癌癌基因治療及藥物篩選靶標的應用。本發明用於診斷具有特異性高，檢測準確性高的優點；用於腫瘤藥物篩選靶分子，具有靶標明確的優點。為了便於理解，以下將通過具體的附圖和具體實施方式
對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。


圖I顯示了(XDC72在不同類型卵巢組織中的表達情況，其中，圖IA :免疫組織化學方法檢測(XDC72在不同卵巢腫瘤中的表達；圖IB :(XDC72在卵巢癌中高表達，在不同亞型的卵巢癌中紅表達不同；圖IC :將265例不同卵巢組織分別按照年齡、手術病例分期、病理分級、良惡性腫瘤及惡性腫瘤的不同組織學亞型分類，進行統計學分析，列表。圖2顯示了 (XDC72在八株不同組織學亞型來源的卵巢癌細胞系中mRNA的表達情況，其中，細胞從左到右依次是漿液性(SK0V3ip、SK0V3、0VCA433、0VCA439)，黏液性 (RMUG-S，3A0)，子宮內膜樣(T0V112D)，透明細胞性(ES2)。(XDC72在漿液性腺癌細胞系表達普遍偏高，尤其是SK0V3ip細胞圖3顯示了(XDC72對卵巢癌細胞凋亡的作用，其中，圖3A :在SK0V3ip和0VCA433細胞中，與NC相比，siRNA有效的幹擾了 (XDC72的表達；圖3B :對3A的柱形圖和統計分析；圖3C =Annexin V/PI細胞流式凋亡實驗證實，與NC相比，(XDC72-siRNA促進了細胞的凋亡。圖4顯示了(XDC72對卵巢癌細胞的細胞周期分布的影響，其中，包括細胞流式儀對三組實驗組的細胞周期分期的分析，及數據柱形圖和統計分析。圖5顯示了(XDC72對卵巢癌細胞增殖能力的作用，其中，經CCK8實驗測定，SK0V3ip和0VCA433細胞的CCDC72 siRNA組與NC組相比，24h，48h，72h，96h後，生長速率均明顯降低。圖6顯示了(XDC72對細胞信號轉導通路的影響，其中，Western-blotting法測定，siRNA 組相比 NC 組，p_Fak、p-Src> p_Akt、 p-ErkI/2表達均減弱，且24h即出現變化。
具體實施例方式本發明將通過具體的實施例來進行示例性的說明，其中，如有未盡之處，可參見 《分子克隆實驗指南(第三版)》(科學出版社，北京)等實驗手冊以及市售的試劑和儀器的使用說明。本發明所述的(XDC72基因序列為根據Genbank登錄號NM015933. 3所示的序列。本發明所述的細胞系均為本領域公知渠道市購。實施例II)檢測(XDC72在卵巢組織中的表達情況收集離體的卵巢組織265例，其中，包括24例正常卵巢組織和241例卵巢腫瘤組織(110例漿液性腺癌，33例黏液性腺癌，63例子宮內膜樣腺癌，5例移行細胞癌，22例良性腫瘤，8例交界性上皮性腫瘤)，採用免疫組織化學方法檢測CCDC72的表達，結果顯示(XDC72的表達與卵巢組織的惡性程度有關，惡性程度越高，(XDC72表達越高；(XDC72 的表達與不同卵巢癌的組織學分型有關，(XDC72在黏液性腺癌中的陽性表達率為42. 4% (14/33)，明顯低於漿液性腺癌的陽性表達率96. 4% (106/110)和子宮內膜樣腺癌的陽性表達率88. 9% (56/63)，差異具有統計學意義(P < 0. 001)。2)檢測(XDC72在卵巢癌細胞中的表達檢測不同組織學來源的卵巢癌細胞系中(XDC72 mRNA水平，其中漿液性 SK0V3ip, SK0V3, 0VCA439, 0VCA433 ;黏液性RMUG_S，3A0 ;子宮內膜樣T0V112D ;透明細胞 ES2，結果顯示，CCDC72在不同的細胞系中表達具有差異性，其中漿液性腺癌細胞系普遍高表達(XDC72，尤其是SK0V3ip細胞系。3)檢測(XDC72對卵巢癌細胞凋亡的影響採用目前常用的基因功能研究方法的RNA幹擾技術，通過SiRNA幹擾高表達 CCDC72 的細胞系 SK0V3ip 和 0VCA433，用 Negative-control、siRNA-1、siRNA-2 分別轉染 SK0V3ip和0VCA433，24h、48h、72h後，定量real-time PCR檢測幹擾效果，結果顯示，與陰性對照組(NC)相比，siRNA-1、siRNA-2分別轉染SK0V3ip及0VCA433細胞48h，幹擾效率均可達到50%及以上，SK0V3ip細胞系的幹擾效果優於0VCA433細胞；進一步採用了 Annexin V-FITC/PI染色細胞流式方法檢測(XDC72基因對細胞凋亡的作用，結果證實，與NC相比， siRNA-1組與siRNA-2組細胞凋亡率均明顯升高，差異具有統計學意義。4)檢測(XDC72對卵巢癌細胞周期的影響用negative-control RNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2 轉染 SK0V3ip 細胞 48h小時後，收集細胞流式分析，結果顯示，與NC組相比，(XDC72 siRNA-1、siRNA-2組的細胞數在G0/G1、S期增多，G2/M期降低，結果表明，幹擾(XDC72基因後會誘導SK0V3ip細胞阻滯在G0/G1、S期，促進細胞凋亡。5)檢測(XDC72對卵巢癌細胞增殖能力的影響分別將negative control-siRNA，CCDC72 siRNA-1，CCDC72 siRNA-2 轉染入 SK0V3ip和0VCA433細胞系，接種於96孔板，5000細胞/孔，分別培養24h、48h、72h、96h 後，用CCK8法檢測細胞生長速率，結果顯示，在SK0V3ip細胞系中，陰性對照組的細胞生長速率隨著時間的延長不斷增加，而siRNA-1組的細胞數在24h、48h、72h中不斷降低，96h升高，siRNA-2組的細胞數變化趨勢與I組相似；在0VCA433細胞系中，三組實驗組的細胞數均隨著時間的延長而不斷增加，但兩組CCDC72幹擾組細胞增長速率低於陰性對照組，結果表明，幹擾CCDC72基因在卵巢癌細胞中的表達可以抑制卵巢癌細胞的生長。6)檢測CCDC72對卵巢癌細胞信號轉導通路的影響western-blotting 檢測 SK0V3ip 細胞三個實驗組 negative-control siRNA、 CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2 轉染 24h、48h 後 FAK、Src、Akt、Erkl/2 的蛋白表達，結果顯示，兩組幹擾組與NC組相比，Src的表達無明顯改變，但磷酸化的Src表達明顯減弱；24h 後NC組、siRNA-1組、siRNA-2組即出現p_Src的變化，而48h後則無明顯改變，FAK/p-FAK、 Akt/p-Akt、Erkl/2/p_Erkl/2 的變化與 Src/p-Src 相似。試驗結果表明，(XDC72在卵巢癌中高表達且在不同組織學類型的卵巢癌中表達不同，CCDC72可作為具有較高靈敏度與準確度的腫瘤診斷標誌物，CCDC72具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用，表明CCDC72可以作為卵巢癌治療的新的靶標。實施例2製備(XDC72檢測試劑盒按常規方法製備CCDC72檢測試劑盒，其中採用純化的兔抗人CCDC72單克隆抗體加生物素標記的羊抗兔二抗，再通過加鏈親和素標記的辣根過氧化物酶與底物3，3，- 二氨基聯苯胺(DAB)的顯色反應可來鑑別診斷不同病理類型的卵巢癌及不同組織學亞型的卵巢癌。實施例3製備診斷(XDC72用的螢光定量PCR試劑盒根據CCDC72核苷酸序列設計特異性探針，核苷酸全長序列或其片段通常可以用 PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得；其中對於PCR擴增法，根據公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，用cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列；重組法中，用來大批量地獲得有關序列，將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列；核酸探針與擴增的標記序列接觸，該探針優選連接到一種發色團，但可被放射標記，探針也可連接到一種結合伴侶上，如抗體或生物素，或另一種攜帶可檢測結構域的結合伴侶上。設計及合成表達siRNA (small interfering RNA)的化學片段化學合成siRNA幹擾目的基因選擇(XDC72的特定序列，分別設計negative-control RNA :sense_UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，antisense-ACGUGACACGUUCGGAGAATT ；CCDC72 siRNA-1 sense-CCUUGGCCACAGGUGGAAUTT ；antisense-AUUCCACCUGUGGCCAAGGTT ；CCDC72 siRNA-2 :sense-CCCUUUAUUUCAUCUGUAUTT ;antisense-AUACAGAUGAAAUAAAGGGTT.用Negative-control RNA、CCDC72 siRNA_l、CCDC72 siRNA-2 分別轉染 SK0V3ip和 0VCA433 細胞 24h、48h、72h 後，定量 real-time PCR 檢測 CCDC72 mRNA 表達。結果顯示，在 SK0V3ip細胞中，與陰性對照(NC)相比，siRNA-1分別降低73. I %、76. 2 %、76. 4%的CCDC72 mRNA 表達；siRNA-2 分別降低 41%,46. 2%,54. 5%的 CCDC72 mRNA 表達;在 0VCA433 細胞中，與 NC 相t匕，siRNA-1 分別降低 26. 6%,55. 2%,43. 9%的 CCDC72 mRNA 表達；siRNA-2 分別降低 46. 2%,65. 6%,47. 8%的 CCDC72 mRNA 表達；結果表明，CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2分別轉染SK0V3ip及0VCA433細胞幹擾效率均可達到50%及以上。實施例4採用(XDC72檢測試劑盒對265例樣本進行免疫組化染色，用純化的兔抗人(XDC72 單克隆抗體加生物素標記的羊抗兔二抗，再通過加鏈親和素標記的辣根過氧化物酶與底物 3，3，-二氨基聯苯胺(DAB)的顯色反應。免疫組化染色結果分析顯示，(XDC72在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤、惡性上皮性卵巢癌中的陽性表達率逐漸升高, 且在不同組織學亞型的上皮性卵巢癌中表達具有差異性，漿液性腺癌中表達最高；CCDC72 在上皮和間質的表達呈現出規律的負性相關實施例5
採用診斷CCDC72用的螢光定量PCR試劑盒檢測八種不同組織學來源的卵巢癌細胞系(漿液性SK0V3ip, SK0V3, 0VCA439, 0VCA433 ;黏液性=RMUG-S, 3A0 ;子宮內膜樣 TOVl 12D ;透明細胞ES2)中CCDC72 mRNA水平，結果顯示，CCDC72在八種卵巢癌細胞系中均有不同程度的表達，經18S內參標準化後，(XDC72mRNA的相對表達量在SK0V3ip(7. 53)中最高，其次分別為 SK0V3 (2. 2)、ES2(2. 0)、0VCA433 (0. 94)、0VCA439 (0. 54)、T0V112D (0. 5)、 3A0(0. 48)，在RMUG-S (0. 34)中最低，與黏液性來源的細胞系相比，漿液性卵巢癌細胞系高表達(XDC72，尤其是SK0V3ip細胞系，統計學分析檢測，各組間的mRNA表達差異均具有統計學意義。實施例6檢測(XDC72對卵巢癌細胞凋亡、增殖的影響採用Annexin V-FITC/PI染色細胞流式方法檢測細胞凋亡情況,其中Annexin V-/ PI-染色代表活細胞；Annexin V+/PI-染色代表早期凋亡的細胞；Annexin V+/PI+染色代表細胞晚期凋亡或壞死細胞，結果顯示，在SK0V3ip和0VCA433細胞系中，siRNA-l、siRNA_2 組與陰性對照組(NC)相比，細胞凋亡率均明顯升高，差異具有統計學意義。採用細胞流式術檢測幹擾CCDC72基因後對卵巢癌細胞SK0V3ip細胞周期分布的影響，用 negative-control RNA、CCDC72 siRNA_l、CCDC72 siRNA-2 轉染 SK0V3ip 細胞 48h 小時後，收集細胞流式分析，結果顯示，與NC組相比，(XDC72 siRNA-UsiRNA-2組的細胞數在G0/G1、S期增多，G2/M期降低，結果表明，幹擾(XDC72基因後使誘導SK0V3ip細胞阻滯在G0/G1、S期，促進細胞凋亡。細胞計數實驗(cellcounting kit_8 assay)檢測 CCDC72 基因對 SK0V3ip 和 0VCA433細胞增殖活性的影響，實驗分為三組陰性對照(NC)組、(XDC72 siRNA-1組、 (XDC72 siRNA-2組，結果顯示SK0V3ip和0VCA433細胞的兩組幹擾組與NC組相比，生長速率均明顯降低；在31(0￥31 細胞系中，NC組的細胞生長速率隨著時間的延長(24h、48h、 72h、96h)不斷增加，而幹擾組的細胞生長速率在24h、48h、72h中不斷降低，96h後升高；在 0VCA433細胞系中，三組的細胞生長速率均隨著時間的延長而不斷增加，但兩組幹擾組細胞增長速率低於陰性對照組，結果表明，幹擾CCDC72基因在卵巢癌細胞中的表達可以抑制卵巢癌細胞的生長，統計學檢驗，組間差異具有統計學意義。分別用negative-control RNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2 轉染 SK0V3ip 細胞24h、48h後，收集細胞蛋白，western-blotting檢測FAK、Src、Akt、Erkl/2的蛋白表達，結果顯示，兩組幹擾組與NC組相比，Src的表達無明顯改變，但磷酸化的Src表達明顯減弱；24h後NC組、siRNA-1組、siRNA-2組即出現p_Src的變化，而48h後則無明顯改變， FAK/p-FAK、Akt/p-Akt、Erkl/2/p_Erkl/2 的變化與 Src/p-Src 相似，結果表明，CCDC72 能通過Src/Fak、Akt、Erkl/2信號通路途徑影響卵巢癌細胞的增殖、凋亡。
權利要求
1.CCDC72基因及其表達產物在製備診斷卵巢癌製劑中的應用。
2.CCDC72基因及其表達產物在製備治療卵巢癌製劑中的應用。
3.CCDC72基因及其表達產物在製備篩選治療卵巢癌藥物中的應用。
4.用於檢測CCDC72基因及其表達產物的試劑盒，其包括基於CCDC72基因序列的特異性探針與引物對。
5.權利要求3所述的試劑盒，其還包括純化的兔抗人CCDC72單克隆抗體加生物素標記的羊抗兔二抗，加鏈親和素標記的辣根過氧化物酶與底物3，3，- 二氨基聯苯胺。
6.一種檢測腫瘤標誌物的方法,所述標誌物為CCDC72基因，其包括1)採用免疫組織化學方法檢測(XDC72基因在離體的腫瘤組織中的表達；2)檢測不同組織學來源的腫瘤細胞系中CCDC72mRNA水平；3)採用RNA幹擾技術檢測CCDC72對腫瘤細胞凋亡的影響；4)檢測CCDC72對腫瘤細胞周期的影響；5)檢測CCDC72對腫瘤細胞增殖能力的影響；6)檢測CCDC72對腫瘤細胞信號轉導通路的影響。
7.按權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的腫瘤是卵巢癌。
全文摘要
本發明屬分子生物學特別是基因診斷領域，提供一種新的卵巢癌診斷標誌物和藥物治療靶點，具體涉及CCDC72基因及其表達產物作為腫瘤標誌物和藥物療靶點以及基於CCDC72及其表達產物的應用。該應用比現有技術檢測省時、靈敏度與準確度更高、成本更低、和/或更高效。另外，本發明還提供了用於這些應用的試劑盒以及引物對等。
文檔編號C12Q1/02GK102586437SQ20121004410
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月25日 優先權日2012年2月25日
發明者俞弋, 張志剛, 徐叢劍, 李軍 申請人:復旦大學附屬婦產科醫院